ISOLASI DAN KARAKTERISTIK

Methanobacterium ruminantium
I solasi Dari Kultur Murni
Medium padat disiapkan dengan menambahkan agar ke medium cair yang
mengandung E. coli, natrium piruvat, dan 0,003 persen natrium dithionite. Medium ini
diinokulasi dengan pengenceran cairan kultur 5 X 10
-9
ml darikeseluruhan isi rumen. Setelah
inkubasi pada 39
0
C koloni yang dikembangbiakan dalam tabung menunjukkan penurunan
tekanan. Walaupun koloni telah diIsolasi dari pengenceran yang tinggi tetapi subkultur yang
terkontaminasi dengan Clostridium masih tidak bisa dihilangkan. Artinya isolasi untuk
mendapatkan kultur murni dengan cara ini dinyatakan gagal
Cara kedua cairan rumen segar kembali diinokulasikan ke dalam pengenceran cair.
Sepuluh hari setelah inokulasi pembentukan metana ditunjukkan oleh peningkatan pesat
perubahan dalam tabung diinokulasi yaitu 5 X 10
-9
ml isi rumen. Semua bakteri yang
mengkontaminasi kecuali E. coli dapat dihilangkan oleh subkultur melalui beberapa seri
pengenceran agar.
Diasumsikan bahwa E. coli berkurang pada medium selama pertumbuhannya pada
piruvat karenasel tereduksi. Baru setelah itu bisa dilakukan pengujian. Tabung medium kultur
yang mengandung E. coli diinkubasi pada 39 C selama 12 jam. Bakteri lain dihilangkan
dengan cara merendam tabung dalam bak air pada 75 C selama 45 menit.. Sebuah koloni
yang telah terisolasi dari E. coli diencerkan sampai kesterilan 30 persen air kaldu dan tabung
diinokulasi dengan 0,1 ml dari tepat pengenceran. Setelah inkubasi pada 39 C, koloni yang
terbentuk dan metana diberi dalam pengenceran tinggi. Pengenceran tersebut dapat
menghilangkan E. coli, meninggalkan koloni metanogen terdiri dari nonmotile batang gram-
positif dengan ujung bulat.
Kemurnian meningkat dengan subkultur koloni yang terisolasi dalam agar seri
pengenceran.. Kemurnian selanjutnya diuji dengan inokulasi ke Brucella kaldu (Albimi), agar
anaerobik (BBL), Eugon agar (BBL), dan menengah thioglycolate (BBL). Brucella kaldu
diinkubasi di kondisi aerobik dan kondisi anaerobik, sedangan media lain hanya anaerob.
Tabung-tabung yang diperiksa setiap hari selama satu bulan, tapi dalam hal ini tidak adalah
pertumbuhan yang diamati.

Karakteristik
A. Kesedian Substrat
Tabung dari agar rumen disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya kecuali pada fase gas adalah
10 persen hidrogen, 20 persen karbon dioksida, dan 70 persen helium. Setelah sel-sel E. coli mati,
larutan substrat uji disuntikkan ke dalam tabung untuk memberikan konsentrasi akhir 0,5 persen.
Asam organik ditambahkan sebagai larutan dari garam natrium. Setelah itu Tabung diinokulasi dan
diinkubasi sampai koloni dapat dideteksi. Lalu Diinkubasi dua minggu dan kemudian
metana dianalisis menggunakan uap Perkin Elmerfractometer. Hasilnya ditunjukkan sebagai berikut

Tabung kontrol dengan 80 persen hidrogen menunjukkan pertumbuhan yang lebih daripada
eksperimental tabung dengan 10 persen hidrogen. jumlah metana yang terbentuk di diinokulasi
pada tabung kontrol tanpa substrat uji dengan syarat dengan jumlah yang diharapkan dari 10
persen hidrogen ditambah hidrogen dan format yang dihasilkan dari piruvat oleh E. coli. Analisis ini
tabung menunjukkan bahwa sebelum inokulasi, telah mengandung sekitar 0,02 persen format.
metana dalam tabung dengan format tambah melebihi jumlah dalam kontrol tetapi kurang dari yang
diharapkan jika semua format ditambahkan dikonversi menjadi metana menurut persamaan
4 HCOOH +CO2 CH4 + 4CO2 + 2H20.
Pengujian tambahan dilakukan menggunakan 0,25 dan 0,50 persen natrium
format dengan hasil yang ditunjukkansebagai berikut .


Analisis menunjukkan bahwa bagian dari formate ditambahkan akan menghilang. Hasil ini
menunjukkan kegunaan format sebagai substrat .

