DASAR TEORI

ISOLASI DNA
Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas DNA
itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting
dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik
makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel
akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-
fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk.
2004: 221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme
prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai
DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot
terletak dalam sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan
Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat
oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa
struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai
polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai
berorientasi dari ujung 5 ke 3 sedangkan yang lain berorientasi ujung 3 ke 5. Ujung 5
merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3 berakhir dengan gugus
OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkankedua basa
nitrogen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula
pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atomoksigen.
Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi
menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dan
sitosin. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut
dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-
fungsi tersebut adalah:
Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup,
Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan
molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi
DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.
DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan
padamitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat
berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein
histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA juga dijumpai pada organisme
prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid.
Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsikehidupan bakteri, tetapi
penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalamlokasi hidupnya. Kebanyakan
plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai
titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diritanpa pengaturan dari DNA
kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi.Isolasi DNA
merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yangmempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringanakan berada pada bagian atas tabung.Hasil
sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian
atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah
yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponendari campuran.Terdapat sejumlah
tujuan dari isolasi DNA, antara lain:
Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik
Hibridisasi Southern
Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,
Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan
DNA secara in vitro melalui teknik PCR.
Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan
kualitasDNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut:
Kemurnian
Panjang DNA
Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim
Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab
itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud
penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.


Isolasi DNA pada Tanaman
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ
tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya
terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi danekstraksi
DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman
khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang
ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan
enzim penghambat-polisakarida. Sebagai contoh dari isolasi DNA tanaman adalah isolasi
DNA tanaman pisang. Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang
adalah penggerusan atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair.
Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami
kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur.
Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran
sel dan membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan
nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak. Kemudian dilakukan
inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60C selama 60 menit. Hal ini dilakukan untuk
optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan
10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4C. Hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan
komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa
supernatan berwarna hijau sedangkan pelet berwarna putih kehijauan. Supernatan yang telah
diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan Phenol : Chloroform :
Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan.
Polimerase Chain Reaction (PCR), tujuannya adalah membuat tiruan DNA berlipat
ganda secara in vitro. Pada saat PCR terjadi peristiwa denaturasi, annealing, dan
extention. Pada saat denaturasi, rantai ganda DNA dibuka dengan memberi suhu yang
tinggi. Nilai temperaturnya berbanding lurus dengan jumlah ikatan G dan C (Guanin-
Cytosin). Tahap kedua adalah annealing, yaitu menempelkan primer pada DNA untuk
amplifikasi. Pada tahap ini dibutuhkan suhu yang lebih rendah agar primer bisa menempel
pada rantai DNA. Pada tahap extention, suhu yang diperlukan adalah 72
o
C. Setelah itu,
sampel dimasukkan pada mesin PCR dan dilakukan amplifikasi dengan kondisi sebagai
berikut.
Pre Heat 95 C : 5
Denaturasi 95 C : 1
Annealing 35 C : 1
Extention 72 C : 2
Extra Extention 72 C : 10
Agarose gel elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan
DNA berdasarkan besar molekul. Pemisahan molekul terjadi melalui pergerakan asam
nukleat yang negatively charged yang menembus matriks agarose dalam tank
elektroforesis. Molekul dengan berat molekul lebih rendah akan bergerak lebih cepat.
Setelah pembuatan gel elektroforesis, DNA dapat segera dirunning tetapi sebelumnya
perlu diberi loading buffer (Bromophenol blue) untuk memberikan berat sampel dan
sebagai penanda sampai kapan elektroforesis bisa dihentikan.
Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul
lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA
bebas kontaminan. Setelah pencampuran, homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi
homogenasi. Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan
kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4C. Hasil yang didapatkan adalah
supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan
tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian diambil supernatan
pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform : Isoamyl Alkohol untuk
presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi. Untuk
memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau
buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14M NaCl) steril, Fenol
: Chloroform : Isoamyl Alkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform : Isoamilalkohol (PCI) = 24 :
1, 7.5 M Ammonium acetate, Etanol Absolut, Etanol 70 %,TE Buffer pH 8. EDTA
merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-
positif seperti Ca
2+
dan Mg
2+
sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan
terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat. Pada prosedur ekstraksi yang
telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein.
Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut didalam pelarut
organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan
menggunakan etanol. Hal ini berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Sebab apabila
fenol-kloroform masih berada didalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja
enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Hasil yang
didapatkan dari presipitasi CI akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf,
kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium
nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya
diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan
inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi. CTAB memiliki fungsi yang sama
seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari membran sel. SDS adalah sejenis
deterjen yang mampu mengemulsi lipid. Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol
absolut dan amonium nitrat dan diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi
kembali untuk mendapatkan pelet DNA. Setelah supernatan dibuang, selanjutnya
ditambahkan etanol 70% untuk presipitasi lanjutan. Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai
didapatkan pelet DNA. Pelet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan. Gambar di
bawah merupakan cara isolasi DNA pada bibit gandum.

Isolasi DNA pada Darah
Isolasi DNA tak hanya bisa dilakukan untuk tanaman atau buah-buahan saja, tapi juga
bisa dari darah, berikut cara kerjanya :

Tahap-tahap utama dalam isolasi DNA darah adalah:
Menghancurkan membran sel.
Disosiasi protein sel.
Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya.Darah merupakan jaringan ikat
khusus yang mempunyai elemen-elemen berupa seldarah, trombosit, dan substansi
interseluler cair, yaitu plasma darah.

ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat
digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA
yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya
maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak
molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula
pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait
dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan :
e = q
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan
listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,
danmemurnikan fragmen DNA.
Jenis Elektroforesis
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagaifase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem
pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut,
luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,
viskositas, dan adsorpsi vitas zat terlarut.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA,RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik . Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel
yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya
dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat
berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan
gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan
ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar
dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang
sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur
(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub
listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju
elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai,
dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat.
Etidium bromida, perak , atau pewarnan "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan
untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah
"diwarnai" dengan etidium bromida), gel difotodi bawah sinar ultraviolet. Jika molekul
sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada
lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur
merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita- pita yang berjarak sama dari sumur
gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-
molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran
molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul
dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel
dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel
untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul.


Perangkat elektroforensis gel


Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR
menggunakan primer mikrosatelit. Berkas
(band) mendatar merupakan sekumpulan
DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan
kecepatan berbeda. Semakin pendek DNA
semakin cepat bergerak.



DAFTAR PUSTAKA



http://biologi.blogsome.com/2009/11/02/isolasi-dna/
http://www.macnature.com/2010/02/isolasi-dna-referensiterpercaya.html
http://www.biotech.wisc.edu/Outreach/posterhandoutcollection/dnaextractionhandout.jpg
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif http://isolasidna.blo
gspot.com/
http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesishttp://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis_gel
http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular
http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods
http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html
http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html
http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2086857-isolasi-dna-pcr-dan-
agarose/#ixzz2DEoeH999