analisis protein

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Elektroforesis merupakan suatu proses bergeraknya molekul yang bermuatan didalam suatu
medan listrik dimana molekul yang bergerak ini tergantung pada muatan yang dimiliki, bentuk
dan ukurannya. Sehingga dengan elektroforesis ini dapat digunakan untuk separasi
makromolekul seperti asam nukleat dan protein. Protein merupakan molekul penyusun tubuh
kita yang terbesar setelah air. Hal ini mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang
seluruh proses kehidupan dalam tubuh. Pada kenyataannya, kode genetik yang tersimpan dalam
rantaian DNA digunakan untuk membuat protein, kapan, dimana dan seberapa banyak. Didalam
tubuh, protein ini berfungsi sebagai penyimpan dan pengantar seperti hemoglobin yang
memberikan warna merah pada sel darah merah, bertugas mengikat oksigen dan membawanya
ke bagian tubuh yang memerlukannya. Selain itu juga menjadi penyusun sel dalam tubuh,
seperti keratin di rambut yang banyak mengandung asam amino cysteine sehingga
menyebabkan bau yang khas bila rambut terbakar karena banyaknya kandungan atom sulfur di
dalamnya (Sudarmanto, 2008). Melalui metode elektroforesis ini maka dapat dilakukan separasi
protein sebagai tahapan awal untuk mendapatkan untuk melakukan penelitian lebih lanjut
sehingga praktikum ini perlu untuk dilakukan.
1.2 Tujuan
Tujuan yang ingin dicapai dari Praktikum SDS PAGE ini yaitu untuk mengetahui metode yang
tepat untuk melalukan separasi protein sampel yang telah diisolasi dari praktikum sebelumnya.
1.3 Manfaat
Manfaat yang ingin dicapai dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui dan memahami metode
SDS PAGE yang tepat sehingga nantinya dapat dianalisis sesuai kebutuhan dalam penelitian
selanjutnya.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Protein
Protein merupakan molekul penyusun tubuh kita yang terbesar setelah air. Hal ini
mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang seluruh proses kehidupan dalam tubuh.
Pada kenyataannya, kode genetik yang tersimpan dalam rantaian DNA digunakan untuk
membuat protein, kapan, dimana dan seberapa banyak. Protein berfungsi sebagai penyimpan
dan pengantar seperti hemoglobin yang memberikan warna merah pada sel darah merah,

bertugas mengikat oksigen dan membawanya ke bagian tubuh yang memerlukannya. Selain itu
juga menjadi penyusun sel dalam tubuh, seperti keratin di rambut yang banyak mengandung
asam aminoCysteine sehingga menyebabkan bau yang khas bila rambut terbakar karena
banyaknya kandungan atom sulfur di dalamnya. Enzim merupakan salah satu jenis dari protein
yang berfungsi sebagai katalis alam tubuh. Dengan adanya enzim, organisme dapat hidup
dengan baik. Enzim memiliki beberapa kelebihan terhadap katalisator non-biologis pada
kecepatan reaksi serta spesifikasi terhadap substrat yang tinggi (Sudarmanto, 2008).
Protein memiliki fungsi banyak fungsi bagi tubuh, diantaranya yaitu sebagai katalis biokimia
seperti enzim; sebagai struktur seperti kolagen yang merupakan komponen penting pada tulang
dan tendon; sebagai pergerakan, contohnya aktin dan myosi; sebagai transport seperti
hemoglobin yang membawa oksigen dalam aliran darah dan serum albumin yang membawa
asam lemak; sebagai zat pengatur, contohnya hormon insulin yang mengontrol gula darah dan
sitokin seperti interleukin yang mengatur pembelahan sel dan diferensiasi; sebagai proteksi,
contohnya antibodi dan protein yang telibat dalam pembekuan darah; sebagai penyimpanan,
contohnya feritin yang menyimpan besi dalam darah dan gliadin yang menyimpan asam amino
dalam biji gandum dorman (WordPress, 2009).
2.2 SDS PAGE
Sodium dodecyl sulfat atau disebut juga SDS merupakan detergen yang dapat memecah molekul
hidrofobik tetapi juga memiliki muatan negatif yang dihubungkan dengan hal tersebut. Oleh
karena itu jika sel diinkubasi dengan SDS maka membran akan dihancurkan dan seluruh protein
akan soluablized oleh detergen dan seluruh protein akan dilindungi dengan banyak muatan
negatif seperti pada gambar 1. yang menghasilkan dua hal penting yaitu seluruh protein akan
dalam struktur primer dan seluruh protein memiliki muatan negatif yang banyak (Davidson,
2001).
Gambar 1. Cara kerja SDS (Davidson, 2001)
Polyacrylamide gel electrophoresis atau disingkat PAGE ini merupakan suatu kemungkinan dari
teknik analisis yang digunakan untuk separasi dan karakterisasi protein yang banyak digunakan.
Solution dari acrylamide dan bisacrylamide merupakan polymerisasi. Bisacrylamide dimasukkan
secara crosslinks diantara rantai polyacrilamide. Ukuran porinya ditentukan berdasarkan rasio
dari acrilamide untuk bisacrylamid, dan oleh konsentrasi acrilamid. Tinggi rasio dari bisacrilamid
pada acrilamid dan tinggi konsentrasi acrilamid menyebabkan mobilitas elektroforesis menjadi
pelan. Polimerisasi dari akrilamid dan monomer bisakrilamid merupakan induksi oleh ammonium
persulfat (APS) (Williams, 2001).
SDS ini merupakan detergen yang ampipatik yang berikatan nonkovalen dengan protein, dengan
stoikiometri dari sekitar satu molekul SDS tiap dua asam amino. SDS ini menyebabkan protein
terdenaturasi dan disassociate, dengan keberadaan SDS, muatan dari protein tersembunyi.

