PENGUKURAN SEL BAKTERI DAN PEWARNAAN BAKTERI SECARA

GRAM

LAPORAN
UNTUK MEMENUHI TUGAS MATAKULIAH
Mikrobiologi
yang dibina oleh
Dr. Endang Suarsini, M.Ked dan Agung Witjoro, S.Pd, M. Kes

Oleh :
Kelompok 2 / Off C
Ananda Iza Mahendra
Annisa Rachma
Daysi Wulandari
Delonix Regia
Winda Meliawati

(120341421955)
(120341421944)
(120341421931)
(120341421944)
(120341421963)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
PROGRAM PENDIDIKAN BIOLOGI
September 2014

A. Topik :
Pengukuran Sel Bakteri dan Pewarnaan Gram dan Pewarnaan Bakteri Secara
Gram
B. Hari / Tanggal Praktikum :
Selasa, 9 September 2014
C. Tujuan:
a. Agar Mahasiswa bisa melakukan pewarnaan gramm
b. Agar mahasiswa dapat megidentifikasi bakteri biakan berdasarkan
pewarnaan gram
c. Untuk memperoleh keterampilan menera skala mikrometer okuler
d. Untuk mengukur sel bakteri
D. Dasar Teori:
1. Rewarnaan Bakteri dengan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan
yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri.
Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan
berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan
pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air
fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian

Gram (18531938)

tahun 1884 untuk

membedakan

yang

mengembangkan

antara pneumokokusdan

teknik

ini

pada

bakteri Klebsiella

pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua
kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram
positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif
akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin
atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh
perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada
tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu

bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya sehingga pengecatan gram

tidak bisa dilakukan

pada

mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
a. Struktur

dasar

(dimiliki

oleh

hampir

semua

jenis

bakteri)

Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan

granula penyimpanan
b. Struktur

tambahan

(dimiliki

oleh

jenis

bakteri

tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan

endospora

2. Pengkuran Sel Bakteri

Bakteri dapat diperoleh dari mana-mana, misal dari rongga mulut, dari
sela-sela gigi, dari tanah yang banyak sampah-sampah, dari sisa-sisa makanan
yang sudah basi, biasanya kita mengadakan pemiaraan dulu dalam cawan petri
yang berisi zat makanan atau medium. Asalkan medium itu dibiarkan begitu saja
terbuka, maka sehabis 24 jam akan kita dapati berpuluh-puluh koloni bakteri dan
jamur (cendawan) menutup permukaan medium tersebut. Rebusan kentang yang
sudah dikuliti ataupun jenang-dodol dapat kita pergunakan sebagai medium yang
sederhana. Koloni cendawan/kapang dapat segera dibedakan dari koloni bakteri,
koloni cendawan itu memperlihatkan benang-benang miselium. Koloni bakteri
nampak sekelumit mentega, air susu atau percikan sari buah yang kental. Nama
bakteri itu berasal dari kata Bakterion (bahasa Yunani) yang berarti tongkat atau
batang. Sekarang nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme
yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berbiak dengan
pembelahan diri, serta demikian kecilnya sehingga hanaya nampak dengan
bantuan mikroskop (Dwidjoseputro, 1990).
Bentuk dan ukuran sel bakteri bervariasi, ukurannya berkisar 0,4-2 m.
Bentuk sel bakteri dapat terlihat di bawah mikroskop cahaya, dapat berbentuk
kokus atau bulat, basil atau batang, dan spiral. Bentuk sel kokus terdapat sebagai

sel bulat tunggal, berpasangan atau diplokokus, berantai atau streptokokus, atau
tergantung bidang pembelahan, dalam empat atau dalam kelompok seperti buah
anggur (stapilokokus). Bentuk sel berupa batang biasanya bervariasi, memiliki
panjang mulai dari batang pendek sampai batang panjang yang melebihi beberapa
kali diameternya (Kusnadi: 2003).
Beberapa bakteri memiliki bentuk yang berbeda dari bentuk umumnya
bakteri seperti di atas, tetapi lebih mirip dengan struktur hifa dari jamur (fungi).
Struktrur bakteri dalam kelompok ini dimasukan dalam kelompok aktinomiset
yang tubuhnya serupa hifa atau filamen dan menghasilkan spora. Bakteri
kelompok aktinomiset terkenal karena dapat menghasilkan senyawa antimikroba
berupa antibiotika, seperti: Streptomyces menghasilkan antibiotik streptomisin.

