3.

DASAR TEORI
A. Penanaman Mikroorganisme (Bakteri)
Populasi mikroba di alam sangat besar dan kompleks. Alam sekitar baik
udara, tanah, air juga dihuni oleh mikroba. Penelitian mikroba dalam berbagai
habitat memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran atau biakan
campuran yang rumit ini menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan
murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari
satu sel induk. Bahan yang dinokulasikan pada medium disebut inokolum.
Dengan menginokuasikan medium dengan teknik goresan yaitu menggoreskan
inokulum di atas media menggunakan ose, sel-sel itu akan terpisah-pisah sendiri.
Setelah inkubasi sel-sel mikroba memperbanyak diri dalam waktu 1-!" jam
terbentuk massa sel yang disebut koloni. Piaraan murni yang disimpan lama
mudah sekali mengalami mutasi. #ika terjadi demikian maka piaraan murni
tersebut bukan lagi piaraan murni semula. $ni berarti tipe asli telah hilang. %ntuk
menghindarkan atau paling sedikit mengurangi terjadinya mutasi dalam piaraan
simpanan maka &
1. Secara periodik piaraan harus dipindahkan ke medium baru. Pemindahan
ini sebaiknya dilakukan pada koloni mencapai 'ase log.
!. Piaraan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi.
(. )ikroba dilio'ilisasikan yaitu dimasukkan dalam ampul berisi susu kering
bercampur *+! kemudian disimpan pada tempat bersuhu rendah.
Sesungguhnya kebanyakan laboratorium mikrobiologi menyimpan dan
memelihara koleksi biakan tersebut. ,he American ,ype *ulture *ollection
-A,,*. yang ada di /ashington memelihara ribuan spesies mikroba termasuk
0irus.
Dalam mengembangbiakan mikroorganisme, khususnya bakteri, alat-alat
yang digunakan harus steril. Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh
alat, seperti cawan petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autocla0e. )embiakkan
bakteri dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah satunya pengembangbiakan
dalam media cawan petri. Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa
metode, yaitu &
1. )etode cawan gores -steak plate.
)etode cawan gores cukup sulit bagi pemula. Bertujuan untuk
mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur
ke dalam medium baru. Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni
yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah
proses isolasi. *ara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi (-
" bagian. +se steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat,
kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril.
1oresan dapat dlakukan (-" kali membentuk garis hori2ontal di satu sisi
cawan. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut
digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua.
3angkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode
ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan
berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak
tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan
secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi. ,eknik penanaman dengan
goresan -streak. bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari
campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.
a. 1oresan sinambung
Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu
sampai setengah permukaan agar, lalu putar cawan 145* lanjutkan
goresan sampai habis. 1oresan sinambung umunya digunakan bukan
untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke
cawan atau medium baru.
b. 1oresan ,
Bagi cawan menjadi ( bagian menggunakan spidol marker, inokulai
daerah dengan streak 2ig-2ag. Panaskan jarum inokulan dan tunggu
dingin kemudian lanjutkan streak 2ig-2ag. *awan diputar untuk
memperoleh goresan yang sempurna.
c. 1oresan kuadran -streak6uadrant.
7ampir sama dengan goresan ,, namun berpola goresan yang berbeda
yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroorganisme. 1oresan selanjutnya
dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah
semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
*ara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi (-" bagian.
+se steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat,
kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril.
1oresan dapat dilakukan (-" kali membentuk garis hori2ontal di satu
sisi cawan. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose
tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi
cawan kedua. 3angkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan
tergores. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni
tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua,
koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga
didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain.
Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tidak
terkontaminasi.
!. )etode cawan tuang -pour plate.
)etode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan
ketrampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. )etode ini
dilakukan dengan mengencerkan isolat yang telah diketahui beratnya ke
dalam 8 ml garam 'isiologis -9a*3 4.:;. atau larutan bu''er 'os'at.
3arutan ini berperan sebagai penyangga p7 agar sel bakteri tidak rusak
akibat menurunnya p7 lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa
kali agar biakan yang didapat tidak terlalu padat atau memenuhi cawan
-biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan.. Sekitar 1 ml
suspensi dituang ke dalam cawan petri, dilanjutkan dengan menuangkan
media penyubur -nutrien agar. steril hangat -"4-:45*. kemudian ditutup
rapat dan diletakkan dalam inkubator -(<5*. selama 1-! hari. Penuangan
dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi
kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan
-di laboraturium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang,
seperti Penicilium dalam biakan.. )edia yang dituang hendaknya tidak
terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan -media panas
sebabkan tangan jadi panas juga., media panas masih mengeluarkan uap
yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses
pengamatan. Pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar.
=ultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat
kemudia diletakkan dalam inkubator.
(. )etode cawan sebar -spread plate.
Pada metode cawan sebar, 4,1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan
disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya,
suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar koloni
tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan
dalam inkubator -(<5*. selama 1-! hari. )etode ini cukup sulit terutama
saat meratakan suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh
merata, biakan justru terkontaminasi. +leh karena itu, batang drygalski
harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu
dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat,
batang drygalski, yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen,
dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu
dengan meletakkannya di sekitar api bunsen ->1: cm.. Dengan metode ini,
satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri.
