PRATIKUM PAKET 4

PENANAMAN DAN PERHITUNGAN MIKROBA

TUJUAN PRATIKUM
Pratikum ini bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan penanaman dan
memahami cara perhitungan jumlah mikroba
DASAR TEORI
A. Penanaman Mikroorganisme (Bakeri!
Populasi mikroba di alam sangat besar dan kompleks. Alam sekitar
baik udara, tanah, air juga dihuni oleh mikroba. Penelitian mikroba dalam
berbagai habitat memerlukan teknik untuk memisahkan populasi
campuran atau biakan campuran yang rumit ini menjadi spesies yang
berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu
populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk. Bahan yang
dinokulasikan pada medium disebut inokolum. Dengan menginokuasikan
medium dengan teknik goresan yaitu menggoreskan inokulum di atas
media menggunakan ose, sel-sel itu akan terpisah-pisah sendiri. Setelah
inkubasi sel-sel mikroba memperbanyak diri dalam waktu 1-!" jam
terbentuk massa sel yang disebut koloni. Piaraan murni yang disimpan
lama mudah sekali mengalami mutasi. #ika terjadi demikian maka piaraan
murni tersebut bukan lagi piaraan murni semula. $ni berarti tipe asli telah
hilang. %ntuk menghindarkan atau paling sedikit mengurangi terjadinya
mutasi dalam piaraan simpanan maka &
1. Secara periodik piaraan harus dipindahkan ke medium baru.
Pemindahan ini sebaiknya dilakukan pada koloni mencapai 'ase
log.
!. Piaraan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari
radiasi.
(. )ikroba dilio'ilisasikan yaitu dimasukkan dalam ampul berisi susu
kering bercampur *+! kemudian disimpan pada tempat bersuhu
rendah.
Sesungguhnya kebanyakan laboratorium mikrobiologi menyimpan
dan memelihara koleksi biakan tersebut. ,he American ,ype *ulture
*ollection -A,,*. yang ada di /ashington memelihara ribuan spesies
mikroba termasuk 0irus.
Dalam mengembangbiakan mikroorganisme, khususnya bakteri,
alat-alat yang digunakan harus steril. Sterilisasi dilakukan dengan
memanaskan seluruh alat, seperti cawan petri, ose, tabung reaksi, dll di
dalam autocla0e. )embiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagai
cara, salah satunya pengembangbiakan dalam media cawan petri.
Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu &
1. )etode cawan gores -steak plate.
)etode cawan gores cukup sulit bagi pemula. Bertujuan untuk
mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan
kultur ke dalam medium baru. Prinsip metode ini, yaitu
mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang
lain, sehingga mempermudah proses isolasi. *ara ini dilakukan
dengan membagi cawan petri menjadi (-" bagian. +se steril yang
telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril.
1oresan dapat dlakukan (-" kali membentuk garis hori2ontal di
satu sisi cawan. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah
kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan
sebelumnya pada sisi cawan kedua. 3angkah ini dilanjutkan hingga
keempat sisi cawan tergores. Pada metode ini, goresan di sisi
pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan,
sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak tumbuh
terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan
secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi. ,eknik penanaman
dengan goresan -streak. bertujuan untuk mengisolasi
mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke
dalam medium baru.
a. 1oresan sinambung
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara
kontinyu sampai setengah permukaan agar, lalu putar cawan
145* lanjutkan goresan sampai habis. 1oresan sinambung
umunya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,
melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b. 1oresan ,
Bagi cawan menjadi ( bagian menggunakan spidol marker,
inokulai daerah dengan streak 2ig-2ag. Panaskan jarum
inokulan dan tunggu dingin kemudian lanjutkan streak 2ig-2ag.
*awan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna.
c. 1oresan kuadran -streak6uadrant.
7ampir sama dengan goresan ,, namun berpola goresan yang
berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal
sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisme.
1oresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan
pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-
pisah menjadi koloni tunggal. *ara ini dilakukan dengan
membagi cawan petri menjadi (-" bagian. +se steril yang telah
disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril.
1oresan dapat dilakukan (-" kali membentuk garis hori2ontal di
satu sisi cawan. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah
kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan
sebelumnya pada sisi cawan kedua. 3angkah ini dilanjutkan
hingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode ini, goresan
di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan
berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai
tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga
didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni
lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar
tidak terkontaminasi.
!. )etode cawan tuang -pour plate.
)etode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak
membutuhkan ketrampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup
baik. )etode ini dilakukan dengan mengencerkan isolat yang telah
diketahui beratnya ke dalam 8 ml garam 'isiologis -9a*3 4.:;.
atau larutan bu''er 'os'at. 3arutan ini berperan sebagai penyangga
p7 agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya p7 lingkungan.
Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang
didapat tidak terlalu padat atau memenuhi cawan -biakan terlalu
padat akan mengganggu pengamatan.. Sekitar 1 ml suspensi
dituang ke dalam cawan petri, dilanjutkan dengan menuangkan
media penyubur -nutrien agar. steril hangat -"4-:45*. kemudian
ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator -(<5*. selama 1-!
hari. Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril
agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya
organisme yang tidak diinginkan -di laboraturium, kontaminasi
biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium
dalam biakan.. )edia yang dituang hendaknya tidak terlalu panas,
karena selain mengganggu proses penuangan -media panas
sebabkan tangan jadi panas juga., media panas masih
mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup,
sehingga mengganggu proses pengamatan. Pada metode ini,
koloni akan tumbuh di dalam media agar. =ultur diletakkan terbalik,
dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudia diletakkan
dalam inkubator.
