Gabungan Gugus Hemoglobin-Albumin Pt

Nanopartikel: Pembawa O2 buatan dengan aktivitas Antioksidan

Abstrak
Sebuah gugus protein terstruktur terdiri dari hemoglobin (Hb) di central dan
Albumin serum manusia (HSA) di perifer, Hb-HSAm, adalah pembawa O2 buatan
yang dapat berfungsi sebagai pengganti sel darah merah. Di sini kita dijelaskan
penyusunan gugus Hb-HSA3 dengan kegiatan antioksidan dan kompleks O2 yang
stabil dalam larutan H2O2. Kami menggunakan pendekatan menggabungkan
nanopartikel Pt (PtNP) ke dalam unit diluar gugus HSA. Sebuah sitrat berkurang
PtNP (diameter 1,8 nm) yang terikat erat dalam celah bebas HSA dengan konstanta
mengikat (K) dari 1,16107 M21, menghasilkan kompleks stabil HSA-PtNP. Protein
platinated ini menunjukkan aktivitas katalitik yang tinggi untuk dismutasi dari anion
superoksida radikal (N2O) dan hidrogen peroksida (H2O2), yaitu, superoksida
dismutase dan aktivitas katalase. Juga, Hb- HSA3 ditangkap PtNP ke unit albumin
eksternal (K = 1,16107 M21), menghasilkan gugus Hb-HSA3 (PtNP). Asosiasi PtNP
ini tidak menimbulkan perubahan muatan permukaan protein dan afinitas
pengikatan O2. Di perifer, HSA-PtNP mencegah oksidasi inti Hb, yang
memungkinkan pembentukan kompleks O2 yang sangat stabil, bahkan dalam
larutan H2O2
Pengantar
Hemoglobin (Hb) berbasis O2 (HBOCs) telah dipelajari secara ekstensif sebagai pengganti sel-sel
darah merah (sel darah merah)yang dapat di transfusi dan sebagai terapi oksigen[1-5]. Namun
demikian, tidak ada memenuhi semua persyaratan untuk digunakan dalam situasi klinis[6,7].
Sebuah efek samping yang umum adalah hipertensi ringan yang dihasilkan dari deplesi nitrat
oksida (NO) oleh karena Hb yang menyebar ke ruang ekstravaskuler [8,9]. Sebenarnya, NO
adalah berasal dari factor endotel yang diturunkan. Selain itu, HBOCs menunjukkan autoksidasi
Hb lebih cepat
ke bentuk heme besi (metHb) daripada Hb asli[10-12]. Autoksidasi Hb menghasilkan
superoksida radikal
anion (O2N-), yang tidak proporsional untuk hidrogen peroksida (H2O2) [13]. Spesies oksigen
reaktif (ROS) menghasilkan oksidasi Hb. Di RBC, sistem antioksidan termasuk superoksida
dismutase (SOD) dan katalase, yang dikatalisis untuk mengubah O2 dan H2O2, dan dengan
demikian dapat melindungi fungsi Hb. dalam reperfusi iskemik ketika jaringan iskemik reperfusi
dengan O2, xanthine oksidase akan mengubah xanthine dan hipoksantin ke O2[14-16].
Kelebihan produksi O2 dan kemudian H2O2 tidak hanya menyebabkan cedera jaringan, tetapi
juga oksidasi lebih lanjut dari Hb.
Akibatnya, dalam situasi klinis yang melibatkan iskemia-reperfusi, HBOC dengan aktivitas
antioksidan diperkirakan akan sangat berguna. Chang et al, pertama kali disintesis polyHb-SODkatalase konjugasi dan menunjukkan pengurangan autoksidasi pada Tingkat Hb [17]. Kluger et
al, melaporkan bahwa pembentukan metHb terhambat dan didefinisikan secara struktural Hb-