Selama SDS PAGE berlangsung, seluruh protein bergerak menuju anoda yang bermuatan positif
(Williams, 2001).
Gambar 2. Gel Elektroforesis (Williams, 2001)
Gambar 3. Metode Gel Elektroforesis Protein (Molekular station, 2008).
BAB III
METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum dengan judul SDS PAGE dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya pada tanggal 07
Mei 2009.
3.2 SDS PAGE
3.2.1 Separating Gel 12,5%
Dalam separating gel ini yang dilakukan yaitu dengan memasukkan bahan-bahan kedalam
tabung falkon 50 ml secara berurutan. Bahan yang digunakan yaitu stok akrilamid 30%
sebanyak 3,125 ml, 1M tris pH 8,8 sebanyak 2,75 ml, 1,505 ml aquades, 100 l SDS 10%, dan
100 l APS 10%. Setelah itu larutan dituang dalam plate sampai tanda batas. Setelah gel sedikit
memadat dengan membandingkan pada sisa gel yang ada. Setelah sedikit memadat
ditambahkan aquades secukupnya diatas gel tersebut. Dibiarkan gel hingga memadat sempurna,
selanjutnya aquades diserap dengan tisu.
3.2.2 Stacking Gel 5%
Dalam membuat stacking gel ini, semua bahan dicampur dalam falkon 50 ml secara berurutan,
bahan yang digunakan yaitu 0,45 ml akrilamid-bis 30%, 0,38 ml 1M Tris pH 6,8, 2,11 ml
aquades, 40 l SDS 10%, 30 l APS 10%, dan 5 l TEMED. Setelah itu larutan dituang diatas
separating gel yang telah memadat. Kemudian sisir dipasang pada stacking gel dan dibiarkan
hingga memadat sempurna. Setelah padat, lepaskan sisir dan rapikan sumuran yang terbentuk
dengan jarum dari spuilt.
3.2.3 Preparasi Gel
Sampel yang telah diencerkan ditambah RSB dengan perbandingan 1:1 kemudian dipanaskan
pada suhu 1000C selama 5 menit.
3.2.4 Running Gel
Plate yang berisi separating dan stacking gel dilepas karet pengamannya kemudian plate berisi
gel tersebut dimasukkan dalam chamber elektroforesis. Selanjutnya dituang running buffer
hingga bagian atas dan bawah gel terendam larutan. Selanjutnya sampel yang telah disiapkan

dimasukkan dalam sumuran sesuai peta sumuran yang telah dibuat. Untuk memulai running,
perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power supply, selanjutnya running dilakukan pada
arus 30 mA selama 3-4 jam atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel.
Setelah selesai matikan listrik dan buang running buffer dan ambil gel dari plate.
3.2.5 Pewarnaan
Dalam proses ini, hal pertama yang dilakukan yaitu dengan merendam gel dalam larutan
staining sambil digoyang selama 15 menit. Setelah 15 menit buang larutan staining dan cuci gel
dengan aquades beberapa kali hingga bersih. Selanjutnya gel direndam dalam larutan destaining
selama 30 menit atau hingga band terlihat sambil digoyang, saat perendaman ini, gel dilapisi
dengan kertas saring. Selanjutnya gel dicuci dengan aquades beberapa kali hingga bersih.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisa Prosedur
Pada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel dan stacking
gel. Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat
molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu akrilamid 30% sebagai bahan untuk
membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, 1M Tris pH
8,8 untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, aquades digunakan
sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel, SDS digunakan
untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi
protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel
poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari
ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar
larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. pH yang
digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga
protein akan terseparasi dengan baik saat running. Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan
dalam plate untuk mencetak gel, lalu pemberian aquades diatas separating gel yang setengah
padat bertujuan untuk membuat permukaan separating gel datar. Setelah padat aquades diserap
agar dapat dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan stacking gel diatas separating gel.
Gel kedua yaitu stacking gel yang berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum
proses running dimulai. Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu
akrilamid-bis sebagai pembentuk pori-pori untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran yang
dimilikinya, Tris pH 6,8 untuk mempertahankan pH proein agar tidak berubah, aquades sebagai
pengencer, pelarut, dan pemberi kondisi polar untuk melancarkan arus listrik, SDS digunakan
untuk memutuskan ikatan disulfide protein agar menjadi unfolding dan dapat menyelubungi
protein dengan muatan negatif, APS digunakan sebagai katalisator dalam polimerasi gel

poliakrilamid, dan TEMED digunakan sebagai katalisator pembentukan radikal bebas dari
ammonium persulfat dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir agar
larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. Setelah seluruh
bahan dicampur kemudian dituang diatas separating gel yang telah memadat untuk membuat
satu rangkaian gel poliakrilamid yang dapat digunakan untuk SDS PAGE. Sisir dipasang untuk
mencetak sumuran tempat sampel dimasukkan dalam gel.
pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 agar didapatkan protein tetap dalam keadaan
muatan negatif. pH stacking gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel berada di
bawah isoelektrik protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian
bawah dari stacking gel (Janson, 1998).
Dalam preparasi sampel digunakan penambahan Reducing Sample Buffer atau RSB dengan
perbandingan 1:1 karena RSB ini mampu memutus ikatan disulfida protein sehingga didapatkan
protein dalam bentuk linier yang nantinya akan memudahkan separasi protein tersebut dalam
gel saat running. Didalam RSB terdapat kandungan 1M Tris-Cl pH 6,8 untuk menjaga kondisi pH
dari sampel protein, gliserol 50% berfungsi untuk menambah berat sampel sehingga mudah
turun, SDS 10% berfungsi sebagai agen pereduksi yang memutuskan ikatan disulfida sehingga
protein berbentuk linier dan member muatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan
negatif ini untuk memudahkan separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson,
1998). Kandungan yang lain yaitu terdapat 2-merkaptoethanol yang berfungsi untuk membantu
reaksi SDS dalam memecah ikatan disulfida dari protein, dan bromophenol Blue 1% sebagai
penanda atau sebagai tracking dye yang memudahkan dalam mengamati pergerakan protein
saat running (janson, 1998). Tetapi RSB yang digunaka dalam sampel tanaman sedikit berbeda
dari sampel non tanaman, yaitu pada RSB untuk tanaman perlu ditambahkan DTT dan EDTA.
Penambahan DTT ini untuk memecah ikatan disulfide dengan mendegradasi ikatan alifatik
disulfide menjadi rantai polipeptida tunggal. Pada tanaman banyak terdapat jenis metabolit
sekunder, sehingga untuk memaksimalkan pemecahan disulfida yang dilakukan oleh SDS dan 2merkaptoethanol diperlukan penambahan DTT dan EDTA (Janson, 1998). Setelah penambahan
RSB, sampel protein dipanaskan pada suhu 1000C bertujuan untuk mengoptimalkan
pendenaturasian protein.
Running yang dilakukan pada praktikum digunakan arus 30 mA selama 3-4 jam untuk
mendapatkan hasil yang baik karena digunakan arus yang lebih kecil sehingga protein dapat
terseparasi dengan baik. Running ini dilakukan untuk menseparasi protein berdasarkan berat
molekul yang dimilikinya. Running buffer dengan pH 8,3 untuk menjaga kondisi fisiologis dari
protein dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik. Bagian atas
dan bawah gel harus terendam running buffer karena system yang digunakan dalam
elektroforesis yaitu wet sistem dan digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya tidak
terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang selanjutnya
digunakan untuk analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking gelnya dibuang

karena band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja.

Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu untuk dilakukan untuk
membantu dalam pengamatan band protein yang terseparasi. Larutan staining yang digunakan
dalam praktikum ini yaitu CBB R-250 (Coomasie Brilliant Blue), CBB ini sensitif terhadap protein
yang memiliki ukuran yang beriksar antara 0,5 hingga 20 mikrogram (Heidsamp, 2008).
Penggoyangan perlu dilakukan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB.
Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin
masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan destaining untuk
menghilangkan CBB yang tersisa dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk
menghilangkan CBB yang tidak berada pada band protein. Pemberian kertas saring saat
perendaman pada larutan destaining bertujuan untuk memaksimalkan pembersihan larutan CBB.
Setelah itu dilakukan pencucian lagi dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan
destaining dan menghentikan pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Selanjutnya gel
dapat discan untuk mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya.
4.2 Analisa Hasil
Kelemahan yang dimiliki dari staining menggunakan CBB ini antara lain yaitu CBB tidak dapat
mewarnai protein yang mimiliki ukuran yang sangat kecil, dalam proses pewarnaan yang
dilakukan memerlukan waktu yang lebih lama, bahan penyusun larutan stainingnya mudah
menguap dan bersifat asam sehingga diperlukan penanganan tersendiri untuk membuat larutan
staining ini. Selain kelemahan, kelebihan yang dimiliki oleh larutan staining CBB ini yaitu bahan
yang digunakan tergolong murah dan mudah didapatkan dan lebih mudah dalam menghilangkan
sisa-sisa pewarnanya (Janson, 1998). Jenis larutan staining lain yang dapat digunakan yaitu
Colloidal Coomasie Brilliant Blue (G-250) yang mampu mewarnai protein yang berukuran hingga
30 ng dan sesuai dengan masa untuk analisis spektofotometri, Blue Silver (CoomasieG-250)
yang mampu mewarnai protein yang berukuran 1-5 ng, dan kompatibel terhadap mass
spektrofotometri (Missouri University, 2002).
14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Gambar 4 Hasil running bebrapa sampel protein dengan SDS PAGE yang telah diwarnai dengan
CBB
Keterangan :
1. RSB
2. Marker
3. Ikan (non presipitasi)
4. Bayam (non presipitasi)
5. Hepar (non presipitasi)

