Spektrofotometri UV-Vis

Sesuai dengan namanya spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara

spektrofotometer UV dan Visible. Pada spektrofotometer UV-Vis menggunakan
dua buah sumber cahaya berbeda yakni sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible.
Spektrofotometer UV-Vis merupakan spektrofotometer berkas ganda sedangkan
pada spektrofotometer VIS ataupun UV termasuk spektrofotometer berkas
tunggal. Pada spektrofotometer berkas ganda blanko dan sampel dimasukan
atau disinari secara bersamaan, sedangkan spektrofotometer berkas tunggal
blanko dimasukan atau disinari secara terpisah.
Spektrofotometer UV-VIS seperti yang tertera pada gambar.
Kini spektrofotometer yang digunakan hanya menggunakan satu lampu sebagai
sumber cahaya. Lampu yang digunakan sebagai sumber cahaya yaitu
photodiode yang telah dilengkapi monokromator. Monokromator disini berfungsi
untuk mengubah cahaya yang berasal dari sumber cahaya sehingga diperoleh
cahaya hanya dengan satu jenis panjang gelombang.
Zat yang dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis yaitu zat dalam bentuk
larutan dan zat yang tampak berwarna maupun berwarna. Jenis spektroskopi UVVis terutama berguna untuk analisis kuantitatif langsung misalnya kromofor,
nitrat, nitrit dan kromat sedangkan secara tak langsung misalnya ion logam
transisi.
Langkah-langkah utama dalam analisa dengan sinar UV/Vis
Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV/Vis
Harus dilakukan jika senyawa yang dianalisa tidak melakukan penyerapan
didaerah UV/Vis
Senyawa harus diubah menjadi bentuk lain yang dapat melakukan penyerapan
pada daerah yang dimaksud. Misalnya mengubah menjadi berwarna atau tidak
berwarna.
Pemilihan panjang gelombang agar diperoleh panjang gelombang maksimum.
Pembuatan kurva kalibrasi. Untuk keperluan ini dibuat sejumlah larutan standar
dengan berbagai konsentrasi.
Absorbans larutan standart ini diukur kemudian dibuat grafik A versus C.
Hukum Lambert Beer terpenuhi, jika grafik berbentuk garis lurus yang melalui
titik nol.
Pengukuran sampel dilakukan pada kondisi yang sama seperti pada larutan
standart.
Pengertian Dasar Spektrofotometer Vis, UV, UV-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif
dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya.
Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer.
Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah,
sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan
adalah elektron valensi.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai
radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam
kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di
dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun
pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit
karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat
maupun tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya
cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya
panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l)
didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

Berikut Bagian-bagian dari alat Spektrofotometer UV-Vis :

Sumber cahaya :

1.
Lampu Tungsten (Wolfram) : Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel
pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa.
Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa
garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian.
2.
Lampu Deuterium : Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380
nm. Spektrum energi radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel
yang terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

Monokromator, terdiri atas :

1.
Prisma, berfungsi mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin
supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

2.
Kisi difraksi, berfungsi menghasilkan penyebaran dispersi sinar secara
merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik. Selain itu
kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum.
3.
Celah optis, berfungsi untuk mengarahkan sinar monokromatis yang
diharapkan dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat,
maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang
gelombang yang diharapkan.
4.
Filter, berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya
yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang
gelombang yang dipilih.

Kompartemen sampel

Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. Kuvet

merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis.
Kalibrasi Spectrophotometer UV VIS

Kenapa kalibrasi spectrophotometer perlu dilakukan ?

Bagaimana cara melakukan kalibrasi spectrophotometer ?
Apa perbedaan Kalibrasi, validasi dan verifikasi ?

Mengapa kalibrasi penting?

