ENZIM (SIFAT SIFAT UMUM)

Kontribusi : Wheny
BAB I
PENDAU!UAN
"#" !$t$r Be%$&$n'
Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses
dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai
determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik,
enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan
makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh
(building blocks) perakitan building blocks tersebut men!adi protein, membran sel,
serta "#$ yang mengkodekan informasi genetik dan akhirnya penggunaan energi
untuk menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya ker!a
enzim-enzim yang terkoordinasi secara cermat. Sementara dalam keadaan sehat
semua proses fisiologis akan berlangsung dalam cara yang tersusun rapi serta teratur
dan homeostatis tetap dipertahankan, homeostatis dapat mengalami gangguan berat
pada keadaan patologis. Sebagai contoh, cedera !aringan hebat yang mencirikan
penyakit sirosis hepatis dapat menimbulkan gangguan berat pada kemampuan sel
membentuk enzim-enzim yang mengatalisis berbagai proses metabolisme penting
seperti sintesis ureum. %etidakmampuan mengubah ammonia yang toksik men!adi
ureum yang nontoksik sebagai akibat dari penyakit tersebut akan diikuti dengan
intoksikasi ammonia, dan akhirnya koma hepatikum. Suatu spektrum penyakit genetik
langka tetapi yang sering sangat menurunkan keadaan umum penderitanya dan kerap
fatal, memberi contoh-contoh tambahan dramatis tentang konsekuensi fisiologis
drastis yang dapat menyertai gangguan terhadap akti&itas bahkan hanya satu enzim.
'enyusul suatu cedera !aringan berat (misal, infark !antung atau paru, cedera
remuk pada anggota gerak) atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali (misal,
karsinoma prostat), enzim yang mungkin khas bagi !aringan tertentu akan dilepas ke
dalam darah. "engan demikian, pengukuran terhadap enzim intrasel ini didalam
(
serum dapat memberikan informasi diagnostik dan prognostic yang tidak ternilai bagi
dokter.
"#( )u*us$n M$s$%$h
)erdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan beberapa
permasalahan sebagai berikut*
() %lasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.
+) Enzim memerlukan koenzim.
,) Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi,
mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.
-) Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik
"#+ Tu,u$n
)erdasarkan rumusam masalah maka makala ini bertu!uan sebagai berikut*
() 'engetahui %lasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.
+) 'engetahui bahwa Enzim memerlukan koenzim.
,) 'engetahui Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur,
fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.
-) 'engetahui Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik
+
BAB II
PEMBAASAN
(#" ENZIM DIK!ASIFIKASIKAN BE)DASA)KAN TIPE DAN
MEKANISME )EAKSI
Satu abad lalu, baru ada beberapa enzim yang dikenal dan kebanyakan di
antaranya mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan ko&alen. Semua enzim ini diidentifikasi
dengan penambahan akhiran .ase pada nama substansi atau substrat yang
dihidrolisisnya. /adi, %i-$se menghidrolisis lemak (0unani lipos), $*i%$se
menghidrolisis pati (0unani amylon), dan -rote$se menghidrolisis protein. 'eskipun
banyak sisa peristilahan ini masih tetap bertahan sampai sekarang, pemakaiannya
sudah terbukti tidak memadai ketika ditemukan berbagai enzim yang mengatalisis
reaksi yang berbeda terhadap substrat yang sama, misal, oksidasi atau reduksi
terhadap fungsi alcohol suatu gula. Sementara akhiran -ase tetap digunakan, nama
enzim yang ada sekarang ini lebih menekankan pada tipe reaksi yang dikatalisisnya.
Sebagai contoh, enzim dehidrogenase mengatalisis pengeluaran hidrogen, sementara
enzim transferase mengatalisis reaksi pemindahan gugus. "engan semakin banyaknya
enzim yang ditemukan, ketidak!elasan !uga semakin tak terelakkan, dan kerap kali
tidak !elas enzim mana yang tengah dibicarakan oleh seorang penyelidik. 1ntuk
mngatasi permasalahan ini, International Union of Biochemistry (21)) telah
mengadopsi sebuah sistem yang kompleks tetapi tidak meragukan bagi peristilahan
enzim yang didasarkan pada mekanisme reaksi. 'eskipun ke!elasan dan pengurangan
keraguan tersebut membuat sistem nomenklatur 21) dipakai untuk u!ian riset, nama
yang lebih pendek tetapi kurang begitu !elas tetap digunakan dalam buku a!ar dan
laboratorium klinik. %arena alasan tersebut, sistem 21) hanya disampaikan secara
sepintas.
() 3eksi dan enzim yang mengatalisis reaksi tersebut membentuk enem kelas,
masing-masing mempunyai --(, subkelas.
+) #ama enzim terdiri atas + bagian. #ama pertama menun!ukkan substrat.
#ama kedua, yang berakhir dengan akhiran .ase, menyatakan tipe reaksi yang
dikatalisis.
,) 2nformasi tambahan, bila diperlukan untuk men!elaskan reaksi, dapat
dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir misal, enzim yang mengatalisis
,
reaksi 4-malat 5 #$"
5
piru&at 5 67
+
5 #$"8 5 8
5
diberi nama (.(.(.,9 4-
malat* #$"
5
oksidoreduktase (dekarboksilasi).
-) Setiap enzim mempunyai nomor kode (E6) yang mencirikan tipe reaksi ke
dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga).
"igit keempat adalah untuk enzim spesifik. /adi, E6 +.9.(.( menyatakan kelas +
(transferase), subkelas 9 (transfer fosfat), subsubkelas ( (alcohol merupakan aseptor
fosfat). "igit terakhir menyatakan heksokinase atau $:P* "-heksosa ;-
fosfotrasferase, sebuah enzim yang mengatalisis pemindahan fosfat dari $:P ke
gugus hidroksil pada atom karbon keenam molekul glukosa.
