PENETAPAN ALFA AMINO NITROGEN METODE TNBS

Pendahuluan
Metode ini dapat diterapkan untuk bahan pangan hewani. Jika diterapkan
pada bahan pangan yang banyak mengandung karbohidrat maka perlu membuat
blanko.
Metode ini dapat juga digunakan untuk menetapkan kadar protein ekstrak
lipid, asam amino bebas dalam cairan biologis dan untuk menggambarkan sidik
jari (fingerprints) tryptic peptide
Prinsip
Pada pH 8, asam trinitrobenzensulfonat bereaksi dengan gugus alfa amino
bebas komponen bernitrogen berbobot molekul rendah menghasilkan senyawa
berwarna yang dapat diukur absorbansinya pada 340 nm.
Peralatan
1. Penangas air yang dilengkapi stirrer, heater, kontrol suhu 40 C, dan
Spektrofotometer
Pereaksi
Larutan asam 2, 4, 6 trinitrobenzensulfonat (TNBS) 0,1 % (w/v), larutan
buffer, pH 8,2. Disiapkan dengan mencampurkan 50 mL Na2HPO4.12 H2O 4%
(w/v) dengan 1,8 mL Na2HPO4.H2O 4 % (w/v), HCl 1 N, larutan glisin standar.
Dibuat dengan melarutkan 100 mg Glisin murni dalam akuades, tepatkan menjadi
1 L.
Cara Kerja
Pembuatan Kurva Standar
1. Encerkan larutan glisin standar sehingga menghasilkan sederet larutan
yang mengandung 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; dan 15,0 g Glisin/mL.
2. Pipet 1 mL masing-masing larutan ke dalam tabung reaksi 20 mL bertutup.
Tambahkan 1 mL larutan buffer dan 1 mL larutan TNBS. Campurkan
merata, tutup rendam dalam penangas 40 C selama 2 jam.
3. Tambahkan 1 mL HCl 1 N dan ukur absorbansinya pada 340 nm (gunakan
akuades sebagai blanko)
4. Buat kurva standar

Penetapan Sampel
1. Larutkan 1 mL ekstrak malt wort atau bir menjadi 100 mL dengan
akuades. Tambahkan 1 mL buffer dan 1 mL larutan TNBS. Perlakuan
sampel dan blanko selanjutnya sma seperti pada pembuatan kurva standar.
Perhitungan
Alfa-amino Nitrogen (mg/100 mL) =
Ekivalenglisin x 10.000 x
-

14
, dimana :
75

Ekivalen glisin didapat dari kurva standar

14 = berat atom Nitrogen
75 = bobot molekul Glisin.