Gambar 1. Bentuk umum sel dan rangkaian sel bakteri (Sumber: Milton R.J.
Salton dan Kwang-Shin Kim, dalam Kusnadi 2003)

E. Prosedur Praktikum
1. Menera Mikroskop
Siapakan mikroskop,
pastikan dapat digunakan
dengan baik

Pasanglah micrometer okuler

pada bagian mikroskop yang
biasa dipasang lensa okuler

Pasanglah micrometer
objektif pada meja
mikroskop

Aturlah garis skala

micrometer okuler dan
objektif sehingga berada
pada satu garis lurus

Amatilah garis skala yang

ditunjukkan pada micrometer
okuler yang berada pada
garis lurus dengan skala
micrometer objektif

2. Mengukur Sel Bakteri

Lepaskan micrometer
objektif pada meja
mikroskop

Pasanglah sediaan bakteri

pada meja mikroskop
dengan alas kaca preparat

Aturlah posisi sel bakteri

sehingga berada bidang
micrometer okuler

Ukurlah panjang sel dan

diameter sel dalam satuan
millimeter berdasarkan skala
micrometer okuler dan skala
micrometer objektif

3. Pewarnaan gram bakteri

Sediakan kaca benda bersih,kemudian difiksasi diatas
nyala api spiritus dengan menggunakan
pinset,kemudian biarkan dingin.

Teteskan akuades steril 1 kolong jarum inokulasi

Ambil bakteri dari biakkan murni dengan

menggunakan kawat inokulasi lurus kemudian ratakan
di kaca benda

Biarkan sedian bakteri mongering sendiri,kemudian

lakukan fiksasi dengan panas api lampu spiritus

Lakukan pewarnaan dengan menggenangi sediaan

menggunakan reagen ammonium oksalat Kristal violet
selam 3 menit

Bilaslah dengan air keran yang emngalir kemudian

keringkan dengan menekan kertas hisap

Genangi sedian dengan iodium Selma 1 menit,bilas

lagi dengan air kran, lalu keringkan

Genangi sedian di dalam etanol 95% selama 30

detik,kemudian keringkan dengan kertas hisap

Genangi sediaan dengan safranin selama 30 detik

kemudian bilas dengan air kran dn keringkan dengan
keras hisap

Amati persedian yang telah kering dengan perbesaran

lemah kemudian menggunakan perbesaran kuat

F. Data
1. Data pewarnaan gram
Pada praktikum pewarnaan gram bakteri semuanya termasuk bakteri jenis gram
positif dengan menunjukkan warna ungu
2. Data pengukuran Bakteri
Perbesaran 40x10
1 sok=2,5 m
Pada bakteri yang telah diamati, menunjukkan skala okuler adalah 4, sehingga
ukuran panjang bakteri bisa ditentukan
4 sok = 4 x 2,5 m
= 10 m
diameter bakteri = 2 m

G. Analisis Data
1. Pewarnaan Gramm
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial yang membedakan
bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri gram positif yang mengikat zat pewarna
pertama dan bakteri gram negatif yang melepas zat warna pertama dan mengikat
zat warna kedua. Pada praktikum pewarnaan gram bakteri dengan menggunakan
teknik burke. Reagen pewarna gram yang digunakan terdiri dari amonium oksalat
kristal violet, safranin, iodium, alkohol 95%. Pewarnaan dikenakan pada sel
bakteri yang telah difiksasi diperoleh dari data bahwa semua bakteri menunjukkan
termasuk bakteri jenis gram positif dengan menunjukkan warna ungu.
2. Pengukuran Bakteri
Pengukuran sel bakteri dilakukan menggunakan mikrometer okuler yang
sudah ditera sebelumnya. Hasil peneraan diketahui untuk perbesaran 40 x 10 dari
mikrometer objektif yang 4 garis dengan garis skala 1 dari mikrometer obyektif.
Sehingga diperoleh harga 1 skala mikrometer okuler yang digunakan adalah 2,5
m.
Dalam praktikum kali ini dipilih hanya satu jenis bakteri

yang diukur,

dikarenakan hasil pembiakan mikroba pada media hanya terdapat satu jenis. Dari
hasil pengukuran bakteri yang menggunakan mikroskop dengan skala perbesaran
40 x 10 diperoleh perhitungan sebagai berikut:
Perbesaran 40 x 10
1 sok = 2,5 m
Pada satu koloni bakteri ditunjukkan bahwa skala okulernya 4 sehingga
didapat ukuran:
4 sok = 4 x 2,5 m
= 10 m
Dari hasil perhitungan diatas dapat diketahui bahwa panjang 1 koloni bakteri
yang diamati berukuran 10 m. Dan dari hasil penglihatan juga ditemukan bahwa
diameter bakteri tersebut 2 m.