SOD dimer [18]. Silaghi-Dumitrescu et al, siap kopolimer Hb dengan rubrerythrin, non
enzim besi heme [19]. Ini Hb- (enzim antioksidan) konjugat
ditampilkan O2 tercatat dan sifat antioksidan.
Namun, enzim tertentu yang diperlukan untuk mengais-ngais individu
ROS, dan denatures secara bertahap.
Baru-baru ini, kami disintesis inti-shell kovalen terstruktur
klaster protein yang terdiri dari Hb di pusat dan serum manusia
Albumin (HSA) di pinggiran, Hb-HSAm (m = 2, 3, 4), yang
bertindak sebagai HBOC unik (Gambar 1) [20]. Karena HSA hanya berisi
satu thiol cysteinyl pada posisi 34, kami dieksploitasi heterobifunctional
crosslinker, N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethy) sikloheksana-1karboksilat (SMCC), sebagai penghubung antara Cys-34 residu
HSA dan kelompok e-amino lysyl permukaan Hb. utama
produk adalah heterotetramer Hb-HSA3 dalam bentuk segitiga dengan
HSA-binding nomor (m) dari tiga. HSA, yang paling menonjol
protein plasma, menunjukkan permeabilitas yang rendah di pembuluh darah yang
dinding karena tolakan elektrostatik antara negatif
albumin permukaan dibebankan [titik isoelektrik (pI): 5.0] dan glomerulus
membran basal sekitar sel-sel endotel [21]. dari
perspektif fisiologis ini, muatan bersih permukaan HbHSAm cluster memuaskan negatif (pl: 5,1-5,2) [20]. melalui pembuluh darah
transfusi cluster Hb-HSAm diharapkan untuk mengaktifkan sirkulasi jangka panjang tanpa
ekstravasasi. Selain itu, mungkin
tidak menimbulkan peningkatan tekanan darah yang tidak menguntungkan.
Jika salah satu mampu memberikan sifat antioksidan pada eksternal
HSA unit Hb-HSAm, maka membangun ini akan menjadi
menjanjikan operator O2 dengan daya tahan tinggi terhadap oksidasi
reaksi. Dalam konteks ini, kami memilih Pt nanopartikel (PtNP) sebagai
calon potensial. PtNPs telah banyak diteliti untuk
berbagai aplikasi, seperti sintesis kimia, sel bahan bakar
rekayasa, dan perawatan biomedis. Dilaporkan bahwa PtNP
adalah katalisis sangat efektif untuk kedua O2
N- dan H2O2
dismutations (Gambar 1) [22-24]. (i) ROS pembilasan tinggi
kegiatan PtNP tergantung pada luas permukaan yang lebih besar per relatif massa
untuk partikel besar [22,23]. (ii) Hampir tidak ada sitotoksisitas diamati
bahkan setelah sel patuh terkena PtNPs [23]. Kami memiliki
menemukan bahwa PtNP kecil (diameter 1,8 nm) yang dimasukkan ke dalam
HSA, dan memperoleh kompleks HSA-PtNP menunjukkan SOD dan
Kegiatan katalase dengan efisiensi tinggi. The Hb-HSA3 juga
memiliki kemampuan mengikat PtNP ke luar HSA
shell. Resultan Hb-HSA3 (PtNP) klaster membentuk O2 sangat stabil
kompleks, bahkan dalam larutan H2O2 berair (Gambar 1). buatan ini
O2 operator, memiliki fungsi tiga (O2 transportasi, O2

Ndismutasi, H2O2 dismutasi) mungkin berguna dalam klinis

kondisi dengan iskemia-reperfusi. The Hb-HSA3 (PtNP) klaster
akan memberikan O2 ke jaringan iskemik, dan secara bersamaan
melindungi Hb dan jaringan dari kerusakan akibat cedera reperfusi.

Bahan dan Metode

Bahan dan alat
Albumin serum manusia (HSA) yang dibeli dari Jepang Darah
Organisasi Produk. Sapi murni Hb dimurnikan dari bovine
darah dibeli dari Tokyo Shibaura Zouki Co, Ltd [20].
Hidrogen hexachloroplatinate (IV) hexahydrate (H2PtCl2N6H2O),
xanthine, dan katalase (dari hati sapi) yang dibeli dari
Wako Pure Chemical Industries Ltd Ferricytochrome c (Cyt c.,
dari hati sapi) dibeli dari Sigma-Aldrich Co
Xantin oksidase (XOD, dari susu mentega) dibeli dari
Oriental Ragi Co, Ltd Mn (III) -terakis (N-methylpyridinium)
porfirin (Mn-TMPyP) dibeli dari Frontier Ilmiah
Bahan kimia Corp lain dari nilai khusus digunakan tanpa lebih lanjut
pemurnian. Air itu ionisasi (18,2 MVcm) menggunakan air
sistem pemurnian (Elix UV dan Milli Q Referensi; Millipore
Corp.). Isoelektrik fokus (IEF) dilakukan dengan menggunakan
power supply elektroforesis (EPS 601; GE Healthcare Inggris
Ltd) dengan gel IEF (Novex pH 3-10; Invitrogen Corp.). itu
penanda protein yang digunakan adalah kalibrasi IEF kit Luas pI (pH 3-10;
GE Healthcare UK Ltd).
Sintesis PtNP
Sitrat-dikurangi PtNP disiapkan seperti yang dijelaskan dalam laporan
dari sebuah studi oleh Obligasi et al. [25]. Untuk berair direfluks
Solusi H2PtCl2N6H2O (271 mM, 85,5 ml), 1% berat trisodium
dihidrat sitrat dalam air (4,5 ml) ditambahkan dan kemudian direfluks
terus menerus selama 1 jam dengan pengadukan. Solusinya berubah menjadi gelap
coklat. Setelah pendinginan perlahan ke 25uC, solusi PtNP yang diperoleh
dicuci dengan air menggunakan ultrafilter (Q0100, 10 kDa MWCO; Advantec Toyo
Kaisha Ltd) dalam ultraholder UHP-76K.
Akhirnya, media terkonsentrasi hingga 50 mM sebagai
PtNP menggunakan ultraholder UHP-76K. Resultan PtNP koloid
larutan disimpan dalam lemari es di 4uC.
Persiapan Hb-HSA3 klaster

