prinsip kerja KCKT:

pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, dengan

alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya
Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :
1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar
fase gerak, fase diam, dan sampel.
2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.
Jadi : Zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,
karena solut melewati kolom kromatografi

 Fungsi KCKT :
Pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, seny. Biologis, analisa ketidak
murnian (impurities), seny. Non volatile ,
molekulnetral, ionik, zwitter ion, isolasi dan
pemurnian senyawa, pemisahan seny. Yang
strukturnya hampir sama, trace elemen
(semkelumit).

Bagan

Fase normal : fase diam lebih polar dari

fase gerak.
Biasanya kemampuan elusi meningkat dg
meningkatnya polaritas pelarut

 Fase terbalik : fase diam kurang polar dari

fase gerak.
Kemampuan elusi menurun dg meningkatnya
polaritas pelarut.

Fase gerak
Fase gerak memiliki syarat-syarat :
- murni, tanpa cemaran
- tidak bereaksi dengan kemasan
- sesuai dengan detektor
- dapat melarutkan cuplikan
- mempunyai viskositas rendah
- memungkinkan memperoleh dengan mudah
cuplikan

Fase Gerak u/ kolom konvensional

1. HK + pel terklorinasi atau alkohol (fase normal)
2. Untuk fase terbalik (reversed phase) : Metanol atau
asetonitril+ air atau buffer
3. Kecepatan alir : 1-3 ml/menit

Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera
adanya komponen cuplikan di dalam eluen
kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor
yang baik sangat peka, tidak banyak berderau,
rentang tanggapan liniernya lebar dan
menanggapi semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detektor :
- UV / vis

Kolom konvensional
Tabung : Stainless steel pjg 3; 10; 15; 25 cm
Diamteter luar: 0,25 inci, Diameter dalam 4,6 mm
Tek operasional 500-300psi (35-215 bar)
Fase Diam : Porous, Silika ukr kecil, Si bonded phase, polimer
stiren/divenil benzen. Rata-rata partikel 3,5-10 um
Kinerja : efisiensi meningkat dg berkurangnya ukuran partikel
fase diam, namun ukuran aprtikel 3 um lebih pendek
Kolom mikrobor
Tabung : Stainless steel pjg 25; 50 cm
Diamteter luar: 0,25 inci, Diameter dalam 1-2 mm
Tek operasional 1000-5000psi (70-350 bar) Silika ukr kecil, Si
bonded phase, polimer stiren/divenil benzen. Rata-rata
partikel 3,5-10 um.
Kinerja : Sangat efisien dan sensitif, nqmun lambat. Konsumsi
fase gerak hanya dari kolom konvensional

Jenis KCKT
1. Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan menggunakan fase normal dan fase diam silika gel
dan alumina. Pada silika dan alumina ini ada gugus Oh yang
berinteraksi dengan solut, shg solut vterikat kuat dan
akibatnya terjadi TAILING (puncak yang berekor).
Fase diam dipasaran :
Silika ; Partisil, Porasil C, Hypersil, Sorbax Sil, Vydac HS, -Porasil
Alumina : Micro Pal AL, Spherisorb, Lichrosorb ALOX
2. Kromatografi Partisi ( k. fase terikat) : Si nya dimodifikasi
secara kimia (fase terikat)
3. Kromatografi penukar ion: memakai fase diam yg dapat
menukar kation dan anion dg suatau gfase gerak. Penukar
kationnya : polistiren resin
4. Kromatografi Eksklusi ukuran, fase diam Si atau polimer porus
yg dapat melewati porus (lewat diantara partikel)

Deret eluotropik pelarut hplc

Pelarut
N-heksan
Sikloheksan
Tetraklormetan
Metilbenzen
Triklorometan
Diklorometan
Tetrahidrofuran
Propanon
Asetonitril
sopropanol
Etanol
Metanol
Asam etanoat
Air

UV cut off (nm)

195
200
265
285
245
230
212
330
212
330
190
205
205
255
170

UV cut-off (nm) = pemenggalan UV

Nilai pemenggalan UV mrpk pjg gel dimana pada

kuvet 1cm, pelarut memberikan absorbansi
lebih dari 1 satuan absorbansi.
Jadi jangan pakai panjang gel pemenggalan yg
dipunyai fase gerak.

Fase Diam KCKT

Kelarutan-

Kepolaran

Kolom

Sistem