(. )etode cawan sebar -spread plate.
Pada metode cawan sebar, 4,1 ml suspensi bakteri yang telah
diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah
disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan
batang drygalski agar koloni tumbuh merata pada media dalam
cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator -(<5*.
selama 1-! hari. )etode ini cukup sulit terutama saat meratakan
suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata,
biakan justru terkontaminasi. +leh karena itu, batang drygalski
harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih
dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen.
Perlu diingat, batang drygalski, yang masih panas akibat
pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar,
sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya
di sekitar api bunsen ->1: cm.. Dengan metode ini, satu sel bakteri
akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu
koloni yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe
pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan
terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan
koloni.
B. Peng"i#ngan $#m%a" &akeri
Penghitungan jumlah bakteri dengan berdasarkan jumlah koloni termasuk
metode pengukuran secara tidak langsung. %ntuk melakukan perhitungan
jumlah bakteri berdasarkan jumlah koloni -plate count. harus
memperhatikan syarat-syarat sebagai berikut&
1. #umlah koloni tiap cawan petri antara (4-(4.444 koloni, jika
memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya
mendekati (44.
!. ,idak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas
cawan petri, dikenal sebagai spreader.
(. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-
turut antara pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil
dari ! hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari ! yang dipakai
jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya.
Beberapa langah dalam melakukan pengenceran untuk menghitung
jumlah koloni, dapat terlihat beberapa perbedaan hasil baik dari
penampakan warna saat pengenceran sampai jumlah koloni mikroba yang
didapatkan. ,ujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan
besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran bergantung kepada
perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1&8
untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1&14 sel mikroorganisme dari
pengenceran sebelumnya.
Pada saat melakukan pengenceran maupun pemindahan ke
petridish harus dilakukan secara aseptis suapaya saat melakukan
pemindahan sample dari tabung reaksi satu ke lainnya tidak
terkontaminasi oleh mikroba jenis lain yang tidak diinginkan. ,eknik yang
digunakan untuk memindahkan bahan makanan yang telah diencerkan
pada seri pengenceran 14
-1
-14
-"
digunakan teknik pour plate, hal ini
dilakukan menyebarkan sel-sel mikroba tidak hanya pada permukaan agar
saja melainkan sel terendam agar -di dalam agar -9A.. sehingga terdapat
sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya +
!
dan ada yang tumbuh di
dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen.
Setelah penanaman mikroba ke dalam petridish, selanjutnya
melakukan inkubasi dengan menggunakan inkubator agar mikroba dapat
tumbuh dengan baik pada suhu yang optimum untuk pertumbuhan yaitu
sekitar (<5*. setelah !" jam didapatkan sejumlah mikroba yang tumbuh di
medium. 7asil perhitungan didapat dengan perhitungan koloni mikroba
yang ada dalam petridish.
4. Prose'#r Ker$a (
".1 )etode *awan 1ores -Streak Plate.
Alat dan bahan &
.a +se
.b Api bunsen
.c 3arutan Alkohol
.d *awan petri yang berisi media steril
".! )etode *awan ,uang -Pour Plate.
Alat dan bahan &
.a 8 ml garam 'isiologis -9a*l 4,:;. ? larutan bu''er 'os'at
.b 1 ml suspensi
.c )edia penyubur -nutrien agar.
.d *awan petri steril
.e $nkubator
".( )etode *awan Sebar -Spread Plate.
Alat dan bahan &
.a 4,1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan
.b )edia penyubur steril
.c Batang drygalski
.d $nkubator
.e 3arutan alkohol
.' Api bunsen
.g +se
"." Prosedur praktikum &
a. Setiap mahasiswa melakukan penanaman kultur dari stok
-hasil isolasi mikroba rongga mulut. dengan metode cawan
tuang -pour plate. dan goresan kuadran -streakquadrant..
b. )elakukan penipisan seri dan cara menghitung kuman.
). Pengamaan(
,ahap 1 & Pembuatan 1oresan =uadan -streakquadrant.
a. )enyediakan cawan petri yang akan dibuat goresan
b. )embagi cawan petri menjadi " bagian
c. +se steril yang telah disediakan, dilekatkan dengan sumber
isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan
yang berisi media steril. 1oresan dapat dilakukan (-" kali
membentuk garis hori2ontal di satu sisi cawan.
d. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose
tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya
pada sisi cawan kedua. 3angkah ini dilanjutkan hingga
keempat sisi cawan tergores.
e. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni
tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan
sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula
selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak
tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap
hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi
kontaminasi.
:.! Penanaman kultur dari stok -hasil isolasi mikroba rongga mulut.
dengan metode cawan tuang -pour plate.
a. Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam
beberapa ml a6uadest sesuai dengan dilusi yang
dikehendaki.
b. Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi
dengan telapak tangan selama beberapa kali.
c. Pipet media agar cair yang telah dipanaskan dengan suhu
kurang lebih :4
o
*
d. Pindahkan pipet yang berisi media agar cair ke dalam
tabung reaksi tadi.
e. Aduk kembali campuran tadi dengan cara memutar tabung
reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali.
'. ,uang larutan yang berada dalam tabung reaksi ke dalam
cawan petri sebanyak kurang lebih 1 ml.
g. $nkubasi dengan posisi terbalik dengan suhu dan waktu yang
sesuai dengan jenis bakteri.
h. Amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut.