Optimasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Fragmen 724 pb Gen katG Multi Drug Resistance

Tuberculosis untuk Meningkatkan Produk mpli!ikasi ("eniariasi#$ %&'&$ Ratna(ani$ )&$ *o+ani$ ,&C&)
OPT-M,- PCR (Polymerase Chain Reaction) FRGM.% 724 pb G.% katG MULTI
DRUG RESISTANCE TUERCUL!SIS /%T/) M.%-%G)T)% PRO"/)
MP0-F-),-
"eniariasi#$ %&'&
1
$ Ratna(ani$ )&
2
$ *o+ani$ ,&C&
1
1
2urusan Farmasi Fakultas Matematika "an -lmu Pengeta#uan lam /ni3ersitas /da(ana
2
2urusan )imia Fakultas Matematika "an -lmu Pengeta#uan lam /ni3ersitas /da(ana
)orespondensi4 %i 'a(an "eniariasi#
2urusan Farmasi Fakultas Matematika "an -lmu Pengeta#uan lam /ni3ersitas
/da(ana
2alan )ampus /nud52imbaran$ 2imbaran56ali$ -ndonesia 789:4 Telp;Fa<4 89:15789797
.mail4 den iar ia s i# = g m a il &c om
6,TR)
"eteksi adan(a mutasi pada gen katG M"R5T6 (Multi Drug Resistance Tu"erculosis) (ang
bertanggung >a+ab ter#adap resistensi isonia?id (-%@) dapat dilakukan dengan teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR)& Pada penelitian ini metode PCR digunakan untuk mengampli!ikasi
!ragmen berukuran 724 pb gen katG& Tela# dilakukan percobaan penda#uluan$ di mana proses PCR
ber#asil mengampli!ikasi !ragmen berukuran 724 pb namun masi# meng#asilkan pita (ang sangat tipis
(ang menun>ukkan ba#+a proses ampli!ikasi belum optimal& Ole# sebab itu$ penelitian ini bertu>uan
untuk mengoptimasi proses PCR agar mampu meningkatkan produk ampli!ikasi se#ingga diperole#
pita (ang tebal& Produk PCR (ang tebal ini cukup memadai untuk proses sekuensing&
Ta#ap optimasi (ang dilakukan dalam proses PCR meliputi penamba#an >umla# templat "%
pada !ormula PCR$ 3ariasi su#u annealing$ penamba#an +aktu annealing dan +aktu ekstensi& @asil
optimasi menun>ukkan penamba#an >umla# templat "% men>adi 1 A0$ su#u annealing B:CC$ +aktu
annealing
1 menit 28 detik$ dan +aktu ekstensi 2 menit memberikan ampli!ikasi terbaik karena meng#asilkan
pita (ang tebal dan tidak ter>adi mis#riming&
)ata )unci 4 katG$ -%@$ PCR$ optimasi
1& P.%"@/0/%
Pada ta#un 1DDB$ diperkirakan terdapat D
>uta pasien T6 baru dan 9 >uta kematian akibat
T6 di seluru# dunia& "iperkirakan DBE kasus
T6 dan D7E kematian akibat T6 di dunia$
ter>adi pada negara5negara berkembang
("epkes R-$ 2887)& Masala# tuberkulosis
diperpara# dengan adan(a kekebalan ganda
bakteri Multi$rug Resistance (M"R) T6
ter#adap Obat ntituberkulosis (0ina
dkk&$
2887)& -sonia?id$ ri!ampisin$ pira?inamid$
etambutol$ dan streptomisin merupakan Obat
ntituberkulosis (OT) lini pertama pada
pengobata n T6& -%@ merupakan #ro$rug (ang
diakti!kan ole# en?im katalase peroksidase
(ang dikode ole# gen katG pada M&
tu"erculosis ()at?ung$ 2884)& Mutasi pada gen
katG mengakibatkan M% tu"erculosis resisten
ter#adap -%@ (Retnoningrum$ 2884)&
"eteksi adan(a mutasi pada gen katG M"R5
T6 (ang bertanggung >a+ab ter#adap resistensi
