NASOFARING
XIAO-JUAN PEI, TONG-TONG WU , BIN LI , XIAO-YING TIAN , ZHI LI , QING-XU YANG
KNF
LATAR BELAKANG
Peningkatan ekspresi MIF pada sel neoplastic berkaitan dekat dengan ekspresi matriks metalloproteinase-2, -9 serta metastasis limfonodi KNF yang lebih tinggi MIF juga berkontribusi terhadap angiogenesis dengan menginduksi peningkatan ekspresi IL-8 di jalur autokrin EBV-independen DJ-I merupakan protein yang dapat mempengaruhi kematian sel, proliferasi serta progresi siklus sel sehingga berikaitan erat dengan perkembangan, progresivitas serta prognosis tumor maligna DJ-I dapat mempromosi invasi serta metastasis sel tumor dan menjadi faktor prognosis yang buruk pada pasien kanker
sel tumor KNF sering menginvasi jaringan sekitar atau bermetastasis ke nodul limfatikus di stadium awal perkembangan tumor
hubungan
Cara DJ-1 dalam invasi dan metastasis KNF dan hubungannya dengan ekspresi MIF pada KNF belum sepenuhnya dipahami
Menilai pakah MIF dan DJ-I berhubungan dengan invasi tumor dan mempengaru hi hasil akhir yang buruk pada NPC
MIF
DJ-1
METODE
85 pria dan 40 wanita dengan rata-rata usia 51 tahun Semua pasien diterapi dengan radioterapi kuratif standar, dengan atau tanpa kemoterapi
125 pasien KNF primer sebelum terapi selama tahun 20042010 5 pada stadium I, 27 pada stadium II, 51 pada stadium III, dan 32 pada stadium IV 119 pasien didiagnosis UNKC dan 6 lainnya didiagnosa DNKC
Setiap
bagian dipotong dari setiap blok paraffin dan dicat dengan hematoxylin dan eosin, lalu diobservasi
Area pada blok donor untuk sampling microarray jaringan kemudian diverifikasi berdasarkan slide H&E dan ditandai
Dua inti 1,0 mm representative dihilangkan dari setiap donor dan dipindahkan ke blok paraffin respien pre-molded dengan desain orientasi. Sebagai tambahan, 6 inti dari tonsil, limfonodi dan karsinoma payudara digunakan sebagai materi kontrol.
Pemotongan serial dengan ketebalan 4 mm dipotong dari blok arrayed dan dipasang gelas slide terlapisi APES dan disimpan pada suhu 4oC untuk deteksi lebih lanjut.
Deparafinikasi dalam xylene dan direhidari dalam etanol konsitrasi kecil dan diankat dalam fosfat penyangga salin
Diinkubasi 1:100 antibodi MIF monoclonal mencit dan 1:200 poliklonal anti-human antibody DJ-I kambing selama 60 menit
Evaluasi MIF dan ekspresi DJ-I dilakukan dengan intensitas pengecatan serta area pengecatan
Skoring
Skor 0 Tidak ada pengecatan Skor 1 Pengecatan lemah Skor 2 Pengecatan sedang Skor 3 Pengecatan kuat
Dipelihara dalam media kultur Dulbeccos modified Eagle (DMEM) dengan 10% fetal calf serum (FCS) dan antibiotic (50 U/ml penisilin dan 100 ug/ml streptomisin) pada suhu 37oC dalam incubator humidifikasi dengan 5% CO2
MIF rekombinan manusia (Abnova corporation, Taiwan) dilarutkan dalam medium kultur pada eksprimen vitro.
Sel CNE-1 dan CNE-2 ditanam pada plate 6 sumur dengan densitas 2x105 sel/sumur. Sekalinya sel ini mencapai pertemuan 80%, kemudian akan diberi perlakuan baik dengan komplek spesifik siRNA atau siKOntrol (50 nM) dengan TurboFect.
Sepuluh persen FCS ditambahkan dalam waktu 4 jam setelah transfeksi, dan DMEM segar dengan 10% FBS ditambahkan setelah 24 jam.
Sel kemudian dikumpulkan dalam waktu 48 jam setelah transfeksi untuk menilai kadar protein DJ-1 dengan blot Western dan assay fungsional lainnya yang dicatat pada bagian berikutnya.
Medium dirubah menjadi DMEM dengan 1% FCS dan diberi perlakuan dengan konsentrasi final 25 ng/ml MIF selama 48 jam
Deteksi dengan antibody sekunder terkonjugasi peroksidase dan ditambahkan reagen chemiluminesence dari Amersham
Densitas optikal relatif (ROD, rasio terhadap Actin) dari masing-masing pita blot dihitung dengan NIF software
Pengecatan imunofluoresens
Sel CNE-1 dan CNE2 ditempatkan pada slip penutup
PBS yang mengandung susu skim 5% selama 1 jam pada suhu ruangan
Sel kemudian diinkubasi dengan anti-MIF atau antibody anti-DJ-1 selama 1 jam pada suhu ruangan, diikuti dengan inkubasi menggunakan IgG/Cy3 selama 1 jam dan dicat dengan DAPI.
