A.

DASAR TEORI

Kromatografi adalah metode pemisahan yang berkaitan dengan perbedaan dalam

keseimbangan distribusi dari komponen-komponen sampel di antara dua fase yang
berbeda, yaitu fase bergerak dan fase diam. Komponen contoh hanya dapat berpindah
tempat di dalam fase gerak. Tingkat migrasi adalah suatu fungsi dari distribusi seimbang.
Distribusi komponen A, B, dan C pada fase diam dan fase gerak
Keseimbangan distribusi sampel

di antara kedua fase ditunjukkan

oleh nilai

koefisien distribusi (K).

K = [As]
[Am]
As = konsentrasi fasa diam
Am = konsentrasi fasa gerak
Pemisahan dapat terjadi apabila koefisien distribusi komponen sampel berlainan
(KA KB KC ). Komponen dengan nilai K lebih besar akan terpisah lebih lambat
daripada komponen dengan nilai K lebih kecil
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia, Michael
Rswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara
perlokasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelasyang berisi kalsium karbonat
(CaCO3). Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan 2 fase
yaitu gerak dan diam serta mengkuantifikasi macam-macam komponen dalam suatu
campuran yang kompleks, baik komponen organik mauapun anorganik.1
Kromatografi dapat diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahannya misalnya
kromatografi

adsorpsi,

afinitas,

penukar

ion,

dsb.

Kromatografi

juga

dapat

diklasifikasikan berdasarkan alat yang digunakan seperti Kromatografi Kertas (KK),

Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan
Kromatografi Gas (GC).
Dalam kromatografi juga dikenal istilah kromatografi jenis planar dan kolom.
Kromatografi planar menggunakan fase diam berupa lempeng tipis yang umumnya
terbuat dari kaca, lempeng alumunium dan sebagainya. Yang termasuk kromatografi
planar yaitu kromatografi kertas (KK) dan kromatografi lapis tipis (KLT).

1 Gholib, Ibnu.. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. 2007

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan murah dibandingkan
dengan kromatografi kolom. Demikiann juga peralatan yang digunakan. Dalam
kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan hampir semua
laboratorium melaksanakan metode ini. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase diamnya
berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh
lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik.
Fase diam pada KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel
antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase diam, semakin baik kinerja
KLT dalam hal efisien dan resolusinya. Penyerap yang paling sering digunakan adalah
silica dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama adalah pada KLT
yaitu adsorpsi dan partisi. Untuk tujuan tertentu, penyerap atau fase diam dapat
dimodifikasi dengan cara pembaceman.
Fase gerak dari pustaka dapat ditentukan dengan uji pustaka atau dengan dicoba-coba
karena pengerjaan KLT ini cukup cepat dan mudah. Sistem yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran ini dapat diatur sedemikian rupa
sehingga pemisahan dapat terjadi dengan optimal. Dalam pembuatan dan pemilihan fase
gerak yang harus diperhatikan yaitu

kemurnian dari eluen itu sendiri karena KLT

merupak teknik yang sensitif; daya elusi dari pelarut itu juga harus diatur sedemikian rupa
agar harga Rf berkisar antara 0,2-0,8 yang menandakan pemisahan yang baik; polaritas
dari pelarut juga harus diperhatikan agar pemisahan terjadi dengan sempurna.
Analisis Kuantitatif
Ada 2 cara yang digunakan untuk menganalisis secara kuantitatif dengan KLT.
1.

Bercak yang terbentuk diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan

ukur luas atau dengan teknik densitometri.
Dengan dasar adanya hubungan antara luas bercak dengan banyaknya
senyawa terlarut maka senyawa dapat diukur kadarnya dengan mengukur luas
bercak. Cara dibedakan lagi:
a. Tanpa menggunakan kurva baku Menurut Purdy & Truter: akar luas bercak
berbanding lurus dengan logaritma(lO) berat senyawa yang ada. Untuk
menghitung dengan cara ini maka perlu dibuat tetapan untuk senyawa pada
sistem yang tertentu.
b. Menggunakan kurva baku. Dibuat kurva hubungan kadar dan luas bercak
dari senyawa murni pembanding. Akan diperoleh persamaan garis lurus Y =

2.