Satu koloni yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe
pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap
konsistensi, bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan koloni.
B. Penghitungan jumlah akteri
Penghitungan jumlah bakteri dengan berdasarkan jumlah koloni termasuk metode
pengukuran secara tidak langsung. %ntuk melakukan perhitungan jumlah bakteri
berdasarkan jumlah koloni -plate count. harus memperhatikan syarat-syarat
sebagai berikut&
1. #umlah koloni tiap cawan petri antara (4-(4.444 koloni, jika memang
tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati (44.
!. ,idak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan petri,
dikenal sebagai spreader.
(. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-turut
antara pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari ! hasilnya
dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari ! yang dipakai jumlah mikroba dari
hasil pengenceran sebelumnya.
Beberapa langah dalam melakukan pengenceran untuk menghitung jumlah koloni,
dapat terlihat beberapa perbedaan hasil baik dari penampakan warna saat
pengenceran sampai jumlah koloni mikroba yang didapatkan. ,ujuan dari
pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat
pengenceran bergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1&8 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1&14 sel
mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya.
Pada saat melakukan pengenceran maupun pemindahan ke petridish harus
dilakukan secara aseptis suapaya saat melakukan pemindahan sample dari tabung
reaksi satu ke lainnya tidak terkontaminasi oleh mikroba jenis lain yang tidak
diinginkan. ,eknik yang digunakan untuk memindahkan bahan makanan yang
telah diencerkan pada seri pengenceran 14
-1
-14
-"
digunakan teknik pour plate, hal
ini dilakukan menyebarkan sel-sel mikroba tidak hanya pada permukaan agar saja
melainkan sel terendam agar -di dalam agar -9A.. sehingga terdapat sel yang
tumbuh dipermukaan agar yang kaya +
!
dan ada yang tumbuh di dalam agar yang
tidak begitu banyak mengandung oksigen.
Setelah penanaman mikroba ke dalam petridish, selanjutnya melakukan
inkubasi dengan menggunakan inkubator agar mikroba dapat tumbuh dengan baik
pada suhu yang optimum untuk pertumbuhan yaitu sekitar (<5*. setelah !" jam
didapatkan sejumlah mikroba yang tumbuh di medium. 7asil perhitungan didapat
dengan perhitungan koloni mikroba yang ada dalam petridish.
!. Prose"ur #erja $
".1 )etode *awan 1ores -Streak Plate.
Alat dan bahan &
.a +se
.b Api bunsen
.c 3arutan Alkohol
.d *awan petri yang berisi media steril
".! )etode *awan ,uang -Pour Plate.
Alat dan bahan &
.a 8 ml garam 'isiologis -9a*l 4,:;. ? larutan bu''er 'os'at
.b 1 ml suspensi
.c )edia penyubur -nutrien agar.
.d *awan petri steril
.e $nkubator
".( )etode *awan Sebar -Spread Plate.
Alat dan bahan &
.a 4,1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan
.b )edia penyubur steril
.c Batang drygalski
.d $nkubator
.e 3arutan alkohol
.' Api bunsen
.g +se
"." Prosedur praktikum &
a. Setiap mahasiswa melakukan penanaman kultur dari stok -hasil
isolasi mikroba rongga mulut. dengan metode cawan tuang -pour
plate. dan goresan kuadran -streakquadrant..
b. )elakukan penipisan seri dan cara menghitung kuman.
%. Pengamatan $
,ahap 1 & Pembuatan 1oresan =uadan -streakquadrant.
a. )enyediakan cawan petri yang akan dibuat goresan
b. )embagi cawan petri menjadi " bagian
c. +se steril yang telah disediakan, dilekatkan dengan sumber isolat,
kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan yang berisi
media steril. 1oresan dapat dilakukan (-" kali membentuk garis
hori2ontal di satu sisi cawan.
d. +se disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut
digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan
kedua. 3angkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan
tergores.
e. Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni
tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi
kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya,
sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan
koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik
agar tak terjadi kontaminasi.
:.! Penanaman kultur dari stok -hasil isolasi mikroba rongga mulut.
dengan metode cawan tuang -pour plate.
a. Pipet beberapa ml kultur bakteri campurkan ke dalam beberapa ml
a6uadest sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.
b. Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan
telapak tangan selama beberapa kali.
c. Pipet media agar cair yang telah dipanaskan dengan suhu kurang
lebih :4
o
*
d. Pindahkan pipet yang berisi media agar cair ke dalam tabung reaksi
tadi.
e. Aduk kembali campuran tadi dengan cara memutar tabung reaksi
dengan telapak tangan selama beberapa kali.
'. ,uang larutan yang berada dalam tabung reaksi ke dalam cawan
petri sebanyak kurang lebih 1 ml.
g. $nkubasi dengan posisi terbalik dengan suhu dan waktu yang sesuai
dengan jenis bakteri.
h. Amati pertumbuhan koloni bakteri tersebut.