-sonia?id (-%@) dapat dilakukan dengan teknik
Polymerase Chain Reaction (PCR)& PCR
merupakan teknik (ang digunakan untuk
mengampli!ikasi sekuens genom spesi!ik
(risan et al%$ 2889)& "alam penelitian ini$
metode PCR digunakan untuk mengampli!ikasi
!ragmen berukuran 724 pb gen katG M"R5T6&
Pada percobaan penda#uluan proses PCR
ber#asil mengampli!ikasi !ragmen berukuran
724 pb namun masi# meng#asilkan pita (ang
sangat tipis (ang menun>ukkan ba#+a proses
ampli!ikasi belum optimal& Ole# sebab itu$
penelitian ini bertu>uan untuk mengoptimasi
proses PCR agar mampu meningkatkan produk
ampli!ikasi se#ingga diperole# pita (ang tebal&
Ta#ap optimasi (ang dilakukan dalam
proses PCR meliputi penamba#an >umla#
templat "% pada !ormula PCR$ 3ariasi su#u
110
Optimasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Fragmen 724 pb Gen katG Multi Drug Resistance
Tuberculosis untuk Meningkatkan Produk mpli!ikasi ("eniariasi#$ %&'&$ Ratna(ani$
)&$
*o + a n i$ , & C &)
111
annealing$ penamba#an +aktu annealing dan
+aktu ekstensi&
2& 6@% "% M.TO".
2&1 6a#an Penelitian
"alam penelitian ini digunakan isolat
M"R5T6 (ang diperole# dari -nstalasi
Mikrobiologi )linik Ruma# ,akit /mum Pusat
,angla# "enpasar& Pada ta#ap isolasi$
diperlukan larutan pelisis (Gu,C%$ Tris5@Cl$
."T dan Triton F5188)$ suspensi diatom$$
etanol 78E$ aseton$ dan RNase &ree 'ater%
6a#an (ang digunakan dalam ta#ap ampli!ikasi
adala# sepasang primer oligonukleotida$
GoTa() Green Master Mi*& 6a#an (ang
digunakan untuk deteksi produk PCR dengan
elektro!oresis$ (aitu gel agarosa 1$BE$ T6.
(Tris56oric5."T)$ serta etidium bromida&
2&2 lat Penelitian
lat (ang digunakan meliputi alat5alat
gelas (ang biasa digunakan dalam
laboratorium
analisis$ +orte*$ inkubator$ &ree,er$ shaker
rotator- "iological sa&ety ca"inet class II$ satu
set pipet mikro (8$1518 A0$ 185188 A0$ 285188
A0$ 18851888 A0)$ tip (18$ 28$ 188$ 288 A0)$
tabung mikro 1$B m0$ Thermalcycler PCR
(merk Geriti)$ seperangkat alat elektro!oresis$
serta /G transilluminator (merk Gel "oc 6io5
Rad)&
2&9 Prosedur Penelitian
2&9&1 -solasi "% dari -solat M"R5T6
-solasi "% dilakukan dengan
menggunakan metode oom& ,el bakteri
dilisiskan dengan menggunakan larutan bu!er
lisis (ang terdiri dari Gu,C%$ Tris5@Cl$ ."T$
dan Triton F5188& ,el (ang tela# dilisiskan
dipresipitasi dengan etanol 78E dan aseton
serta disentri!ugasi pada kecepatan tinggi& Pelet
(ang diperole# dikeringkan dalam 'ater"ath
dan ditamba#kan RNase &ree 'ater& -solat "%
(ang diperole# siap digunakan sebagai templat
untuk proses PCR& ,eluru# prosedur isolasi
"% dilakukan dalam "iological sa&ety ca"inet
class II (6oom et al%$ 1DD8)&
2&9&2 mpli!ikasi Gen katG M"R5T6
,epasang primer oligonukleotida gen katG
(ang tela# didesain sebelumn(a$ (aitu
)G24F
(BH5GGTCGGCGGCTCTC59H) dan
)G:8R (BH5CGTGTCCGCTCTGTCG5
9H) digunakan dalam proses PCR& Formulasi
Optimasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Fragmen 724 pb Gen katG Multi Drug Resistance
Tuberculosis untuk Meningkatkan Produk mpli!ikasi ("eniariasi#$ %&'&$ Ratna(ani$
)&$
*o + a n i$ , & C &)
112
PCR dilakukan dengan mencampurkan @
2
O$
GoTa() Green Master Mi*$ primer
oligonukleotida$ dan templat "%&
mpli!ikasi dilakukan dengan ta#ap denaturasi
a+al pada su#u DBCC selama 1B menit diikuti
48 siklus terdiri dari denaturasi pada su#u DBCC
selama 1 menit$ annealing$ dan ekstensi pada
su#u 72CC selama 2 menit$ serta ekstensi ak#ir
pada su#u 72CC selama 18 menit& Optimasi
su#u annealing dilakukan pada beberapa su#u
berdasarkan su#u (ang dian>urkan dari program
desain primer&
2&9&9 "eteksi Produk PCR
0empeng Produk PCR dideteksi dengan
elektro!oresis gel agarosa 1$BE b;3 (8$B2 g
agarosa dalam 9B m0 "u&&er T6. 1 kali (ang
ditamba#kan 2$7 A0 etidium bromida 18
mg;m0)& 0arutan agarosa dituangkan ke dalam
tray elektro!oresis dan dibiarkan mengeras&
,etela# mengeras$ gel agarosa dipasang dalam
cham"er elektro!oresis dan sisir pada gel
dicabut$ larutan T6. dituang sampai melebi#i
permukaan gel& ,elan>utn(a$ 9 A0 sampel #asil
PCR dimasukkan ke dalam sumur (ang
terbentuk dari sisir& )emudian dielektro!oresis
pada tegangan :B 3olt selama 4B menit& @asil
elektro!oresis kemudian di3isualisasi pada /G
transilluminator&
9& @,-0
@asil kondisi optimasi deteksi gen katG
isolat M"R5T6 dengan teknik PCR dan
elektro!oresis gel agarosa 1$BE pada gradien
su#u annealing (47CC$ B8 CC$ B2 CC$ B4 CC$ B:
CC$ dan B7CC)$ +aktu annealing 1 menit$ +aktu
ekstensi 1 menit$ serta 3olume "% sampel 8$B
A0 pada !ormula PCR dapat ditun>ukkan ole#
Gambar &1& )ondisi tersebut memperli#atkan
adan(a pita (ang sangat tipis pada su#u 47CC
dan B8CC& Pada su#u B2CC$ B4CC$ B:CC$ dan
B7CC tidak meng#asilkan produk ampli!ikasi&
6erdasarkan #asil optimasi tersebut maka
dilakukan optimasi kembali pada su#u
annealing (ang sama dengan penamba#an
3olume "% sampel men>adi 1 A0 pada
!ormula PCR&
@asil kondisi optimasi kedua (ang
ditun>ukkan ole# Gambar &2 memperli#atkan
adan(a pita pada semua su#u$ kecuali pada
su#u B7CC& "ari enam gradien su#u$ dilakukan
pemili#an su#u annealing optimum (ang
berdekatan dengan Tm primer& 6erdasarkan
program Clone Manager Suite .$ Tm primer
disebutkan pada su#u B7CC namun pada su#u
tersebut tidak diperole# pita "% se#ingga
su#u B:CC digunakan sebagai su#u annealing&
/ntuk meningkatkan produk ampli!ikasi$
dilakukan pula penamba#an +aktu annealing
dan +aktu ekstensi dalam proses PCR& "imana
+aktu a+al annealing dan +aktu ekstensi (ang
digunakan (aitu 1 menit& "alam penelitian
+aktu annealing 1 menit 28 detik dan +aktu
ekstensi 2 menit memberikan pita (ang lebi#
tebal (ang dapat ditun>ukkan ole# Gambar &9&
Pita tersebut dapat digunakan sebagai templat
untuk proses sekuensing&
4& P.M6@,%