bX + a. Selanjutnya luas bercak sampel dapat dihitung. Adapun urutan kerja

dapat disusun sbb :
1. Dibuat larutan mengandung senyawa murni yang akan dianalisis
dengan 3 macam konsentrasi yang diketahui.
2. Dibuat larutan sample pada kadar tertentu sehingga setelah dielusi
memberikan bercak yang bulat (ideal).
3. Ke 4 larutan ( 1 sampel, 3 lart baku) ditotolkan secara duplo pada
lempeng yang sama (20X20 cm). Perlu diperhatikan: - penotolan tegak
lurus dengan alat suntik mikro, gelas kapiler. - banyak larutan 5-10 pi.
- sekali penotolan saja dengan volume yang sama.
4. Lempeng dielusi / dikembangkan sampai jarak yang telah ditentukan
(10- 20cm) didalam bejana yang dijenuhi fase gerak. Kemudian
ditampakkan/ divisualisasikan degan cara yang sesuai.
5. Luas bercak diukur pada alat densitometer. Dibuat kurva hubungan
kadar dan luas kemudian dibuat persamaan garis lurus. Kadar senyawa
dalam dapat ditetapkan.
Mengorek bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak
tersebut dengan menimbang hasil korekan.
Cara ini akan memberikan ralat yang timbul karena memindahkan / mengerok
dan elusi. Ditentukan letak bercak dengan cara yang tidak merusak, mengerok
bercak beserta fase diam, kemudian diekstraksi dengan alat yang diperoleh
diukur kadarnya dengan spektrometri atau cara lain yang sesuai. Urutan kerja
dapat disusun sebagai berikut:
1. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, demikian juga senyawa murni
(pembanding) dilarutkan dalam pelarut yang sama dengan pelarut untuk
sample.
2. Banyak sample yang ditotolkan harus diketahui dengan tepat.
3. Dikembangkan secara biasa dan divisualisasikan dengan cara yang tidak
merusak.
4. Bercak yang dikehendaki diberi tanda dengan alat tajam, dibandingkan
dengan bercak baku.
5. Bercak beserta fase diam dikerok kemudian dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai secara kuantitatif.
6. Larutan yang diperoleh bila perlu diuapkan dibawah rotary evaporator
dimasukkan ke dalam labutakar, ditetapkan kadarnya dengan cara yang
sesuai.

Analisis Kualitatif

Identifikasi secara kualitatif pada kromatografi kertas khususnya kromatografi lapis

tipis dapat ditentukan dengan menghitung nilai Rf. Nilai Rf merupakan ukuran kecepatan
migrasi suatu senyawa. Harga migrasi (hRf) = Rf x 100 sedangkan harga Rf didefinisikan
sebagai perbandingan antara jarak senyawa titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari
titik awal.2

Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang
mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan
kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah.
B. PRINSIP KERJA

Pada dasarnya kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan yang didasarkan atas
distribusi difrensial komponen sampel diantara dua fase (fase gerak dan fase diam) yang
menggunakan kertas lapis tipis. Pada dasarnya kromatografi lapis tipis ini mirip dengan
kromatografi kertas. Hanya perbedaan dengan KLT dengan kromatografi kertas adalah kertas
diganti dengan lembaran kaca atau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben pada
proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam.3 Pada proses pemisahan dengan menggunakan
Kromatografi Lapis Tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak,
di mana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan fungsi senyawa organik yang akan
didentifikasi yang telah berinteraksi dengan fase geraknya. Kesetimbangan ini mempunyai
beberapa faktor diantaranya sebagai berikut :
1. Kepolaran fase diam
2. Kepolaran fase gerak
3. Serta kepolaran dan ukuran molekul4
Pada prinsip kromatografi lapis tipis terjadi yang di namakan eluent. Eluent adalah
fase gerak yang berperan penting dalam pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk
melewati fase diam (adsorbent) Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi
dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut
ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan
2 Marzuki, Asnah.. Kimia Analisis Farmasi. Makassar: Dua Satu Press. 2013
3 Winarni.2007.Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. UNNES: Semarang
4 Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis
silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar
dari ikatannya dengan alumina (gel silika).5
Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan satu
macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran
pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut
organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan
polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah
terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya,
senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang
polar.