The Hb-HSA3 klaster dibuat menurut sebelumnya kami

melaporkan prosedur dengan beberapa modifikasi [20]. Biasanya, sebuah
Solusi DMSO dari crosslinker heterobifunctional, N-succinimidyl
4- (N-maleimidomethy) sikloheksana-1-karboksilat (SMCC; Tokyo
Chemical Industry Co, Ltd) (20 mM, 4 ml) ditambahkan tetes demi tetes
menjadi fosfat buffered saline (PBS) solusi (pH 7,4) dari karbonil
Hb (0,1 mM, 40 mL), dan campuran diaduk selama 3 jam di
gelap di 4uC. Setelah menghapus crosslinker bereaksi dengan filtrasi gel
kromatografi (GFC) dengan Sephadex G25 (prima) kolom,
yang diperoleh SMCC-terikat Hb (maleimide diaktifkan Hb) adalah
terkonsentrasi ke 40 mL ([Hb] = 0,1 mM) menggunakan sentrifugal yang
konsentrator (Vivaspin 20 ultrafilter, 10 kDa MWCO; GE
Kesehatan UK Ltd.). Kemudian larutan ini ditambahkan perlahan-lahan ke
solusi PBS dari HSA (1 mM, 40 mL) dengan pengadukan selanjutnya dalam kondisi
gelap selama 14 jam pada 4uC. Sebagian dari campuran reaksi
diaplikasikan pada kromatografi ukuran-eksklusi (SEC) pada HPLC
Sistem (LaChrom Elite, Hitachi High-Technologies Corp) dengan
Shodex Protein KW-803 kolom (Showa Denko KK) menggunakan
penyangga fosfat (PB, pH 7,4, 50 mM) sebagai fase gerak. itu
kurva elusi dipamerkan beberapa puncak baru pada molekul tinggi
daerah berat badan. Tiga komponen utama yang diidentifikasi sebagai HbHSA4 heteropentamer (minor), Hb-HSA3 heterotetramer, dan
Hb-HSA2 heterotrimer [20]. Maka solusi yang dihasilkan adalah
mengalami GFC dengan Superdex 200 pg di XK50 / 60 kolom
(GE Healthcare UK Ltd) menggunakan PBS (pH 7,4) sebagai menjalankan
penyangga. Kami mengumpulkan semua fraksi utama sebelum puncak HSA. itu
bereaksi bebas HSA dikeluarkan sepenuhnya. Dengan Hb dan jumlah
tes protein [20], rata-rata rasio HSA / Hb yang dipanen
Hb-HSAm klaster ditemukan 2,8-3,2, yang diindikasikan sebagai
Hb-HSA3. Akhirnya, solusi Hb-HSA3 yang diperoleh kental
([Hb] = 5 g / dL) menggunakan Vivaspin 20 ultrafilter (30 kDa MWCO)
dan disimpan dalam lemari es di 4uC.
pengukuran CD
Melingkar dichroism (CD) spektrum diperoleh dengan menggunakan
spectropolarimeter (J-820; Jasco Corp.). Konsentrasi sampel
adalah 0,2 mM di PBS. Cuvettes kuarsa dengan ketebalan 10 mm yang
digunakan untuk pengukuran 2002250 nm.
Persiapan HSA-PtNP kompleks dan Hb-HSA3 (PtNP)
gugus
Medium larutan PtNP ditukar ke PBS (pH 7,4)
menggunakan Vivaspin 20 ultrafilter (10 kDa MWCO). Sebuah solusi PBS

HSA (0,51 mM, 0,1 mL) ditambahkan perlahan-lahan ke solusi PtNP

(10.2 mM, 5 ml, PBS), dan campuran diinkubasi selama 1 jam
dengan pengadukan lembut dalam gelap di 25uC, menghasilkan HSA-PtNP
kompleks (PtNP / HSA = 1/1). Demikian pula, solusi Hb-HSA3
(0,51 mM, 0,2 mL, PBS) ditambahkan ke dalam larutan PtNP
(10.2 mM, 10 mL, PBS). Kemudian campuran diinkubasi selama
1 jam dengan pengadukan lembut dalam gelap di 25uC, affording HbHSA3 (PtNP) cluster (PtNP / Hb-HSA3 = 1/1).
Penentuan mengikat konstanta PtNP untuk HSA dan
gugus
Konstanta mengikat (K) dari PtNP untuk HSA dan Hb-HSA3 klaster
ditentukan dengan menggunakan pengukuran fluoresensi pendinginan dari
albumin oleh PtNP titrasi menurut literatur [26].
Fluoresensi HSA atau Hb-HSA3 ([HSA Unit] = 10 mM)
(Em: 340 nm) solusi (PBS, pH 7.4) dipadamkan setelah mengikat
dari PtNP (0-0,3 mM). Plot log (Fo-F) / F vs log [PtNP] adalah
dihasilkan dari data untuk mendapatkan nilai K dan mengikat
nomor.