6erdasarkan #asil kondisi optimasi deteksi
gen katG i solat M"R5T6 dengan teknik
PCR
dan elektro!oresis gel agarosa 1$BE pada
gradien su#u annealing (47CC$ B8CC$ B2CC$
B4CC$ B:CC$ dan B7CC)$ +aktu annealing 1
menit$ +aktu ekstensi 1 menit$ serta
3olume
"% sampel 8$B A0 pada !ormula PCR (ang
ditun>ukkan ole# Gambar &1 meng#asilkan
pita (ang sangat tipis #an(a pada su#u 47CC
dan B8CC& @al tersebut kemungkinan
disebabkan karena konsentrasi templat "%
(ang kurang dari 1 ng& )onsentrasi templat
"% 1 ng merupakan konsentrasi minimal
(ang dapat digunakan dalam proses PCR
(6artlett et al%$ 2889) se#ingga dilakukan
penamba#an 3olume "% #asil ekstraksi
(sampel) pada !ormula PCR (Clontec#$ 1DDD)&
6erdasarkan #asil kondisi optimasi tersebut
maka dilakukan optimasi kembali pada su#u
annealing (ang sama dengan penamba#an
3olume "% sampel men>adi 1 A0 pada
!ormula PCR& @asil kondisi optimasi kedua
(ang ditun>ukkan ole# Gambar &2
memperli#atkan adan(a pita pada semua su#u$
kecuali pada su#u B7CC& dan(a pita pada su#u
47$ B8$ B2$ B4$ dan B: IC menggambarkan
ba#+a penamba#an 3olume "% #asil
ekstraksi mampu meningkatkan produk
ampli!ikasi&
"ari lima gradien su#u optimasi (ang
meng#asilkan pita$ dilakukan pemili#an su#u
annealing optimum (ang berdekatan dengan
Tm primer& 6erdasarkan program Clone
Manager .$ Tm primer disebutkan pada su#u
B7CC namun pada su#u tersebut tidak diperole#
pita "% se#ingga su#u B:CC digunakan
sebagai su#u annealing& ,elain alasan tersebut$
pada su#u annealing B:CC tidak menun>ukkan
adan(a mis#riming dan berdasarkan penelitian$
Tm primer berkisar antara B85:B CC (bd5
.lsalam$ 2889J 6ora#$ 2811J @ando(o dan ri$
2888)&
/ntuk meningkatkan produk ampli!ikasi$
dilakukan pula penamba#an +aktu annealing
dan ekstensi dalam proses PCR& Pemili#an
+aktu (ang optimum tergantung pada templat
"% (ang digunakan& Penentuan +aktu untuk
proses annealing berkaitan dengan pan>ang
primer sedangkan pemili#an +aktu ekstensi
primer tergantung pada pan>ang !ragmen "%
(ang akan diampli!ikasi (@ando(o dan ri$
2888)& 'aktu a+al annealing dan ekstensi (ang
digunakan dalam penelitian$ (aitu 1 menit$
namun setela# dilakukan optimasi kembali$
+aktu annealing 1 menit 28 detik dan +aktu
ekstensi 2 menit memberikan pita (ang
lebi# tebal Pita tersebut dapat digunakan
sebagai templat untuk proses sekuensing (ang
berguna untuk mengeta#ui >enis mutasi (ang
ter>adi pada !ragmen 724 pb gen katG isolat
M"R5T6&
B& ).,-MP/0%
6erdasarkan penelitian (ang tela#
dilakukan$ #asil optimasi gen katG M"R5T6
menun>ukkan penamba#an >umla# templat
"% men>adi 1 A0$ su#u annealing B:CC$
+aktu annealing 1 menit 28 detik$ dan +aktu
ekstensi 2 menit memberikan ampli!ikasi
terbaik karena meng#asilkan pita (ang tebal
dan tidak ter>adi mis#riming (ang dapat
digunakan sebagai templat untuk proses
sekuensing&
/CP% T.R-M ),-@
Penulis mengucapkan terima kasi#