(#( ENZIM MEME)!UKAN K.ENZIM
)anyak enzim yang megatalisis proses pemindahan gugus dan reaksi lain
memerlukan, di samping substratnya, sebuah molekul organik sekunder yang dikenal
sebagai koenzim karena tanpa koenzim, enzim tersebut tidak aktif. %oenzim akan
memperbesar kemampuan katalitik sebuah enzim sehingga men!adi !auh melebihi
kemampuan yang ditawarkan hanya oleh gugus fungsional asam aminonya, yang
menyusun massa enzim tersebut. %oenzim yang berikatan secara erat dengan enzim
lewat ikatan ko&alen atau gaya nonko&alen kerap kali disebut sebagai 'u'us
-rosteti&.. %oenzim yang mampu berdifusi secara bebas umumnya berfungsi sebagai
unsur pembawa (yang didaur ulang secara kontinu) hydrogen (<$"8), hidrida
(#$"8 dan #$"P8), atau unit-unit kimia seperti gugus asil (koenzim $) atau gugus
metil (folat), membawanya bolak-balik antara tempat pembentukannya dan
pemakaiannya. 7leh karena itu, koenzim yang disebut belakangan ini dapat dianggap
sebagai substrat sekunder.
/enis-!enis enzim yang membutuhkan koenzim adalah enzim yang mengatalisis
reaksi oksidoreduksi, pemindahan gugus serta isomerisasi, dan reaksi yang
membentuk ikatan ko&alen (kelas 21) (,+,=, dan ;). 3eaksi lisis, termasuk reaksi
hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim-enzim pencernaan, tidak memerlukan koenzim.
(#(#" Koen/i* D$-$t 0i$n''$- Seb$'$i Subtr$t Se&un0er
1ntuk dua laasan penting, akan sering kali membantu untuk menganggap
koenzim sebagai substrat sekunder. $lasan pertama, perubahan kimia di dalam
koenzim ter!adi tepat mengimbangi perubahan kimia yang berlangsung di dalam
-
substrat. Sebagai contoh, dalam reaksi oksideruduksi, !ika satu molekul substrat
dioksidasi, satu molekul koenzim akan direduksi.
$alsan kedua untuk memberi koenzim penghargaan yang sama adalah bahwa
aspek reaksi ini mungkin mempunyai makna fisiologik mendasar yang lebih besar.
Sebagai contoh, peran penting kmampuan otot yang beker!a secara anaerob untuk
mengubah piru&at men!adi laktat tidak terletak pada piru&at ataupun laktat. 3eaksi
tersebut semata-mata bertu!uan mengoksidasi koenzin #$"8 yang tereduksi men!adi
#$"
5
. :anpa #$"
5
glikolisis tidak dapat berlan!ut dan sintesis $:P $naerob (dan
dengan demikian, akti&itas ker!annya) akan terhenti. "i bawah keadaan anaerob,
reduksi piru&at men!adi laktat menghasilkan oksidasi ulang #$"8 dan memunkinkan
sintesis $:P. 3eaksi lain dapat melakukan funsi ini sama baiknya. Sebagai contoh
pada bakteri atau ragi yang tumbuh secara anaerob, metabolit yang berasal dari
piru&at bertindak secara oksidan bagi #$"8 dan mereka sendiri berada dalam
keadaan tereduksi.
78 7
68 7 6 7
8,6 6 8,6 6
2-4aktat Piru&at
#$"
5
#$"8 5 8
5
1$*b$r : NAD
2
be&er,$ seb$'$i &osubstr$t 0$%$* re$&si %$&t$t hi0ro'en$se#
=
:abel . 'ekanisme bagi regenerasi $naerob #$"
5
7ksidan Produk :ereduksi )entuk %ehidupan
Piru&at
$setaldehid
"ihidroksiasoton fosfat
<ruktosa
4aktat
Etanol
->liserofosfat
'atinol
7tot, bakteri laktat, ragi
(yeast) Eschrichia coli
bakteri heterolaktat
(#(#( Fun'si Koen/i* seb$'$i )e$'ensi$ Pe*in0$h 1u'us
:ipe reaksi biokimia pemindahan gugus
" . > 5 $ $ . > 5 "
0ang memindahkan gugus molekul fungsional (>) dari molekul donor ("->)
kepada sebuah molekul aseptor akhir (misal, reaksi dahidrogenasi) atau sebagai
pembawa gugus intermediet (misal, reksi transaminasi). "iagram berikut melukiskan
konsep yang disebut terakhir ini.
" . 8 %oE $ . 8
" %oE - 8 $
'eskipun diagram ini mengesankan pembentukan hanya satu kompleks %oE->
tunggal saat berlangsungnya seluruh reaksi, sebenarnya ada berbagai kompleks
intermediet %oE-> yang dapat terlibat dalam suatu reaksi tertentu (misal,
transaminasi).
/ika gugus yang dipindahkan merupakan hydrogen, adalah biasa untuk
menggambarkan hanya ?separuh reaksi@ di sebelah kiri*
" . 8 %oE
" %oE - 8
;
)ahwa hal ini sebenarnya merepresentasikan hanya suatu kasus khusus dari
pemindahan gugus yang biasa dapat paling mudah dipahami dalam pengertian reksi
yang berlangsung di dalam sel utuh.