pengukuran TEM
Tetesan HSA-PtNP ([protein] = 0,35 mg / mL) yang diterapkan
film karbon amorf tertutup grid 200-mesh (Quantifoil
R1 / 4 dengan diameter lubang sekitar 1 mm; Quantifoil
Alat mikro GmbH, Jena, Jerman), yang telah hydrophilized
sebelum digunakan dengan perlakuan plasma (8 W, 60 s) di Baltec sebuah
Med 020 perangkat (Leica Microsystems). Setelah cairan supernatan
itu dihapuskan dengan kertas saring, sebuah uranil asetat berair (1 w / v
%) Diterapkan selama 45 s dan grid akhirnya meninggalkan
udara kering setelah blotting. Kemudian grid dipindahkan ke dalam
Transmisi mikroskop elektron (Tecnai F20 mikroskop
dilengkapi dengan senjata emisi lapangan dioperasikan pada 160 kV
mempercepat tegangan; FEI Co). Gambar direkam menggunakan
Kamera CCD (Elang perangkat 4k-CCD; FEI Co) dioperasikan pada
faktor 2 (2,04862,048 pixel) Binning.
O2
Aktivitas scavenging N- (xanthine-XOD-Cyt. C assay)
O2
Aktivitas scavenging N- (aktivitas SOD) dari HSA-PtNP
kompleks ditentukan dengan menggunakan Cyt. teknik pengurangan c, di
yang O2

N- diproduksi in situ oleh reaksi xanthine-XOD

[27,28]. Percobaan dilakukan sesuai dengan kami
dilaporkan sebelumnya prosedur [29]. Untuk solusi PB (pH 7,8,
50 mM, 3.0 mL) yang mengandung Cyt. c (10 mM), xanthine (50 mM),
dan katalase (500 U / mL) dalam 10-mm panjang jalur kuarsa optik
cuvette, sejumlah XOD cukup untuk memberikan tingkat awal
DA550 = 0,025 min21 (tanpa HSA-PtNP kompleks) (sekitar
2,0 mU / mL) disuntikkan di 25uC. Setelah penambahan XOD,
peningkatan penyerapan pada 550 nm berdasarkan pengurangan bentuk
Cyt. c dipantau di 25uC. Dari peningkatan absorbansi, yang
tingkat awal konstan (vi) ditentukan pada berbagai konsentrasi
Kompleks HSA-PtNP. Nilai IC50 didefinisikan sebagai 50%
Konsentrasi penghambatan Cyt. pengurangan c. Percobaan yang sama
juga dilakukan untuk PtNP dan ASM

Kegiatan H2O2 scavenging (assay peroksida kuantitatif)

Aktivitas scavenging H2O2 (aktivitas katalase) dari HSA-PtNP
kompleks dievaluasi dengan mengukur konsentrasi residu
H2O2 menggunakan Pierce Kuantitatif Peroksida Assay Kit (Thermo
Fisher Scientific Inc). Solusi HSA-PtNP (50 mM, 41 mL)
ditambahkan ke larutan H2O2 (102 mM, 2.0 mL) dalam
botol botol. Kemudian campuran diinkubasi dengan pengadukan lembut di
25uC. Sampel 50 mL dipipet secara teratur dari
campuran reaksi dan HSA-PtNP telah dihapus menggunakan sentrifugal yang
perangkat saringan (MicroCon Ultracel YM-30; Millipore Corp.). kemudian
20 mL filtrat dicampur dengan reagen kerja (200 ml)
dalam lubang piring kultur sel 96-baik. Absorbansi pada 555 nm
berdasarkan (xylenol orange) -Fe (III) kompleks diukur dengan menggunakan
a lempeng Reader (iMark, Bio-Rad Laboratories, Inc.). dari
serapan pada 550 nm, konsentrasi H2O2 sisa dalam
sampel ditentukan dengan menggunakan garis kalibrasi ([H2O2] = 0100 mM) dipersiapkan sebelumnya. Nilai T50 didefinisikan sebagai waktu
diperlukan untuk pendinginan setengah dari H2O2. Percobaan yang sama yang
juga dilakukan untuk PtNP, HSA, katalase, dan Mn-TMPyP.
Properti mengikat O2
Spektrum serapan terlihat deoksi (di bawah N2), oxy (di bawah
O2), dan karbonil (CO di bawah) bentuk dari Hb-HSA3 dan HbHSA3 (PtNP) cluster ([Hb]: 10 mM, PBS, pH 7.4) diperoleh
sesuai dengan prosedur kami dilaporkan sebelumnya menggunakan
Terlihat-UV spektrofotometer (8543; Agilent Technologies Inc)
dilengkapi dengan unit kontrol suhu (89090A; Agilent

Technologies Inc) [20]. The O2 afinitas (P50: O2-parsial tekanan

dimana Hb adalah setengah jenuh dengan O2) dan koefisien Hill (n) adalah
ditentukan dengan menggunakan sistem perekaman otomatis untuk O2keseimbangan
kurva (Hemox Analyzer, TCS Ilmiah Corp) menggunakan PBS
(pH 7,4) di 37uC. Sampel oksigen oleh kian meningkat
O2-parsial tekanan dan terdeoksigenasi dengan menyiram dengan N2