B. Morfologi.
Organisme ini berbentuk batang pendek lebar 0.7, mikron dan panjang 0,8-1,8 mikron ,bentuk
ujung nya hampir bulat, spora tidak ada, dapat memanfaatkan hidrogen dan asam formiat sebagai
substrat teroksidasi. Ditunjukkan pada gambar 1.

C. faktor pertumbuhan
Suhu ph dan oksigen mempengaruhi pertumbuhan
Ph optimum untuk tumbuh 6,5 sampai 7.0
Suhu optimum untuk tumbuh 39 derajat celsius
Oksigen menyebabkan terjadinya penghambatan reaksi metabolk

D. Distribusi
Semua koloni metanogen di awal inokulasi dengan pengenceran tinggi dari isi rumen
menyerupai kultur murni dalam pewarnaan , Reaksi Gram, dan morfologi sel.
Koloni metanogen dapat mudah dibedakan dari koloni nonmethanogenic dengan
terus meningkatnya ukuran koloni pada hidrogen dan karbon dioksida. Tambahan Kultur
murni yang tidak terisolasi karena keterbatasanwaktu yang diperlukan.

Bakteri yang mirip dengan biakan murni tumbuh dalam pengenceran tinggi cairan rumen dari
dua berfistula sapi jantan, satu di Washington,dan satu di Davis. organisme
juga diperoleh dari 5 X 10-6 ml rumen. 7 hari antara penghilangan sampel
dan inokulasi ke dalam tabung kultur dapat menjelaskan untuk menghitung kultur terendah.
Hasil menunjukkanbahwa organisme luas didistribusikan.
E. Klasifikasi
Atas dasar morfologi dan kemampuan untuk membentuk metana organisme ini dimasukan
ke genus Methanobacterium. Empat spesies Methanobacterium seperti ; M.
formicicum (Schnellen, 1947), M. Propionicum (Stadtman dan Barker, 1951), M. sohngenii
(Barker, 1936), dan M. suboxydans (Stadtman dan Barker, 1951). Dari jenis tersebut , hanya
M. Formicicum telah diperoleh dalam kultur murni. Methanobacterium ruminantium
menyerupai M. formicicum dalam memanfaatkan formate tetapi berbeda dalam morfologi
sel, morfologi koloni, Reaksi Gram, pigmentasi, dan jangkauan suhu.
Pembahasan jurnal
Kesulitan terbesar dalam kultur M. Ruminantium adalah untuk mengecualikan oksigen.
Tekanan oksigen awal harus cukup rendah untuk memungkinkan potensi redoks
dalam kisaran yang benzil viologen (Eo ', pH 7, -359 mv) berkurang. Hanya metode
pemberian tingkat rendah berhasil. hasil ini mendukung hipotesis bahwa potensi redoks
rendah sangat penting untuk pertumbuhan metanogen bakteri.Sensitivitas terhadap oksigen
menghalangi perkembang biakan M. ruminantium dalam jumlah besar dipakan. Kelimpahan
di isi rumen menunjukkan bahwa bakteri sebenarnya tumbuh di tempat itu.
Dalam mengevaluasi pentingnya M. Ruminantium dalam rumen kemungkinan metanogenesis
oleh bakteri lain harus dipertimbangkan. Karena semua strain diuji dapat menggunakan H2
dan CO2, hipotesis sederhana adalah bahwa setiap kehidupan di rumen juga dapat
menggunakan substrat tersebut. Hipotesis bahwa hidrogen dan karbon
dioksida adalah substrat utama sehingga menimbulkan metana dalam rumen didukung oleh
Fakta: hidrogen dan karbon dioksida diproduksi oleh banyak kultur murni bakteri rumen
(Hungate, 1950, 1957, Bryant dan small, 1955a, 1955b), tapi sangat sedikit muncul sebagai
tujuan produk(produk akhir) dalam rumen (Lugg, 1938); hidrogen ditambahkan
dan karbon dioksida dengan cepat dikonversi metana oleh isi rumen diinkubasi (Carroll
dan Hungate, 1955), konversi format ke metana melalui hidrogen dan karbon
dioksida (Carroll dan Hungate 1955, Doetsch et al. 1953), dan M. ruminantium aktif
memanfaatkan hidrogen dan karbon dioksida. Karena ketiadaan bukti bahwa substrat
lainnya yang berkontribusi secara langsung produksi metana dalam rumen dapat
disimpulkan bahwa jalur utama pembentukan metana adalah reduksi karbon dioksida
dengan molekul hidrogen. HIdrogen dan karbon dioksida sebagai substrat
disimpulkan bahwa itu memainkan penting peran dalam produksi metana dalam rumen.