(#(#+ Koen/i* D$-$t Di&%$si3i&$si&$n Menurut 1u'us y$n' Pe*in0$h$nny$
Di-er*u0$h o%eh Koen/i* tersebut
)erdasarkan konsep di atas, kita dapat mengklasifikasikan koenzim sebagai
berikut*
1ntuk pemindahan gugus bukan hydrogen*
>ula fosfat
%o$-S8
:iamin pirofosfat
Piridoksal fosfat
%oenzim folat
)iotin
%oenzim kobamida ()
(+
)
$sam lipoat
1ntuk pemindahan hidrogen*
#$"
5
, #$"P
5
<'#, <$"
$sam lipoat
%oenzim A
(#(#4 B$ny$& Koen/i* Meru-$&$n Deri5$t 6it$*in B 0$n Deri5$t A0enosin
Mono3os3$t
Bitamin ) membentuk bagian dalam struktur banyak koenzim. Bitamin )
ni&otin$*i0$7 ti$*in7 ribo3%$3in dan $s$* -$ntoten$t merupakan unsur esensial
yang membentuk koenzim bagi oksidasi serta reduksi biologik, dan koenzim
&ob$*i0$ serta $s$* 3o%$t berfungsi dalam metabolisme satu karbon. )anyak
koenzim mengandung adenin, ribose, serta fosfat, dan merupakan dari&at adenosin
monofosfat ($'P). 6ontoh-contohnya mencakup #$"
5
dan #$"P
5
.
9
(#+ ENZIM MEN1ATA!ISIS )EAKSI SPESIFIK ATAU )EAKSI TIPE
%esanggupan enzim mengatalisis satu reaksi spesifik dan pada hakikatnya tidak
mengatalisis reaksi yang lain mungkin merupakan sifat enzim yang paling signifikan.
4a!u proses metabolisme karenanya dapat diatur oleh perubahan dalam efisiensi
katalitik enzim spesifik. )anyak enzim mengatalisis !enis reaksi yang sama
(pemindahan fosfat, reduksi-oksidasi, dl) dengan hanya se!umlah kecil substrat yang
secara structural berhubungan, kendati sering pada kecepatan reaksi yang secara
bermakna lebih rendah. )erbagai reaksi dengan substrat alternatif ini cenderung
ter!adi kalau substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. 'eskipun kadar
sedemikian !arang ditemukan di dalam sel hidup, kadar ini dapat diciptakan di
laboratorium. "isini, substrat alami dan sintetik alternatif digunakan untuk
memfasilitasi pendeteksian enzim dan penelitian mengenai mekanisme katalitiknya.
1$*b$r : Pelekatan tiga titik sebuah substrat ke tapak . aktif enzim yang berbentuk
planar
(#+#" En/i* Me*-er%ih$t&$n S-esi3isit$s .-tis
%ecuali enzim epimerase (rasemase) yang mengatalisis interkon&ersi isomer
optis, umumnya semua enzim akan memperlihatkan spesifisitas optis absolut untuk
paling tidak suatu porsi molekul substrat. "engan demikian, enzim dari lintasan
glikolisis dan oksidasi langsung akan mengatalisis interkon&ersi gulafosfat-" tetapi
tidak gulafosfat-4. "engan beberapa pengecualian (misal, enzim "-asam amino
oksidase pada gin!al), kebanyakan enzim mamalia beker!a pada isomer-4 asam
amino.
Spesifisitas optis dapat meluas hingga satu porsi tertentu atau hingga
keseluruhan melekul substrat tersebut. Enzim glikosidase menggambarkan kedua
u!ung ekstrem. Enzim ini mengatalisis hidrilisis ikatan glikosida antara gula dan
C
alcohol, bersifat sangat spesifik untuk bagian gula serta untuk ikatan ( atau ), tetapi
relatif nonspesifik untuk aglikon (porsi alcohol).
(#+#( En/i* Bersi3$t S-esi3i& b$'i Ti-e )e$&si y$n' Di&$t$%isisny$
Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) beker!a pada kelompok kimia khusus,
misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan
esterase pada senyawa-senyawa ester. )erbagai substrat peptida yang berbeda dapat
diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi !umlah enzim pencernaan yang
seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis
senyawa ester. Penggunaan ester sebagai substrat untuk sintesis telah mempermudah
penelitian terhadap mekanisme ker!a enzim protease.
Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Enzim
kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida pada reaksi ini, gugus karboksil berasal
dari asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, atau triptofan. Enzim karboksipeptidase
dan aminopeptidase melepas asam-asam amino satu persatu, masing-masing secara
berturutan, dari u!ung terminal karboksil atau terminal amino rantai polipeptida.
'eskipun beberapa enzim oksidoreduktase memanfaatkan #$"
5
dan #$"P
5
sebagai akseptor elektronnya, kebanyakan hanya menggunakan salah satu di
antaranya. Secara umum, enzim oksidoreduktase yang berfungsi dalam proses
biosintesis sistem-sistem mamalia (misal, sintesis asam lemak atau sterol)
menggunakan #$"P8 sebagai reduktan sementara enzim yang berfungsi dalam
proses penguraian (misal, glikolisis, oksidasi asam lemak) menggunakan #$"
5
sebagai oksidan.
(#4 AKTI6ITAS KATA!ITIS 8AN1 DIMI!IKI ENZIM MEMFASI!ITASI
PENDETEKSIAN ENZIM TE)SEBUT
/umlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di
dalam ekstrak !aringan atau cairan. 1ntungnya, akti&itas katalitis yang dimiliki enzim
dapat men!adi sarana pemeriksaan yang sensiti&e dan spesifik bagi pengukuran kadar
enzim itu sendiri. %emampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau
bahkan lebih molekul substat men!adi produk dalam periode waktu yang singkat
memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi
menguatkan keberadaannya.
D
1ntuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak !aringan atau
cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel
tersebut harus ditentukan. "alam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan
reaksi harus sebanding dengan !umlah enzim yang ada. %arena !umlah molekul atau
massa enzim yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam
unit en/i*.. /umlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat
dibandingkan. International Union of Biocemistry mengartikan satu unit akti&itas
enzim sebagai ( mikromol (( mol (E
-;
) substrat yang bereaksi atau produk yang
ditransformasikan per menit.
(#4#" K$0$r Dehi0ro'en$se Ter'$ntun'9NAD
2
Diu&ur -$0$ +4: n*
"alam reaksi yang melibatkan #$"
5
atau #$"P
5
(enzim-enzim
dehidrogenase), sifat #$"8 atau #$"P8 (tetapi bukan #$"
5
atau #$"P
5
) yang
menyerap cahaya dengan pan!ang gelombang ,-E nm (>ambar C--) membawa
manfaat. 7ksidasi #$"8 men!adi #$"
5
ter!adi disertai dengan penurunan densitas
optik (7", optical density) pada ,-E nm, yang proporsional dengan !umlah #$"8
yang dioksidasi. "emikian pula, kalau #$"
5
direduksi, 7" pada ,-E nm akan
meningkat sebanding dengan !umlah #$"8 yang terbentuk. Perubaahan 7" pada
,-E nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim
dehidrogenase yang bergantung #$"
5
atau #$"P
5
sebagai berikut. )agi enzim
dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi #$"8 oleh substratnya yang teroksidasi,
kecepatan penurunan 7" pada ,-E nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi
enzim. 7leh karena itu, hasil pengukuran kecepatan oenurunan 7" pada ,-E nm
memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim, yang dinyatakan dengan unit
akti&&itas, yang terdapat di dalam sampel biologik tertentu seperti serum atau ekstrak
!aringan
.
(E
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
200 250 300 350 400
Panjang gelombang (nm)
D
e
n
s
i
t
a
s

O
p
t
i
k
#$"8
#$"
5
1$*b$r : Spektrum $bsopsi #$"
5
dan #$"8. "ensitas yang tampak di sini adalah
untuk -- 'gF4, larutan di dalam sebuah sel dengan lintasan cahaya ( cm #$"P
5

mempunyai spectrum yangmasing-masing analog dengan spectrum #$"
5
dan
#$"8.
(#4#( K$0$r B$ny$& En/i* D$-$t Diu&ur 0en'$n Mer$n'&$i&$nny$ -$0$
En/i* Dehi0ro'en$se
Pada contoh diatas, la!u pembentukan produk (#$"8) diukur untuk
menentukan akti&itas enzim. Enzim selain dehidrogenase diukur kadarnya lewat
pengukuran kecepatan kemunculan produk (atau, yang lebih !arang dilakukan, lewat
pengukuran kecepatan hilangnya substrat). Sifat-sifat fisiokimiawi produk atau
substrat akan menentukan metode spesifik yang dipilih untuk mengukur kadar enzim.
6ara yang sering dan mudah dilakukan adalah ?merangkaikan@ (coupling) produk
reaksi dengan sebuah enzim dehidrogenase, dengan produk srbagai substrat.
((
(#; ENZIM MU)NI BE)FUN1SI SAN1AT PENTIN1 BA1I PEMAAMAN
ST)UKTU)7 FUN1SI7 MEKANISME )EAKSI7 DAN PEN1ATU)AN
ENZIM#
:u!uan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim
spesifikasi dan ekstra sel ?'entah@ (crude) yang mengandung banyak komponen lain.
'olekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat
melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya
adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai
stuktur kimia dan fisika yang seupa.
Per!alanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik
serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai -DE kali lipat.
>lukosa
$:P, 'g
+5
$"P, 'g
+5
>lukosa-;-<osfat
#$"P
5
5 8
5
;-<osfoglukonolakton
En/i* Di-ero%eh 0$ri Su*ber9Su*ber A%$*i $t$u 0$ri Se% Te*-$t En/i*
Tersebut Sie&s-resi&$n o%eh 1en y$n' 0iK%on#
"ulu, riset awal terhadap enzim terbatas pada protein yang dapat dimurnikan
dari sel-sel binatang, tanaman, atau bakteri tempat enzim tersebut terdapat secara
alami. Sekarang, teknologi DNA re&o*bin$n telah memungkinkan ilmuwan
memprouksi protein di dalam sel tempat protein tersebut normalnya tidak ditemukan.
Sel-sel hospes tipikal adalah bakteri dan ragi yang secara kuantitas mudah tumbuh.
%emmapuan mengekspresikan protein rekombinan pada tingkat yang relatif tinggi
men!adikan para ilmuwan mempu mengisolasi enzim yang sulit dimurnikan karena
konsentrasi rendahnya di dalam sel tempat mereka ditemukan secara alami. 4ebih
lan!ut, melalui perubahan "#$ yang mengkodekan protein melalui mutagenesis
(+
#$"P
>41%7S$-;-<7S<$:
"E82"37>E#$E
8E%S7%2#$SE
berorientasi .tapak (site-directed mutagenesis), para 2lmuwan dapat menambah,
menghilangkan, atau mengubah asam-asam amino spesifik dalam enzim rekombinan
untuk untuk memfasilitasi penentuan peran fungsional dan strukturalnya. Perubahan
dapat pula dilakukan untuk membuat protein lebih mudah dimurnikan.
)agaimanapun, pmurnian enzim dan sumbernya yang alami tetap merupakan hal yang
penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi posstranslasi
yang yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik.