Stabilitas kompleks O2
The O2 stabilitas kompleks cluster Hb-HSA3 dievaluasi
menggunakan konstanta laju autoksidasi orde pertama (kox) dari pusat
Hb. Solusi PBS (pH 7,4) dari oxyHb-HSA3 klaster
([Hb] = 10 mM, 2 ml) dimasukkan ke dalam panjang 10-mm-jalur optik
kuvet kuarsa. Bagian atas kuvet itu disegel dengan gas
permeasi Film (AeraSeal Film MAF710; Gel Co), yang memungkinkan
pertukaran udara dan mencegah penguapan air yang. itu
Intensitas serapan pada 630 nm (At) berdasarkan formasi metHb
dipantau dalam kondisi aerobik di 37uC. setelah
pengukuran, sepenuhnya teroksidasi metHb-HSA3 klaster adalah
disiapkan dengan penambahan sedikit kelebihan K3 [Fe (CN) 3], dan yang
Intensitas serapan (A100) diamati. Dari absorbansi
peningkatan, nilai kox dipastikan menggunakan leastsquares nonlinear
kurva teknik pas. Percobaan yang sama yang
dilakukan untuk asli Hb dan Hb-HSA3 (PtNP) klaster.
The O2 stabilitas kompleks cluster di 20 mMH2O2 solusi
dievaluasi dengan perjalanan waktu tingkat pembentukan metHb
karena mekanisme oksidasi Hb rumit. untuk
solusi PBS (pH 7,4) dari oxyHb-HSA3 cluster ([Hb] = 10 mM,
2 mL) dalam 10-mm-jalan panjang kuarsa kuvet, H2O2 berair
(2 mM, 20 mL) ditambahkan, dan intensitas serapan pada 630 nm
(At) diukur dalam kondisi aerobik dengan pengadukan lembut untuk
180 menit pada 25uC. Bagian atas kuvet itu disegel dengan gas
Film perembesan. Setelah pengukuran, sedikit kelebihan
K3 [Fe (CN) 3] ditambahkan untuk menentukan intensitas penyerapan
bentuk metHb sepenuhnya teroksidasi (A100). Dari absorbansi
peningkatan, tingkat metHb [(At-A0) / (A100-A0) 6100 (%)] (A0:
Intensitas serapan pada 630 nm sebelum injeksi H2O2) adalah
dipastikan. Percobaan yang sama dilakukan untuk asli
Hb, Hb-HSA3 (PtNP) cluster, dan campuran sederhana dari Hb / HSAPtNP /
HSA (1/1/2, rasio molar).

Hasil dan Diskusi

Sintesis dan struktur HSA-PtNP kompleks
Kegiatan enzimatik PtNP telah menarik cukup
perhatian karena aplikasi potensi mereka untuk penggunaan medis
[22-24]. Shirahata et al. melaporkan O2 tinggi
N- dan H2O2
Kegiatan dismutasi dari PtNPs dan reaktivitas enzim tertinggi
pada ukuran partikel sekitar 2,0 nm [23]. Dalam sistem peredaran darah,
kecil PtNP (ca. 2 diameter nm) mungkin ditangkap oleh HSA.
Namun, sifat enzimatik seperti yang didalilkan HSA-PtNP
kompleks belum dilaporkan dalam literatur yang relevan. kita
sekarang memiliki menyiapkan kompleks HSA-PtNP dan telah diperiksa
nya O2
Kegiatan dismutasi N- dan H2O2.
HSA adalah monomer protein berbentuk hati (66,5 kDa) yang terdiri
dari tiga domain homolog (I-III), yang masing-masing berisi dua
subdomain: A dan B (Gambar 2A) [30,31]. Banyak air tidak larut metabolit (asam
lemak, bilirubin, tiroksin, dll) dan umumnya
mengikat obat yang digunakan (warfarin, diazepam, ibuprofen, dll)
ligan prinsip lokasi di subdomain IIA dan IIIA dari HSA mengikat:
disebut-situs obat 1 dan 2 [32]. Untuk menanamkan PtNP ke ini
interior protein, kita siap sitrat-dikurangi PtNP dengan
diameter 1,5-2,0 nm [25]. Gambar TEM jelas menunjukkan
pembentukan PtNPs seragam dengan diameter (d) dari 1,8 nm. itu
Konsentrasi PtNP dihitung sebagai 1,25 mM berdasarkan Pt2 +
konsentrasi dan ukuran partikel. The PtNP berair yang dihasilkan
solusi terkonsentrasi hingga 50 mM menggunakan ultrafiltrasi
perangkat. Media itu ditukar dengan garam fosfat buffer
(PBS, pH 7.4). Tidak ada curah hujan ditemukan selama lebih dari satu tahun di
4uC.
Kompleksasi dari PtNP ke HSA dilakukan dengan menambahkan
HSA untuk solusi PtNP (PtNP / HSA = 1/1). permeasi gel
kromatografi (Sephadex G25) dari protein yang diperoleh ditampilkan
puncak elusi tunggal. Khususnya, gambar TEM menunjukkan
pembentukan kompleks setara dengan HSA dan PtNP
(Gambar 3A). Tutup inspeksi TEM mikrograf mengungkapkan bahwa
setiap PtNP ditampung di pusat protein
(Gambar 3B). Salah satu modus mengikat layak adalah ikatan kovalen
antara residu thiol (Cys-34) dari HSA dan permukaan PtNP.
Namun demikian, nonmercapt HSA, di mana Cys-34 teroksidasi, juga
membentuk kompleks yang sama HSA-PtNP, menunjukkan bahwa kovalen yang
S-Pt obligasi tidak mungkin. Kekuatan lain mungkin mengikat adalah elektrostatik
tarik antara permukaan bermuatan negatif dari PtNP