6. E.coli kel 5 (non presipitasi)

7. E.coli kel 6 (non presipitasi)
8. Ikan (presipitasi)
9. Bayam (presipitasi)
10. Hepar (presipitasi)
11. E.coli kel 5 (presipitasi)
12. E.coli kel 6 (presipitasi)
13. Serum (presipitasi)
Gambar 5. Kurva standar Berat Molekul
Tabel 1. Tabel Kurva standar Berat Molekul
a b Rf BM Log BM
0,5 5,4 0,092593 116 2,064458
1,7 5,4 0,314815 66,2 1,820858
2 5,4 0,37037 45 1,653213
2,5 5,4 0,462963 35 1,544068
3,5 5,4 0,648148 25 1,39794
4,5 5,4 0,833333 18,4 1,264818
5,5 5,4 1,018519 14,4 1,158362
Hasil pembuatan kurva standar berat molekul protein dapat digunakan sebagai patokan dalam
pengukuran berat molekul protein sampel, didapatkan persamaan linier y = 0,145x + 2,141
dengan nilai R2 = 0.983. Berdasarkan R yang didapat dari persamaan dengan nilai mendekati 1
maka kurva tersebut dapat dijadikan standar baku penentuan berat molekul suatu sampel
protein. Dengan menghitung nilai Rf menggunakan persamaan tersebut akan diperoleh berat
molekul tiap sampel protein yang digunakan dalam praktikum. Sampel pada praktikum memiliki
Berat molekul yang berbeda-beda, hanya pada sampel hepar hasil presipitasi dan non presipitasi
yang mendekati dengan protein marker yaitu -galactosidase. Sedangkan sampel protein lain
memiliki berat molekul yang jauh dari berat molekul marker. Jumlah protein terbanyak juga
dimiliki oleh sampel hepar baik itu hasil presipitasi atau non presipitasi, jumlah protein yang
terdapat tiap sampel berbeda-beda tergantung dari kadar protein yang terkandung oleh tiap
sampel dan juga teknik isolasi protein yang dilakukan. Keberadaan jenis protein yang terdapat
pada sampel dilihat dari band protein yang muncul dari gel, Nampak pada gel terdapat pita yang
tebal dan tipis yang dipengaruhi oleh bentuk dan ukuran dari protein-protein tersebut, selain itu
juga dapat diakibatkan adanya smear. Band protein nampak dari sampel protein yang berasal
dari presipitasi dan non presipitasi menunjukkan perbedaan cukup signifikan, pada sampel
protein non presipitasi memiliki jenis protein yang lebih banyak dari pada protein hasil
presipitasi, hal ini karena protein hasil presipitasi berupa protein-protein yang spesifik akibat

adanya presipitasi jadi hanya protein tertentu saja yang masih terdapat didalam sampel yang
dapat dianalisis, sedangkan protein non presipitasi yang masih berupa protein campuran
sehingga band protein yang nampak juga lebih banyak.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum kali ini yaitu metode yang tepat dalam melakukan
separasi protein dengan teknik SDS PAGE yaitu dilakukan pada gel poliakrilamid yang kemudian
dilakukan visualisasi dengan larutan staining CBB. Hasil pengukuran kadar protein pada protein
didapatkan sampel hepar memiliki kadar protein tertinggi, sampel protein hasil presipitasi
memiliki jenis protein yang lebih sedikit daripada protein non presipitasi. Jenis protein yang
ditemukan dalam praktikum yaitu -galactosidase dengan berat molekul yang berkisar sekitar
116,0 kDa yang terdapat pada sampel hepar hasil presipitasi dan non presipitasi.
5.2 Saran
Saran yang dapat diberikan guna perbaikan praktikum dan menjadikan praktikum selanjutnya
lebih baik adalah agar diperhatikan urutan metode yang ada dan ketepatan mengambil larutan
sehingga hasil dan data yang diperoleh lebih akurat.
DAFTAR PUSTAKA
Davidson. 2001. SDS
PAGE. http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html.
Diakses tanggal 04 Mei 2009.
Janson, J.C, L.Ryden. 1998. Protein Purification Principles, High-Resolution Methods and
Applications. Second Edition. John Wiley & Sons, Inc. Canada
Missouri University. 2002. Acrylamide gel protein detection
methods. http://proteomics.missouri.edu/protocols/proteinDetection.html. Diakses tanggal 24
Mei 2009.
Molekular station. 2008. Role of SDS in SDS-PAGE Gel
Electrophoresis. http://www.molecularstation.com/sds-page -gel -electrophoresis/. Diakses
tanggal 04 Mei 2009.
Sudarmanto, Arie. 2008. Protein. http://ariebs.staff.ugm.ac.id. html. Diakses tanggal 05 April
2009.
Williams. 2001. SDS PAGE Gel Elektrophoresis. http://web. chemistry
.gatech.edu/~williams/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html.
Diakses tanggal 04 Mei 2009.

Wordpress. 2009. Tertiary. http://uth3.files. wordpress. Com /2008/10/tertiary.jpg. Tanggal

akses 5 April 2009.