Pe*urni$n Di%$&u&$n *en''un$&$n Kro*$to'r$3i -$0$ -ertu&$r$n Ion $t$u
-$0$ Peny$n''$ Penyisih U&ur$n#
Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai
konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut
(aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi P8 "iferensil, sentifugasi
diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. $dsopsi selektif dan elusi protein dari zat
penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil ("E$E) selulosa dan zat penukar anion
selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (6'6, carbokxymethylcellulose) !uga telah
memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam !umlah
besar.
Sebagi contoh,P8 ekstrak ekuesosa !aringan hati diatur hingga 9, = yang pada P8 ini,
sebagian besar protein akan memiliki muatan netto negatif. 6ampuran protein dapat
larut ini kemudian dialirkn lewat kolom selulosa "E$E pada P8 9.= bemuatan negatif
akan terikat ke "E$E lewat interkasi muatan yang berlawanan, sementara protein
yang tidak bermuatan atau yang mempunyai muatan positif mengalir langsung lewat
kolom tersebut. %emudian, kolom selulosa "E$E ini dielusikan menggunakan
gradien #a6l, yang memiliki kisaran dari konsntrasi rendah hingga tinggi, dan
dilarutkan dalam pendapan denganP8 9,=. karena 6l
-
bersaing dengan protein untuk
berikatan ke penyangga yang bermuatan positif, protein untuk elusikan secara selektif
protein yang memiliki ikatan paling lemah diikat paling awal, dan protein yang
memiliki ikatan paling kuat diikat palinh akhir. Pemisahan protein analog dolakukan
mengyunakn penyangga bermuatan negatif seperti karboksimetilselulosa atau
fosfoselulosa pada P8 yang sedikit lebih rendah untuk memastikan bahwa protein
bermuatan lebih positif.
Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai
?ayakan molecular@.. %alau campuran protein dialirkan lewat kolom yang
(,
mengandung ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di
dalam ruang antar partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga.
%etika campuran protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom,
mobilitas protein yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang
ukurannya terlalu besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. "engan demikian,protein
berukuran besar akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran
kecil.
:abel * 3angkuman skema pemurnian enzim tipikal
<raksi Enzim $kti&itas
:otal (m1)
(
Protein
:otal (mg)
$kti&itas
Spesifik
(m1Fmg)
Pemulihan
%eseluruhan
8omogenat hati mentah
6airan supernatan, pemusingan (EE.EEE G g
Endapan H#8-I+S7- -E . =E J
Endapan aseton +E . ,= J
<raksi kolom "E$E CE . ((E
Endapan H#8-I+S7- -, . -C J
%ristal pertama
3ekritalisasi
(EE.EEE
DC.EEE
DE.EEE
;E.EEE
=C.EEE
=+.EEE
=E.EEE
-D.EEE
(E.EEE
C.EEE
(.=EE
+=E
+D
+E
(+
(E
(E
(+, +
;E
+-E
+.EEE
+.;EE
-.(;E
-.DEE
((EE)
DC
DE
;E
=C
=+
=E
-D
Peny$n''$ Kro*$to'r$3i A3init$s M$*-u Men'en$%i )e'io En/i* S-esi3i&
6iri yang menon!ol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk
secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, se!umlah
kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. :eknik ini menggunakan
suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang
ingin dimurnikan. %alau campuran protein tersebut dipan!ankan pada ligand tersebut.
Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein
yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai
cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan
konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini
sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan
pemakaian se!umlah teknik klasik secara berturutan
4igand yang di suka adalah substrat serta deri&at koenzim atau zat perwarna
organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara
ko&alen dengan sebuah penyangga inert (misal, #$"-SpandeG, )lue Sepharose).
(-
4igand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.0ang
mempunyai pan!ang tiga hingga delapan atom karbon.
Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan
terikat ke penyangga seperti sephadeG. 3etensi protein pada penyangga ini melibatkan
interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut.
Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan
konsentrasi tinggi (misal, H#8
-
I
+
S7
-
) dan dielusikan dengan garam yang sama yang
memiliki gradien menurun.
Te&no%o'i DNA )e&o*bin$n D$-$t Men,$0i Su*ber En/i* 8$n' K$y$
)anyak gen yang mengkodekan enzim telah diklon, ditentukan rangkaiannya, dan
disisipkan ke dalam &ector yang berasal dari plasmid atau faga tempat gen tersebut
dapat di kontrol oleh suatu promoter yang kuat. Promoter tersebut dapat ?mendorong@
produksi enzim rekombinan hingga mencapai taraf yang !auh lebih tinggi
dibandingkan dengan yang terdapat pada sumber . sumber alam. "engan
menggunakan promoter yang diatur oleh zat penginduksi (inducer) kimia spesifik,
ekspresi enzim rekombinan dapat diatur secara cermat. 1mumnya &ector ekspresi
semacam ini disisipkan ke dalam mikroorganisme yang mudah tumbuh seperti
Escherichia coli atau ragi untuk memproduksi enzim rekombinan.
Protein Fusi )e&o*bin$n Di*urni&$n 0en'$n &ro*$to'r$si $3init$s
"isamping menghasilkan sumber yang kaya akan enzim, yang sangat memfasilitasi
pemurnian, teknologi "#$ rekombinan dapat digunakan untuk menciptakan protein
termodifikasi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas. 6ara yang umum
dilakukan adalah dengan mengikatkan kepada gen, se!umlah rangkaian nukleutida
yang kKmengkodekan ekstensi protein sehingga terbentuk protein fusi yang
merupakan ligand yang baik bagi penyangga afinitas spesifik. Salah satu pendekatan
yang popular adalah denngan mengikatkan rantai yang terdiri atas lima atau enam
asam amino histidin atau sebagai alternatif lain, domain pengikat substrat untuk enzim
glutation S-trasferase kepada gugus terminal amino atau karboksil enzim yang
bersangkutan. Protein fusi rekombinan trsebut kemudian dapat dimurnikan pada
kolom afinitas yang berisi ion logam bi&alen terikat seperti #i+5 (untuk fusi dengan
polihistidin) atau glutation terikat (untuk protein fusi glutation S-trasferase) (>ambar
C-;).Protein fusi sering mengandung tapak (site) pembelahan untuk protease yang
sangat spesifik seperti trombin, pada regio yang menghubungkan kedua bagian dari
(=
protein fusi tersebut. 8al ini memungkinkan pengeluaran domain fusi tambahan
tersebut setelah pemurnian afinitas.