dan wilayah bermuatan positif dari protein. Berdasarkan

elektrostatik representasi potensi HSA, kami menemukan positif
dibebankan sumbing antara subdomain IIA dan IIIA (Gambar 2B). Di Bahkan,
intensitas emisi fluoresensi solusi HSA (lem:
340 nm) dipadamkan dengan penambahan PtNP. Hal ini disebabkan terutama
oleh perpindahan energi dari triptofan (Trp) -214 residu
subdomain IIA (Gambar 2A) untuk terikat PtNP. dari titrasi
pengukuran [26], yang mengikat konstan (K) dan nomor mengikat
dari PtNP dengan HSA dihitung masing-masing sebagai 1,16107 M21
dan 1.1. Kami beralasan bahwa salah satu PtNP mengikat positif
dibebankan sumbing dari HSA di sisi belakang, menghasilkan 1: 1 HSA-PtNP
kompleks. Solusi protein gelap coklat yang diperoleh stabil
lebih satu tahun di 4uC.

Kegiatan antioksidan HSA-PtNP kompleks

Kegiatan SOD dari kompleks HSA-PtNP dievaluasi dalam
buffer fosfat (PB) solusi menggunakan xanthine- yang (xanthine
oksidase) -ferricytochrome c (Cyt. c) assay [27-29]. Di hadapan
kompleks HSA-PtNP, yang Cyt. Penurunan c oleh O2
N- adalah
dihambat secara signifikan. Nilai IC50 (konsentrasi
enzim yang diperlukan untuk mencapai 50% penghambatan Cyt. pengurangan c)
kompleks HSA-PtNP bertekad untuk menjadi 0,16 mM
(Tabel 1). Dalam kondisi eksperimental kami, pengurangan
Cyt. c tidak ditekan oleh HSA saja. Untuk itu alasan, SOD
aktivitas protein albumin yang dikecualikan. The IC50 HSA-PtNP
Kompleks lebih kecil dibandingkan dengan model terbaik SOD sintetik
Mn (III) -tetrakis (N-methylpyridinium) porfirin (Mn-TMPyP) [29]
dan menyerupai nilai asli Cu, Zn-SOD [33]. Kami menyimpulkan bahwa
kompleks HSA-PtNP memiliki kemampuan yang kuat untuk mengkatalisasi
yang dismutasi O2
N-.
Selanjutnya, aktivitas katalase kompleks HSA-PtNP adalah
diperiksa dengan mengukur dekomposisi H2O2. Di hadapan
HSA-PtNP, konsentrasi H2O2 menurun jauh dan
mencapai nol setelah 180 menit (Gambar 4). Nilai T50 (waktu
diperlukan untuk pendinginan setengah dari H2O2) dari HSA-PtNP adalah 19 menit
(Tabel 1). Di satu sisi, dengan koeksistensi HSA saja,
konsentrasi H2O2 tidak berubah. Hasil ini menyiratkan
bahwa aktivitas katalase dari HSA-PtNP kompleks didasarkan pada
PtNP dalam protein. Sementara nilai T50 setidaknya dua urutan
besarnya lebih besar dari asli katalase, ini platinated

protein menunjukkan aktivitas dismutasi H2O2 jauh lebih tinggi daripada MnTMPyP [34]. Secara keseluruhan, kami menyimpulkan bahwa kompleks HSA-PtNP
menunjukkan kemampuan yang kuat untuk mengkatalisis dismutasi kedua O2
N- dan H2O2