Analisis statistic
Uji chi-kuadrat digunakan untuk menilai ekspresi MIF dan DJ-1.
Kurva ketahanan hidup pasien ditentukan dengan metode Kaplan-Meier dan regresi Cox, serta evaluasi stastitik dilakukan menggnakan uji log-rank.
Data dianalisis menggunakan analisis variasi satu arah (ANOVA) dengan uji post
hoc Dunett;s dan uji post hoc Turkey untuk perbandingan multi kelompok
HASIL
Ekspresi MIF dan DJ-1 pada jaringan nasofaring normal dan NPC
Pengecatan MIF dan DJ-1 menyebar kuat pada sel tumor, dimana pada epitel nasofaring normal lebih lemah dan jarang
Perbedaan yang jelas pada tingkat ekspresi DJ-1 atau MIF ditunjukan antara jaringan npc dan normal (keduanya bernilai P<0,001)
Tingginya ekspresi MIF secara jelas berkaitan dengan stadium klinis yang berat (stadium III dan IV) (P=0,002) dan metastasis limfonodi (P=0,006).
75,2% (94/125) NPC dinilai dengan tingginya ekspresi DJ-1, dan hanya metastasis limfonodi yang diteliti berkaitan dengan tingginya ekspresi DJ-1 (P=0,002). Tidak ada hubungan yang signifikan antara keseluruhan ekspresi DJ-1 dengan umur pasien, gender, serta stadium tumor. Namun, tingginya ekspresi DJ-1 menunjukan eratnya hubungan dengan tingginya ekspresi MIF pada sel tumor
Tingginya ekspresi MIF, tetapi bukan DJ-1 berkaitan dengan prognosis buruk pada pasien NPC
Status nodus limfatikus dan kadar ekspresi MIF secara signifikan mempengaruhi tingkat ketahanan hidup
Pada analisis multivariate, secara keseluruhan tingkat ketahanan hidup bergantung pada metastasis nodus limfatikus, stadium klinis serta kadar ekspresi MIF pada sel tumor. Ekspresi DJ-1 tidak berkaitan dengan tingkat ketahanan hidup pasien
Migrasi sel NPC yang diberi perlakuan MIF jelas meningkat dibandingkan dengan yang sel NPC tidak diberi terapi.
Jumlah sel yang melalui ruang membrane pada uji invasi sel juga jelas meningkat pada sel yang diberi perlakuan MIF.
Namun, si DJ-1 transfeksi sel NPC menunjukan migrasi dan kemampuan invasi yang lebih rendah dibandingkan transfeksi si kontrol tanpa adanya perlakuan MIF
Hasil ini mengindikasikan baik MIF eksogenus dan DJ-1 tanpa perlakuan MIF berefek pada migrasi dan invasi sel NPC.
Keterangan gambar
Tingginya ekspresi MIF ditunjukan di bawah kekuatan yang lebih rendah pada bagian microarray.
Pengecatan sitoplasma yang lemah untuk MIF pada garis epitel nasofaring.
Tingginya ekspresi DJ-1 menunjukan sinyal pengecatan imuno yang positif terlokalisasi di sitoplasma sel tumor.
Pengecatan DJ-I pada epitel nasofaring normal lebih lemah dan local.
Analisis ketahanan hidup dengan Kaplan-Meier, pasien dengan metastasis limfe memilki tingkat ketahanan hidup yang lebih rendah daripada yang tanpa metastasis limfe. Ada perbedaan tingkat ketahanan hidup yang signifikan antara pasien dengan ekspresi MIF tinggi dan rendah. (a: Pengecatan imunohistokimiawi dengan perbesaran original, 100x; b-d: pengecatan imunohistokemikal dengan perbesaran original,, 400x)
Keterangan gambar
Gambaran mikroskopis optic pada penyembuhan luka in vitro di jam ke 0, 12 dan 36 setelah dibuat luka pada sel NPC. Penurunan migrasi sel pada sel CNE-2 NPC oleh si DJ-1 diteliti. Namun, perlakuan MIF eksogen pada sel NPC menunjukan penutupan luka yang jelas lebih cepat pada semua waktu
Pada uji invasi menggunakan kamar Transwell, dihitung sel yang melalui pori membrane 8-um dan mencapai permukaan dasar hampir sama pada kelompok sel NPC yang tidak terapi dan ditransfeksi si Kontrol. Namun pada si DJ-1 transfeksi CNE-2 sel NPC, sel yang melalui jelas menurun. Perlakuan MIF sel CNE-2 menunjukan peningkatan kemampuan invasive yang meningkat.