>S: yang mengkodekan plasmid "#$ 8asil klon
"engan tapak trombin yang mengkodekan enzim
4igasikan men!adi satu
4akukan tranfeksi sel, tambahkan zat
Penginduksi, kemudian lakukan
pemecahan zat
$lirkan kedalam kolom afinitas glutation
(>S8)
lakukan alusi dengan >S8 proses
dengan trombin
1$*b$r : Penggunaan protein .fusi glutation S-tranferae (>S:) untuk pemurnian
enzim rekombinan
(;
Enzim
>S:
>S:
: Enzim
>S:
Enzi
m
>S:
Enzi
m
>S:
>S:
E%e&tro3oresis 1e% Po%i$&ri%$*i0$ D$-$t Men0ete&si Kont$*in$n
Penilaian homogeneitas protein paling baik dilakukan dengan elektroforesis gel
poliakrilamida (P$>E, polyacrylida gel electrophoresis) di bawah berbagai kondisi.
0ang paling popular di antaranya adalah elektroforesis gel poliakrilamida atau P$>E
dengan sodium dodesil sulfat (S"S), suatu detergen ion yang memisahkan protein
multimerik men!adi protomer. %arena setiap ikatan peptida mengikat kurang lebih dua
buah molekul S"S, polipeptida tersebut memiliki muatan negatif yang kuat. "engan
demikian, !arak yang ditempuh setiap polipeptida ketika bermigrasi kearah anoda
bergantung pada massa molecular relatifnya ('r). Sebagai alternatif lain, P$>E dapat
dilaksanakan dalam kondisi asli yaitu, tanpa adanya S"S atau denaturan lain sehingga
struktur kuaterner dan kerap kali pula akti&itas katalitik enzimnya dapat
dipertahankan. "alam P$>E dua dimensi (7L<arrell), dimensi pertama memisahkan
protein yang terdenaturasi berdasarkan nilai pl-nya dengan melakukan ekuilibrasi
protein tersebut di dalam medan listrik yang mengandung urea dan dengan gradien p8
yang dipertahankan oleh amfolit terpolimerisasi. Setelah pemrosesan dengan S"S
selesai, dimensi kedua kemudian memisahkan protein berdasarkan ukuran molecular
unit protomernya.
(#< ENZIM DAPAT DITEMUKAN DI DA!AM .)1ANE! SPESIFIK
Susunan spasial dan kompartementalisasi enzim, substrat, serta kofaktor di
dalam sel mempunyai makna yang teramat penting. Sebagai contoh, di dalam sel-sel
hati, enzim untuk glikolisis terdapat di dalam sitoplasma sedangkan enzim untuk
siklus asam sitrat di dalam mitokondria. "istribusi enzim diantara berbagai organel
subselular dapat dipela!ari setelah dilakukan fraksionasi homogenat sel melalui
sentrifugasi berkecepatan tinggi. %andungan enzim pada setiap fraksi kemudian
diperiksa.
Penentuan lokasi suatu enzim tertentu didalam sebuah sel atau !aringan pada
keadaan yang relatif tetap acapkali dilakukan dengan prosedur histokimiawi
(?histoenzimologi@). Sayatan tipis !aringan yang dibekukan (frozen section) dengan
ketebalan + hingga (Em diproses dengan substrat untuk suatu suatu enzim tertentu.
"i mana terdapat enzim, di situ akan terbentuk produk dari reaksi yang dikatalisis
enzim tersebut. /ika terwarna dan tidak larut, produk akan tetap berada di tempat
(9
pembentukannya dan mengungkap lokasi enzim. 8istoenzimologi menghasilkan
gambar grafik dan pola yang relatif bersifat fisiologik mengenai distribusi enzim.
(#= IS.ZIM ME)UPAKAN BENTUK 8AN1 MEMPUN8AI PE)BEDAAN
FISIK TETAPI DEN1AN AKTI6ITAS KATA!ISIS 8AN1 SAMA
%alau teknik pemurnian enzim diaplikasikan, sebagai contoh kepada enzim
malat dehidrogenase yang berasal dari sumber yang berbeda (misal, hati tikus dan
escherichia coli), kita akan melihat dengan !elas bahwa sekalipun enzim malat
dehidrogenae yang berasal dari hati tikus maupun E coli akan mengatalisis reaksi
yang sama, sifat-sifat fisik dan kimiamereka memperlihatkan banyak perbedaan
bemakna. )netuk . bentuk fisik berbeda dari akti&itas yang ama !uga dapat ditemukan
dalam berbagai !aringan organisme yang sama, dalam tipe-tipe sel yang berbeda,
dalam kompartemen sunselular, atau dalam organisme prokaryotik seperti E coli.
:emuan ini diperoleh sebagai hasil penerapan prosedur pemisahan elektroforentik
pada pemisahan bentuk-bentuk akti&itas enzimatik tertentu yang berbeda secara
elektroforetis.