H. Pembahasan
a. Pewarnaan gram
Sesuai dengan tujuan dari praktikum pewarnaan bakteri secara gram ini yaitu
untuk memperoleh ketrampilan pewarnaan sel bakteri secara gram dan untuk
menentukan atau mengidentifikasi sifat gram dari bakteri yang diwarnai.
Pewarnaan sel bakteri secara gram merupakan pewarnaan differensial yang
membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu, bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Pengelompokkan ini berdasarkam kemampuan bakteri mengikat zat
pewarnanya, disebut gram positif jika dapat mengikat zat pewarna pertama
(berwarna ungu) dan disebut gram negatif jika melepas zat pewarna pertama dan
mengikat zat pewarna kedua (merah), menurut pengujian dengan teknik
pewarnaan Hucker.
Berdasarkan analisis data yang diperoleh, koloni yang ditemukan dengan
bentuk basil setelah proses pewarnaan terlihat berwana ungu. Hal ini berarti
koloni bakteri pertama memiliki sifat gram positif. Pada pewarnaan gram ini
digunakan beberapa zat pewarna. Zat pewarna adalah senyawa kimia berupa
garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan
positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk
membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan
memberikan warna yang berbeda. Perbedaan warna ini yang akan digunakan
sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua
golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat
warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka
disebut zat warna asam (Rudi, 2010).
Dalam praktikum pewarnaan secara gram digunakan empat reagen yaitu :
a. Reagen Ammonium Oksalat Kristal Violet yang digunakan sebagai zat
pewarna utama,
b. Larutan Iodin yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama,
c. Alkohol 95% yang merupakan solven organik berfungsi sebagai zat untuk
mencuci atau melunturkzn zat pewarna utama

d. Reagen safranin yang merupakan zat pewarna kedua, digunakan untuk

mewarnai kembali sel-sel bakteri yang telah kehilangan cat utama setelah
perlakuan denga alcohol.

Bakteri gram positif adalah bakteri yang dapat mempertahankan warna

utama yaitu ungu meskipun setelah dicuci atau dilunturkan dengan menggunakan
alkohol 95%. Sedangkan bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak dapat
mempertahankan zat pewarna utama (ungu) setelah dicuci dengan alkohol
sehingga ia akan mengikat warna yang diberikan setelah proses pencician atau
pelunturan denga alkohol 95% selesai.
Dalam proses pewarnaan secara gram diperlukan kaca benda yang bersih
dan steril. Setelah itu juga digunakan aquades untuk melarutkan biakan bakteri
yang dioleskan secara tipis pada permukaan kaca benda. Jika sudah kering,
dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi
dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan
bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Setelah itu dilkukanlah
proses pewarnaan dengan menggunakan 4 reagen yang telah ditentukan.
Pemberian ammonium oksalat kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme
pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi
dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative
mengandung lemak dengan prosentase lebih tinggi dan memiliki dinding sel yang
tipis.

Pemberian

alkohol

(etanol)

pada

praktikum

pewarnaan

bakteri,

menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding

sel. Kemudian zat warna safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel
menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram
positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori
mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna
safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Rudi, 2010).
Berdasarkan data yang diperoleh, koloni biakan bakteri yang diwarnai
(pada kelompok 3) menunjukkan wanra ungu yang mengindikasikan bahwa
koloni bakteri yang diamati tergolong bakteri gram positif. Perbedaan dasar antara

bakteri gram positif dan negatif terletak pada komponen dinding selnya. Dinding
sel bakteri berfungsi melindungi kerusakan sel dari lingkungan bertekanan
osmotik rendah dan memelihara bentuk sel. Bateri gram positif dinding selnya
relatif tebal yang sensitif terhadap lisozim. Lisozim adalah enzim yang
memutuskan ikatan -1,4-glikosida antara asam-N-asetil glukosamin dengan
asam-N-asetil muramat pada peptidoglikan sehingga dapat merusak dinding sel
bakteri. Protein dan polisakarida menyokong lapisan substruktur dinding sel.
Bakteri gram negatif menunjukkan tiga lapis pembungkus sel yaitu membran luar,
lapisan tengah yang merupakan dinding sel (lapisan murein) dan membran plasma
dalam. Membran luar mengandung fosfolipin, lipopolisakarida yang diketahui
sebagai antigen permukaan O somatik atau endotoxin, dan berbagai protein,
dimana protein (porin) dan lipoprotein jumlahnya sangat banyak. Peptidoglikan
bakteri gram negatif merupakan struktur tipe A. Diikat molekul lipoprotein secara
kovalen (Kusnadi, 2003).
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel

dan membran

sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari

dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan
hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi
peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm) (Rudi, 2010).
b. Pengukuran Sel bakteri
Ukuran sel-sel mikroorganisme sangat kecil sekali dan tidak dapat diamati
dengan mata tanpa memakai atau menggunakan alat pembesar (Tarigan, 1988).
Untuk itu dalam praktikum pengukuran sel bakteri ini kami menggunakan alat
bantu berupa mikroskop. Mikroskop yang digunakan berupa mikroskop cahaya.
Mikroskop cahaya merupakan mikroskop yang umum digunakan di laboratorium
untuk mengamati berbagai jenis mikroba. Mikroskop ini mempunyai 2 perangkat
lensa yaitu lensa okuler dan lensa obyektif dan menggunakan cahaya sebagai
sumber iluminasi.Sebelum dilakukan pengukuran sel bakteri, dilakukan peneraan
pada mikroskop yang digunakan. Setelah proses peneraan pada mikroskop yang
digunakan oleh kelompok 3 menunjukkan pada perbesaran 40x10 didapatkan nilai
SoK = 2,5 m.

Ukuran besar bacteria bervariasi, tergantung dari spesiesnya. Rata-rata

ukuran diameter dan panjang bakteri pathogen yang berbentuk batang kira-kira
0,5 m dan 2 m, sedangkan bakteri non pathogen yang berbentuk batang dapat
mencapai diameter 4 m dan panjangnya 20 m (Tarigan, 1988). Sedangkan
menurut Kusnadi (2003), bentuk dan ukuran sel bakteri bervariasi, ukurannya
berkisar 0,4 2,0 mm. Bentuk sel bakteri dapat terlihat di bawah mikroskop
cahaya, dapat berbentuk kokus (bulat), basil (batang), dan spiral. Pada koloni
yang kami amati yang kami lakukan, ditemukan bakteri dengan bentuk basil yang
memiliki diameter sekitar 2 mm dan pada mikroskop menunjukkan panjang
bakteri yaitu 4 mm. Dan setelah dilakukan penghitungan dengan menggunakan
skala yang telah dilakukan peneraan ditemukan bahwa bakteri tersebut memiliki
panjang 10 m. pengukuran yang dilakukan hanyalah dengan mengukur diameter
dan panjang dari bakteri saja karena bakteri yang terdapat pada biakan bakteri
kelompok 3 merupakan koloni bakteri dengan bentuk basil.

I. Kesimpulan
1. Hasil peneraan micrometer okuler diketahui untuk perbesaran 40 x 10,
harga 1 skala mikrometer okuler yang digunakan adalah 2,5 m.
2. Pada satu koloni bakteri ditunjukkan bahwa skala okulernya 4 sehingga
didapat ukuran bakteri sebesar :
4 sok = 4 x 2,5 m
= 10 m
J. Diskusi
Diskusi pewarnaan gramm
1. Identifikasi biakan murni dari bahan yang saudara buat dengan sifatnya
terhadap pewarnaan gram !
Semua bakteri yang kami amati positif pada pewarnaan gram
2. Apa yang menyebabkan golongan bakteri bersifat gram positif sedangkan
gram lainnya bersifat negative ?
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak
dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
3. Jelaskan mekanisme perubahan warna yang terjadi !
Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi
warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga
mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan
perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan
meninggalkan warna ungu muda.

Diskusi pengukuran bakteri

1. Adakah perbedaan ukuran sel bakteri yang sudah saudara amati ?
Mengapa ?
Ada, perbedaan ukuran sel bekteri yang digunakan diperoleh dari

perbedaan perbesaran yang digunakan, masing-masing perbesaran lensa

mikroskop akan menujukkan perbedaan ukuran bakteri yg diamati.
2. Mengapa pengukuran pada perbesaran 1000x ditambahkan minyak emersi
? apa fungsi minyak emersi ?
Supaya objek yang sedang kita amati dapat terlihat lebih jelas, karena
minyak emersi tersebut memiliki fungsi untuk menaikan indeks bias
cahaya sehingga objek dapat terlihat lebih jelas.

3. Mengapa bakteri yang diukur harus berumur 1x24jam ?

Karena 24jam merupakan usia yang baik untuk memperlihatkan bentuk
morfologi bakteri tersebut, namun jika ingin melihat bakteri yang
membentuk spora bisa memelihara bakteri lebih lama lagi sekitar 2 3x24jam.

DAFTAR RUJUKAN

Dwidjoseputro, 1990. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

Kusnadi, dkk. 2003. Common textbook (Edisi revisi) Mikrobiologi. Bandung:
Universitas Pendidikan Indonesia.
Tarigan, Jeneng. 1988. Pengantar mikrobiologi. Jakarta: Depertemen Pendidikan
dan Kebudayaan- Proyek pengembangan lembaga pendidikan tenaga
kependidikan.