Sintesis dan struktur Hb-HSA3 (PtNP) klaster

The Hb-HSA3 cluster dengan rata-rata rasio HSA / Hb 3,0
disintesis sesuai prosedur kami dilaporkan sebelumnya
dengan beberapa modifikasi (Lihat Bahan dan Metode). ukuran
kromatografi eksklusi (SEC) dari campuran reaksi
SMCC-terikat Hb dan HSA dipamerkan puncak baru Hb-HSA4
heteropentamer (bahu), Hb-HSA3 heterotetramer, dan HbHSA2 heterotrimer (Gambar 5); produk utama adalah Hb-HSA3
(42%). Dengan kromatografi filtrasi gel (GFC), semua cluster
fraksi dipanen bersama-sama (hasil: 80% berdasarkan Hb).
Bereaksi HSA bebas telah dihapus sepenuhnya (Gambar 5). Itu Rata-rata rasio HSA /
Hb bertekad untuk menjadi 2,8-3,2 menggunakan Hb
dan jumlah tes protein. Cluster protein ini ditampilkan sebagai HbHSA3. Pola CD spektral dan intensitas Hb-HSA3
klaster setuju dengan baik dengan jumlah spektrum Hb dan threefold- sebuah
diperbesar HSA spektrum (Gambar 6). Pengamatan ini juga
mendukung rata-rata HSA / Hb sebagai 3 (mol / mol).
Maka solusi Hb-HSA3 ditambahkan perlahan-lahan ke PBS
larutan PtNP, menghasilkan Hb-HSA3 (PtNP) klaster hibrida (PtNP /
Hb-HSA3 = 1/1). Dari pengukuran titrasi [26], nilai K
dan jumlah pengikatan PtNP dengan unit HSA eksterior yang
dipastikan sebagai 1,16107 M21 dan 1.1, yang sama dengan data
diamati untuk HSA gratis. Afinitas PtNP dengan HSA bagian dari
cluster memuaskan tinggi. Meskipun, PtNP dapat mentransfer ke
protein plasma lainnya setelah pemberian intravena. untuk menghindari
antarmolekul seperti bertukar reaksi in vivo, kovalen melampirkan
dari PtNP ke unit HSA akan bermanfaat. isoelektrik yang
Titik (pl: 5.1) Hb-HSA3 adalah tidak berubah oleh PtNP penggabungan.
HSA memiliki muatan bersih permukaan molekul tinggi, sehingga nilai pI
diketahui digeser sedikit oleh ligan mengikat [35]. Dengan demikian, kami
Hasil menunjukkan bahwa PtNP tidak ditaati ke permukaan HSA,
tetapi itu tertanam ke dalam shell HAS.

O2 afinitas dan stabilitas kompleks O2

Penyerapan terlihat pola spektral dari cluster Hb-HSA3
dalam larutan PBS (pH 7,4) di bawah N2, O2, dan suasana CO

(deoksi, bentuk oxy, dan karbonil) yang pada dasarnya sama dengan
orang-orang dari Hb-HSA3 tetramer dan asli Hb (Gambar 7, Tabel 2)
[20,36]. Sebaliknya, solusi PBS Hb-HSA3 (PtNP) klaster
absorbansi yang kuat dipamerkan di seluruh rentang terlihat. sekarang
dianggap berasal dari superposing penyerapan PtNP ke HbHSA3 spektrum. Namun demikian, maxima penyerapan HbHSA3 dan Hb-HSA3 (PtNP) cluster menunjukkan kesepakatan bersama yang baik,
menunjukkan bahwa PtNP tidak menimbulkan silih bergantinya elektronik
negara bagian hemes di Hb (Tabel 2).
P50 (tekanan O2-parsial di mana Hb adalah setengah jenuh dengan
O2) dan koefisien kooperatititas (koefisien Hill, n) Hb-HSA3
cluster (Gambar 8, Tabel 3) yang identik dengan nilai-nilai yang terisolasi
Hb-HSA3 tetramer [20]. Sedang O2 afinitas Hb-HSA3
klaster dibandingkan asli Hb mungkin disebabkan fakta bahwa
Cys-93 (b) residu di Hb diblokir oleh agen silang
SMCC dan Lys-82 (b) dieksploitasi sebagai mitra mengikat
Cys-34 dari HSA [20]. Meskipun demikian, O2 afinitas tinggi mungkin
menguntungkan dalam aplikasi sebagai pembawa O2 potensial. Winslow et al.
menunjukkan bahwa HBOC dengan O2 afinitas menimbulkan rendah
Rilis O2 berlebihan dalam arteriol dan dengan demikian memanggil
vasokonstriksi autoregulatory [37,38]. Intaglietta et al. dilaporkan
yang P50 lebih rendah (10 Torr) RBC menyediakan perbaikan
Fungsi mikrovaskuler dibandingkan dengan P50 yang lebih tinggi (50 Torr)
RBC hemoragik yang terkejut hamster Model [39]. Mengingat
investigasi ini, P50 yang lebih rendah mungkin efektif untuk mengurangi
arteriole O2 transportasi, berpotensi menghilangkan kardiovaskular yang tidak
diinginkan
efek samping.
Kemudian keseimbangan antara O2 dan Hb-HSA3 (PtNP) klaster
diukur untuk mengetahui pengaruh dari PtNP pada afinitas O2.
P50 dan n nilai-nilai Hb-HSA3 (PtNP) klaster yang,
masing-masing, 9 Torr dan 1,5 (Gambar 8, Tabel 3). The O2 mengikat
parameter yang tidak terpengaruh oleh asosiasi PtNP ke HSA
shell. Kami disimpulkan bahwa Hb-HSA3 (PtNP) klaster ditahan dua
manfaat penting bagi RBC pengganti: (i) net permukaan negatif
biaya dan (ii) tinggi O2 afinitas. Data [10,40]. Hebatnya, cluster Hb-HSA3
menunjukkan sama
kox (0,035 H21) dengan yang asli Hb. The oxyHb inti mempertahankan
stabilitas tinggi setelah konjugasi dengan HSA. Fakta ini berbeda dengan
fakta bahwa lainnya HBOCs (pegylated Hb, dipolimerisasi Hb,
silang Hb) menunjukkan kox besar nilai relatif terhadap telanjang Hb [1012]. Kemungkinan penjelasan kompleks O2 stabil cluster kami