Pe*is$h$n 0$n I0enti3i&$si Isoen/i* *e*i%i&i Ni%$i Di$'nosti&
2sozim laktat dehidrogenase dalam serum dapat dilihat dengan melakukan
elektroforesis terhadap sampel serum pada bahan penyangga pati, agar atau gel
poliakrilamoda, yang biasanya dilakukan dengan P8 C,;. isozim tersebut mempunyai
muatan yang belainan pada p8 C,; ini dan bermigrasi menu!u lima daerah yang
berlainan pada elektoferogram. 2sozim tersebut dideteksi berdasarkan kemampuan
masing .masing isozim. 'engatalisis proses reaksi suatu zat pewarna yang tidak
berwarna men!adi bentuk yang berwarna dan tidak larut.
6ampuran $ssay dehidrogenase tipikal mengandung #$"5 suatu substrat
terteduksi , bentuk teroksidasi zat pewarna redoks seperti nitroblue tetrazolium
(#):), pembawa (carrier) electron intermediet yang diperlukan bagi pemindahan
elektron dari #$"8 ke #):, serta pendapat serta ion pengaktif !ika dibutuhkan..
(C
(4aktat) S8
+
S (piru&at)
#$"
5
#$"8 5 8
5
P'S :ereduksi P'S :eroksidasi
#): :eroksidasi #): tereduksi
(:idak berwarna) (<ormazan )iu)
1$*b$r : reaksi yang dirangkaiakn untuk mendeteksi akti&itas laktat dehidrogenase
pada sebuan elektroferogram. (#):, netroblue tetrazolium, P'S, phenazine
methosulfate).
Iso/i* *eru-$&$n -ro0u& 0$ri 'en y$n' ber&er$b$t er$t#
Enzim oligomerik dengan protomer yang tidak sama bisa terdapat. 0ang sering,
satu !aringan mengahsilkan terutama satu !enis protomer, sementara !aringan lain
menghasilkan protomer lain. )ila protomer-protomer ini dapat brgabung melalui
berbagai cara untuk membangun sebuah enzim yang aktif (misal, tetramer),
terbentuklah isozim dengan aktifitas enzimatik tersebut.
2sozim laktat dehidrogenase memiliki perbedaan pada tingkat stuktur kuanternernya.
'olekul oligomerik laktat dehidrogenase stuktur kuanternernya. 'olekul oligomerik
laktat dehidrogenase (berat molekul (,E.EEE) terdiri atas empat protomer dengan dua
tipe, yaitu tipe 8 dan ' (berat molekul sekitar ,-.EEE). hanya molekul tetramiklah
yang mempunyai akti&itas katalitik. /ika urutan tidak penting, protomer ini dapt
dikambinasikan mela4ui cara berikut *
8888
888'
88''
(D
4$%:$: "E82"37>E#$SE
8'''
''''
'arkert telah menggunakan se!umlah kondisi yang diketahui dapat
membongkar dan membentuk kembali struktur kuanterner untuk menerangkan
hubungan antar isozim laktat dehidrogenase. Pemecahan dan pembentukan kembali
laktat dehidrogenase .2
(
atatu laktat dehidrogenase .2
=
homogen tidak emnghasilkan
isozim yang baru.
(#> ANA!ISIS KUANTITATIF ENZIM P!ASMA TE)TENTU
MEMPUN8AI MAKNA DIA1N.STIK#
En/i* -%$s*$ non3un'sion$% tidak melakukan sembanrang fungsi fisiologik ynag
diketahui di dalam darah. Substrat sering tidak ditemukan di dalam plasma, dan enzim
sendiri terdapat di dalam darah manusia normal dengan kadar sampai se!uta kali lipat
lebih rendah daripada kadar di !aringan. %eberadaan enzim di dalam plasma dengan
kadar yang meningkat diatas nilai normalnya menun!ukkan peningkatan la!u
kerusakan !aringan.
(#? ENZIM END.NUK!EASE )EST)IKSI MEMFASI!ITASI
PENE1AKAN DIA1N.SIS PEN8AKIT 1ENTIK
Penegakan diagnosis penyakit genetic telah memperoleh dorongan yang luar
biasa dari perkembangan teknologi "#$ rekombinan. 'eskipun semua penyakit
molecular telah lama diketahui ter!adi sbagai akibat perubahan "#$, teknik untuk
pemeriksan langsung terhadap rangkaian "#$, teknik untuk pemeriksaan langsung
terhadap rangkaian "#$ baru belakangan ini tersedia. Pengembangan pelacakan
hibridasi untuk fragmen "#$ telah menghasilkan se!umlah teknik penapisan prenatal
dengan sensiti&itas yang memedai guna menentukan ada tidaknya kalainan herediter,
teknik ini dilakukan dengan memetakan enzim retriksi "#$ yang berasal dari sel-sel
!anin dalam cairan amnion atau dengan memeriksa produk yang dihasilkan
menggunakan oligonukleotida sebagai senyawa primer untuk re$&si r$nt$i
-o%i*er$se7 (P63, polymerase chain reaction). Pada prinsipnya berbagai pelacak
terhadap "#$ dapat dilakukan untuk menengakan diagnosis sebagaian besar penyakit
genetik. Sebuah pelacak terhadap "#$ yang dibuat terhadap suatu bagian gen untuk
sub unit hemoglobin normal dapat mendeteksi fragmen restrisik yang emmendek atau
tidak ada akibat delesi di dalam gen tersebut, sebagaiman ter!adi pada sebagian
penyakit talasemia-, dan pada tipe-tipe talasemia - serta -, yang langka.