Pelarut organik yang sering digunakan pada pelarut organik :

Non polar
Parafin cair
Petroleum eter
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluena
Kloroform
Polar :
Air
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
Fase Diam
5 http://ndrasendana.blogspot.com/2013/12/kromatografi-lapis-tipis.html

Sebagai fasa diam adalah KLT yng terbuuat dari serbuk halus dengan berukuran 5
sampai 50 mikrometer. Serbuk ini dapat berupa adsorben, penukar ion. Suatu pengayak
molekul dapat merupakan penyangga yang dilapisi suatu cairan.
Keuntungan dari KLT adalah :
1. Dapat menggunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil (makro
maupun mikro)
2. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen
3. Proses pemisahannya dapat dilakukan dalam waktu yang relatif singkat
4. Harga murah dan lebih sederhana6
Metode kromatografi terus perkembang dengan peralatan yang berkembang yang lebih
modern hasil yang lebih selektif, akurat, dan digunakan sampel yang sangat kecil.
Pada dasarnya prinsip kerja pada kromatografi lapis tipis sama saja dengan prinsip
kerja pada kromatografi kertas. Tetapi perbedaannya terdapat pada alatnya saja, kromatografi
kertas menggunakan kertas sebagai fasa diamnya akan tetapi pada kromatografi lapis tipis
menggunakan bahan silika gel.
C. PROSEDUR KERJA

Tahap-tahap pada kromatografi lapis tipis, yaitu

:
1. Tahap penotolan
Cuplikan bahan mula-mula disiapkan kromatogarfi lapis tipis, dengan ukuran
tertentu, kemudian di garis bawah dan garis atat dengan ukuran 2-3 cm dengan
menggunakan pensil. Setelah itu ditotolkan menggukan pipa kapiler atau
mikropipet pada garis awal, kemudian dikeringkan.
2. Pada tahap pengembangan
Ujung kromatografi lapis tipis yang terdapat dekat garis awal yang telah terisi
totolan cuplikan dicelupkan ke dalam pelarut (eluen) yang terdapat dalam
bejana pengembang.
Diperhatikan pada saat pencelupan diusahakan tidak merendam totolan
cuplikan atau garis awal. Eluen dibiarkan merembes melewati totolan cuplikan.
Komponen culikan akan terbawa oleh rembesan fasa gerak. Perbedaan kelarutan
komponen cuplikan dalam eluen akan mengakibatkan kecepatan bergerak
(migrasi defensial) komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Hasil
pemisahannya akan tampak sebagai noda-noda berwarna pada kromatogarfi
lapis tipis dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Noda-noda disebut
kromatogra. Perembesan dihentikan setelah eluen hampir mencapai ujung kertas
selanjutnya diberi tanda batas gerakan eluen dan kromatografi lapis tipis
diangkat dari cairan, kemudian dikeringkan
3. Pada tahap identifikasi atau penampakan noda
6 Winarni.2007.Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. UNNES: Semarang

Jika noda sudah berwarna dapat langsung diperiksa san ditentukan harga Rf
nya. Rf adalah singktan dari Rato of Flow yaitu derajat retensi suatu
komponen dalam fase diam. Rf disebut juga retensi atau referensi. Rf dihitung
sebagai jarak yang ditempuh sebagai komponen yang terbagi dengan jarak yang
ditempuh oleh eluen (fasa gerak) sebagai berikut :
Jarak yang ditempu h komponen
Rf =
Jarak yangditempu h eluen
Setiap komponen mempunyai Rf sendiri-sendiri, yang dapat ditentukan
dengan menggunakan zat baku.7
D. APLIKASI KLT
Contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan
dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti
poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga
dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki. Setiap komponen
memiliki harga Rf sendiri-sendiri, dengan bantuan dari sinar ultraviolet maka dapat ditentukan noda
yang tidak tampak oleh kasat mata. Cara yang biasa dilakukan dengan menyemprotkan KMNO4
dalam H2SO4 yang kemudian akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara
kimia maupun berdasarkan kelarutan membentuk warna-warnatertentu. Noda kemudian dihitungharga
Rf-nya. Harga Rf dihitung dengan menggunakan perbandingan jarak yang ditempuh solut dengan
jarak yang ditempuh fase gerak. Nilai maksimum Rf adalah 1 dan nilai minimumnya 0. Dengan
menggunakan silika gel sebagai fase diam, harga Rf 1 menunjukkan jika senyawa tersebut sangat
nonpolar sedangkan harga Rf 0 menunjukkan bahwa senyawa tersebut sangat polar.8

7 Winarni.2007.Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. UNNES: Semarang

8 Sendana Erda, http://ndrasendana.blogspot.in/2014/06/kromatografi-lapis-tipis-klt.html?m=1 (diakses
tanggal: 29-10-2014)