) Jumlah sel dievaluasi pada CNE-1 dan CNE-2 sel NPC dengan atau tanpa perlakuan. *, Perbedaan yang signifikan pada jumlah sel dibandingkan dengan sel yang tidak diberi perlakuan atau transfeksi si Kontrol.
Tabel 1. Hubungan antara ekspresi protein dan parameter klinikopatologis pada pasien NPC.
Tabel 2. Model regresi Cox untuk analisis multivariate faktor prognostic NPC.
Gambar 3. Ekspresi MIF dan DJ-1 pada sel NPC in vitro. Uji imunofluoresnsi menunjukan bahwa ekspresi protein DJ-1 jelas menurun pada sel NPC CNE-1 dengan transfeksi si DJ-1 bila dibandingkan dengan sel yang tidak diterapi atau transfeksi siRNA kontrol. Namun, kadar ekspresi DJ-1 diteliti untuk meningkatkan sel NPC yang diberi perlakuan MIF. Kadar ekspresi MIF stabil pada sel CNE-1 NPC dibandingkan yang diberi perlakuan. (Pengecatan imunofluoresen dengan perbesaran original, 400x).
MIF mengubah ekspresi DJ-I dan kadar pAkt pada sel NPC in vitro
MIF dan DJ-I dapat dideteksi di sitoplasma sel NPC CNE-1 dan CNE-2 dengan pengecatan imnofluoresen
Setelah diberi perlakuan MIF selama 48 jam, kadar protein DJ-1 sel NPC secara jelas meningkat dibandingkan yang tidak diberi perlakuan MIF (gambar 3).
DJ-1 tanpa ekspresi MIF menurunkan fosforilasi Akt, tetapi bukan total Akt pada sel NPC, hal ini mengindikasikan baik MIF dan DJ-I dapat mengerahkan pengaruhnya ke NPC melalui jalur Akt.
DISKUSI
Hasil dari hubungan antara tingginya ekspresi MIF dan metastasis nodus limfatikus
Mengindikasikan bahwa MIF dapat menjadi mediator yang mungkin berkontribusi terhadap penyebaran metastasis nodus limfatikus secara luas
Tingginya ekspresi MIF berhubungan kuat dengan rendahnya tingkat bertahan hidup pada pasien NPC baik melalui hasil analisis univariat maupun analisis multivariate Hasil ini mengindikasikan bahwa MIF saja dapat menjadi faktor prognosis independen utnuk pasien dengan NPC
Tingginya ekspresi MIF merupakan penanda yang berguna untuk memprediksi prognosis tumor
Pada penelitian ini, perlakuan MIF eksogen menghasilkan peningkatan migrasi sel dan nivasi sel NPC in vitro yang signifikan.
Hal ini memperkirakan bahwa MIF kemungkinan merupakan mediator local melalui regulator jalur autokrin atau parakrin untuk meningkatkan invasi sel.
Gambar 4. MIF dan DJ-1 meregulasi ekspresi Akt. (a) Assay Western blot menunjukan bahwa ekspresi DJ-1 dan pAkt pada CNE-1 sel NPC jelas menurun dengan perlakuan si-DJ-1. Namun, setelah perlakuan MIF, CNE-1 sel NPC menunjukan peningkatan DJ-1 dan pAkt. (b) dan (c) menunjukan adanya perubahan ekspresi pada DJ-1 dan pAkt pada sel CNE-1 dan CNE-2. *, Perbedaan yang signifikan pada kadar ekspresi dibandingkan dengan yang tidak diberi perlakuan atau sel transfeksi si Kontrol
Tingginya ekspresi DJ-1 tidak mengindikasikan beratnya stadium klinis pasien, dan tidak disangka, kami tidak menemukan hubungan antara ekspresi DJ-1 dengan prognosis NPC
Namun, Kami memperkirakan bahwa relevansi DJ-1 pada NPC mungkin terbatas dan local butuh penelitian lebih lanjut.
Ditemukan bahwa tingginya ekspresi DJ1 pada NPC jelas berkaitan dengan tingginya ekspresi MIF.
Dapat disimpulkan bahwa ada interaksi potensial antara MIF dan DJ-1 pada sel tumor, tetapi mekanisme yang jelas keterlibatan ini masih harus diteliti lebih lanjut.
Tingginya ekspresi MIF dan DJ-1 dapat berhubungan dengan metastasis limfe pada NPC
Namun, status ekspresi molekuler tunggal pada tumor mungkin tidak dapat menjadi faktor independen yang kuat sebagai prediksi prognosis pasien NPC.
MIF dan DJ-1 menunjukan ekspresi yang tinggi pada sel tumor dibandingkan pada garis epitel nasofaring normal.
Mengurangi ekspresi MIF atau DJ-1 pada tumor dapat menjadi strategi yang menjadjikan untuk pengembangan pendekatan terapi terbaru dalam menangani tumor maligna ini.