+E
ASI! DI1ESTI )EST)IKSI 8AN1 SUDA TE)!A@AK DAPAT
MEN1UN1KAPKAN 1EN .M.!.1 DEN1AN )AN1KAIAN BASA
BE)BEDA#
Pelacak "#$ dapat pula digunakan mendeteksi rangkaian "#$ yang
behubungan erat dengan gen. Pemeriksaan analisis ini dapat dikembangkan untuk
mendeteksi berbagai &ariasi kromosom spesifik (perbedaan dalam rangkaian antar
kromosom homolog). "igesti "#$ oleh enzim retriksi endonuklease akan
menghasilkan peta restriksi berbeda-beda (pola fragmen "#$) dari gen-gen
homologyang mengandung rangkaian basa yang berlainan . fenomena ini diberi nam
A-o%i*or3is*e -$n,$n' 3r$'*en restri&siB# )agi penyakit genetic yang
berhubungan dengan 3<4P,seorang manusia yang men!adi pembawa penyakit
tersebut akan membawa satu kromosom dengan gen normal dan satu kromosom lagi
dengan gen cacat.
)NA KATA!ITIK
'eskipun !elas bukan merupakan protein, asam ribonukleat (3#$) tertentu
akan memperlihatkan akti&itas katalitik yang sangat spesifik bagi substrat tertentu.
3#$ ini yang memenuhi semua kriteria klasik untuk didefinisi sebagai enzim, disebut
ribozim. 'eskipun substrat yang dikatalisis oleh ribozim hanya terbatas pada ikatan
fosfodiester 3#$, spesifitas ker!anya sepenuhnya sebanding ker!a enzim yang klasik.
3ibozim mengatalisis reaksi trans esrterifikasi dan akhirnya reaksi hidrolisis ikatan
fosfodiester dalam molekul 3#$. 3eaksi ini diperlancar oleh gugus 78.
+(
BAB III
PENUTUP
+#" KESIMPU!AN
(. Enzim merupakan katalisator yang mengatur kecepata berlangusngnaya
berbagai proses fisiologik
+. 6acat pada fungsi enzim sering menyebabkan penyakit
,. Enzim yang mengatalisis reaksi yang melibatkan pemindahan gugus isomerisasi,
oksido-reduksi, atau sintesis ikatan ko&alen memerlukan substrat yang dikenal
dengan koenzim
-. Sebagian besar enzim bersifat sangat spesifik terhadap substratnya, koenzim
serta tipe reaksi yang dikatalisisnya. 'eskipun demikian, beberapa enzim
protease !uga memecah ester. )agi enzim yang beker!a pada substrat dapat pula
ikut bereaksi, tetapi umumnya dengan kecepatan yang lebih rendah.
=. Pengukuran akti&itas enzim merupakan hal sentral bagi penentuan kuantitas
enzim dalam riset atau laboratorium klinik.
;. $kti&itas enzim dehidrogenase yang bergantung .#$"(P)
5
diperiksa secara
spektrofotomentris dengan mengukur perubahan absorbsi pada ,,E mm yang
menyertai oksidasi atau reduksi #$" (P)8.
9. Perangkaian enzim lain pada dehidrogenase dapat memperlancar analisisnya.
C. 1ntuk menyelidiki struktur mekanisme ker!a, dan pengaturan akti&itasnya,
enzim harus dimurnikan hingga mencapai homogeneitas sekitar D=J.
D. teknik pemurnian enzim mencakup presipitasi selektif dengan pelarut garam
atau organic dan kromatografi pada penyangga pertukaran ion, filtrasi gel,
afinitas substrat, ligand zat warna, atau interaksi hidrofobik.
(E. kemampuan memanfaatkan teknik rekombinan "#$ untuk mengekspresikan
enzim dalam tubuh hospes yang dipilih telah membawa re&olusi dalam teknik
pemurnian enzim dengan menghasilkan enzim dalan !umalh besar yang dalam
sebagian besar keadaan, mudah dimurnikan hingga mencapa homogeneitas.
((. %ema!uan pemurnian dinilai dengan mengukur peningkatan aktifitas spesifik
suatu enzim (akti&itas per unit masa) dan homogenitas akhir lewat elektroforesis
gel poliakrilamida (P$>E).
(+. Penentuan lokasi enzim intrasel yang tepat disimpulkan lewat teknik histokimia
dan fraksionasi sel, yang dirangkaiakn dengan analisis enzimatik, terhadap
++
sayatan !aringan atau fraksi homogenat sel, isozim, bentuk yang secara fisik
berbeda pada enzim nonfungsional di dalam serum menun!ukan kerusakan pada
!aringan tertentu manusia, dan memberikan informasi diagnostik seta prognostic
yang berharga.
(,. %emampuan enzim restriksi endonuklease mendeteksi perubahan yang sangat
kecil pada struktur gen telah memungkinkan dokter mendiagnosis penyakit
genetic akibat mutasi yang menghasilkan enzim yang cacat atau enzim
nonfungsional.
(-. 3#$ katalitik yang dikenl sebagai ribozim mengatalisis reaksi hidrolisis yang
sangat spesifik ikatan fosfodiester pada 3#$. 3eaksi ini amat penting dalam
berbagai pristiwa pemrosesan yang terlibat di dalam maturasi pra-m3#$
+#( SA)AN
Peranan enzim dalam kesehatan sangat penting, untuk itu manusia hendaknya
lebih men!aga kesehatan. "an kami penyusun mengharapkan masukan untuk
penyempurnaan makalah ini.
+,
KEPUSTAKAAN
'urray, 3obert %, (DD;, 8arperLs, )iochemistry
'c. >il&ery, 3obert M, $nd >erald M, (DC,
Page "a&id, (DC(.
:riman /r, +EE9 'ateri )iokimia, Surabaya
+-
+=
+;