adalah efek enwrapping dengan HSA, yang awalnya memiliki suatu

properti antioksidan yang lemah. Seperti dijelaskan sebelumnya dalam laporan ini,
HSA sendiri tidak menunjukkan SOD terukur atau kegiatan katalase di kami
kondisi eksperimental dengan jumlah berlebih besar O2
N dan
H2O2 (Tabel 1). Sebenarnya, HSA dikenal sebagai dominan
antioksidan dalam plasma (in vivo). Blache et al. Diperkirakan bahwa 70% dari
aktivitas perangkap radikal bebas serum dikaitkan dengan HSA
[41]. Otagiri et al. menemukan bahwa kemampuan antioksidan dari HSA
dapat diatribusikan pada enam residu metionin dan Cys-34 [42].
Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa kovalen enwrapping dengan HSA
menstabilkan Hb struktur inti dan memberi antioksidan yang lemah
efek ke hemes di Hb.
Tanpa diduga, nilai kox Hb-HSA3 (PtNP) klaster
(0.039 H21) hampir identik dengan yang diamati untuk Hb-HSA3
dan Hb. Kim et al. disintesis berbagai protein dilapisi PtNPs dan
menganalisis aktivitas ROS pemulungan mereka [24]. mereka menunjukkan
bahwa O2
N- dan H2O2 kegiatan dismutasi dari protein-dilapisi
PtNPs sangat dipengaruhi oleh sifat fisikokimia dan
interior bentuk kerang protein. Dalam Hb-HSA3 (PtNP) cluster,
yang PtNP terikat celah di sisi belakang HSA (Gambar 2B),
sedangkan Cys-34 situs koneksi ke pusat Hb terletak di
sisi depan HSA. Aksesibilitas O2
N- dan H2O2 dari
Hb ke PtNP di HSA shell mungkin dibatasi karena tidak ada
channel diakses ada dalam protein.
Akhirnya, kami meneliti stabilitas kompleks O2 HbHSA3 (PtNP) klaster dalam larutan H2O2 berair. H2O2
konsentrasi dalam darah manusia dianggap puluhan
micromolars (# 35 mM) [43]. Oleh karena itu, tingkat oksidasi HbHSA3 (PtNP), Hb-HSA3, dan Hb dalam air 20 mM H2O2
solusi diperiksa. Kursus waktu absorbansi
meningkat pada 630 nm (yang karena pembentukan metHb) yang
sangat berbeda dalam solusi protein tersebut (Gambar 9). asli Hb
menunjukkan kurva autoksidasi biphasic. Sekitar 50% Hb adalah
teroksidasi dengan cepat dalam tahap awal dalam waktu 30 menit, diikuti oleh
kedua proses oksidasi lambat. The metHb Tingkat formasi
mencapai 72% setelah 180 menit. Hal ini diterima bahwa suatu subunit di
Hb teroksidasi dengan mudah sehubungan dengan b subunit [13]. karena
konsentrasi heme adalah 40 mM ([Hb] = 10 mM), subunit a

oksidasi terjadi pertama, dan selanjutnya b subunit yang

teroksidasi.
Laju pembentukan metHb, bagaimanapun, adalah agak rendah
cluster Hb-HSA3. Pada tahap awal, tingkat metHb
meningkat menjadi 37% dalam waktu 30 menit, diikuti dengan oksidasi lambat
Reaksi. Tingkat rendah ini tampaknya disebabkan pembungkus sebuah
Pengaruh HSA shell. Seperti yang diharapkan, Hb-HSA3 (PtNP) klaster adalah
sangat stabil dalam larutan H2O2. Kami mengamati tidak ada awal
Proses oksidasi dan hanya 17% metHb setelah 180 menit, yang
24% dari nilai asli Hb. Hasil ini berasal dari tinggi
Aktivitas antioksidan unit HSA-PtNP di pinggiran.
Sebenarnya tingkat oksidasi Hb dalam koeksistensi HSA-PtNP
dan HSA (Hb / HSA-PtNP / HSA = 1/1/2), yang tidak kovalen
terkait, lebih tinggi dibandingkan dengan cluster. Oleh karena itu kita bisa
menyimpulkan bahwa HSA-PtNP shell bertindak sebagai scavenger yang efisien
untuk
eksternal H2O2 dan mencapai perlindungan inti Hb.

kesimpulan
Sebuah sitrat-dikurangi PtNP (d = 1,8 nm) mengikat kuat dalam
sumbing dari ASM, menghasilkan stabil kompleks HSA-PtNP. ini
platinated protein menunjukkan tinggi O2
N dan H2O2 dismutasi
kegiatan. The Hb-HSA3 klaster juga menangkap PtNP ke
eksternal Unit HSA. Diperoleh Hb-HSA3 (PtNP) cluster dibentuk
kompleks O2 sangat stabil bahkan dalam larutan H2O2. ini
Hasilnya menunjukkan bahwa Hb-HSA3 (PtNP) cluster dengan (i) negatif
permukaan biaya bersih, (ii) O2 afinitas tinggi, dan (iii) antioksidan kegiatan bisa
menjadi sangat penting medis yang luar biasa sebagai
bahan alternatif untuk sel darah merah untuk transfusi di banyak klinik
situasi yang melibatkan cedera iskemia reperfusi-.