kepada teknisi laboratorium
Mikrobiologi R,/P
,angla# dan teknisi laboratorium 6iologi
Molekuler F) /%/" atas bantuan (ang tela#
diberikan se#ingga penelitian ini dapat
terlaksana dengan baik&
"FTR P/,T)
bd5.lsalam$ )&& 2889& 6ioin!ormatic
Tools
and Guideline !or PCR Primer "esign&
A&rican /ournal o& iotechnology& pp&
D15DB&
risan$ ,&$ %5Cem ,&$ Omer O&C&$ .rbil .&
2889& Pol(merase C#ain Reaction is a
Good "iagnostic Tool !or
Myco"acterium tu"erculosis in /rine
,amples& /ournal o& Cell an$ Molecular
iology 0& pp& DD5189&
6artlett$ 2&M&,&$ ,tirling "& 2889& PCR
Protocols ,econd .dition& Metho$s in
Molecular iology& pp& D85DB&
6oom$ R&$ ,ol C&2&&$ ,alimans M&M&M&$
2ansen C&0& 1DD8& Rapid and ,imple
Met#od !or Puri!ication o! %ucleic cid&
/% Clin Micro"iol& 4DB5B89&
6ora#$ P& 2811& Primer "esigning !or PCR& Sci%
1is& Gol& 11 (9)& pp4 194519:&
Clontec#& 1DDD& A$+antage Genomic PCR User
Manual& Clontec# 0aboratories$ -nc& "epkes
R-& 2887& Pe$oman Nasional
Penanggulangan Tu"erkulosis E$isi 0
Cetakan Pertama& "epartemen
)ese#atan Republik
-ndonesia&
@ando(o$ "& dan ri R& 2888& Prinsip /mum
dan Pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR)& Unitas& D41752D&
)at?ung$ 6&G& 2884& 2armakologi Dasar $an
3linik& 2akarta4 ,alemba
.mpat&
0ina$ Maria$ 6udiman 6ela$ Muk# ,(ai!udin&
2887& "eteksi Gen Target -%@ pada
"% ,putum 6asil Ta#an sam Positi!
dengan Teknik Polymerase Chain
Reaction& Ma4% 3e$okt% In$on& 7424B5
2B8&
Retnoningrum$ ,&"& dan Roga F&)& 2884&
Mekanisme Tingkat Molekul Resistensi
terha$a# e"era#a !"at #a$a
Myco"acterium tu"erculosis& 3ailable4
K # ttp4;; a ct a &!a& itb&ac&i d ;pd!Ld ir ;iss u e L2DL
9L2&pd!M N2 ug 2819O
Optimasi PCR (Polymerase Chain Reaction) Fragmen 724 pb Gen katG Multi Drug Resistance
Tuberculosis untuk Meningkatkan Produk mpli!ikasi ("eniariasi#$ %&'&$ Ratna(ani$
)&$ *o+ani$ ,&C&)
1 2 9 4 B : 7
2872 pb
1B88 pb
:88 pb
Pita (ang sangat tipis
188 pb
Gambar &1 .lektro!oregram gen katG isolat M"R5T6 dengan gradien su#u annealing
)eterangan gambar4 1& 188 bp DNA la$$erJ 2& Pita "% pada su#u 47CCJ 9& Pita "%
pada su#u B8CCJ 4& Pita "% pada su#u B2CCJ B& Pita "% pada su#u B4CCJ :& Pita
"% pada su#u B:CCJ 7& Pita "% pada su#u B7CC dengan konsentrasi "% sampel
8$B A0 dalam !ormula PCR
1 2 9 4
B : 7
1B88 pb
:88 pb
188 pb
Gambar &2 .lektro!oregram gen katG isolat M"R T6 dengan gradien su#u annealing
)eterangan gambar4 1& 188 bp DNA la$$erJ 2& Pita "% pada su#u 47CCJ 9& Pita "%
pada su#u B8CCJ 4& Pita "% pada su#u B2CCJ B& Pita "% pada su#u B4CCJ :& Pita
"% pada su#u B:CCJ 7& Pita "% pada su#u B7CC konsentrasi "% sampel 1 A0
dalam !ormula PCR
1 2 9 4
2872 pb
1B88 pb
:88 pb
188 pb
Gambar &9.lektro!oregram gen katG isolat M"R5T6 pada su#u annealing B:CC dengan +aktu
annealing 1 menit 28 detik dan +aktu ekstensi 2 menit&
)eterangan gambar4 1$ 2$ dan 9& -solat M"R5T6J 4& 188 bp DNA la$$er