Dalam bidang kimia, pengukuran analitik memiliki peranan yang sangat
penting .Tujuan dari pengukuran analitik ini adalah untuk menentukan nilai
sebenarnyadari suatu parameter kuantitas kimia, seperti konsentrasi, pH, nilai
absorbansi maupun transmittance dari pengukuran dengan spektrofotometer UVVIS.
Nilai sebenarnya adalah nilai yang mengkarakterisasi suatu kuantitas secara
benar dan didefenisikan pada kondisi tertentu yang eksis pada saat kuantitas
tersebut diukur. Beberapa contoh parameter yang dapat ditentukan secara
analitik adalah konsentrasi, pH, temperature, titik didih, kecepatan reaksi, dan
lain-lain.
Dalam pengamatan eksperimen secara umum, hasil yang diperoleh pasti tidak
dapat terlepas dari factor kesalahan. Nilai parameter sebenarnya yang akan
ditentukan dari suatu perhitungan analitik tersebut adalah ukuran ideal. Nilai
tersebut ini hanya bias diperoleh jika semua penyebab kesalahan pengukuran
dihilangkan dan jumlah populasi tidak terbatas.
Faktor penyebab kesalahan ini dapat disebabkan oleh berbagai hal antara lain
adalah
factor bahan kimia,

peralatan, analis,
kondisi pengukuran dan lain-lain. .
Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengurangi kesalahan dalam
pengukuran analitik ini adalah dengan proses kalibrasi
Apa perbedaan Validasi, Verifikasi dan Kalibrasi?
Salah satu hal yang dilakukan setelah membuat suatu metode analisis baru
adalah melakukan validasi. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan
dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk
peruntukannya.
Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan
dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku
(misalnya dari AOAC, ASTM dan lainnya) , namun baru pertama kali akan
digunakan di laboratorium tertentu , biasanya tidak perlu dilakukan validasi,
hanya verifikasi.Tahapan verifikasi mirip dengan validasi hanya saja parameter
yang dilakukan tidak selengkap validasi.
Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam metode validasi adalah :
Akurasi ( kecermatan )
Presisi ( keseksamaan )
Selektivitas
Lineanitas dan rentang
Batas deteksi dan batas kuantitasi
Ketangguhan metode ( ruggedness )
Kekuatan (robustness )
Sedangkan pengertian kalibrasi menurut ISO / EC Guide 17025:2005 dan
Vocabulary of International Metrology (VIM ) adalah serangkaian kegiatan yang
membentuk hubungan antara nilai yang di tunjukkan oleh instrumen ukur atau
system pengukuran atau nilai yang diwakili oleh bahan ukur, dengan nilai-nilai
yang sudah di ketahui yang berkaitan dari besaran yang diukur dalam kondisi
tertentu.
Dengan kata lain, kalibrasi adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran
konvensional nilai penunjukkan alat ukur dan bahan ukur dengan cara
membandingkan terhadap standar ukur yang mampu telusur ( traceable ) ke
standar nasional untuk satuan ukuran dan/atau internasional.
Tujuan kalibrasi adalah untuk mencapai ketertelusuran pengukuran. Hasil
pengukuran dapat dikaitkan atau di telusur sampai ke standar yang lebih tinggi
atau teliti ( standar primer nasional atau internasional) melalui rangkaian
perbandingan yang tak terputus.
Manfaat kalibrasi adalah :
Mendukung system mutu yang di terapkan di berbagai industry pada peralatan
laboratorium dan produksi yang di miliki.

Mengetahui seberapa jauh perbedaan ( penyimpangan) antara harga benar

dengan harga yang ditunjukkan oleh alat ukur.
Prinsip Dasar Kalibrasi
Obyek ukur ( Unit Under test)
Standar Ukur (Alat standar kalibrasi, Prosedur/ Metode standar ( Mengacu ke
standar kalibrasi internasional atau prosedur yang dikembangkan sendiri oleh
laboratorium yang sudah teruji (diverifikasi) )
Operator /teknisi ( Dipersyaratkan operator / teknisi yang mempunyai
kemampuan teknis kalibrasi (bersertifikat) )
Lingkungan yang dikondisikan (Suhu dan kelembaban selalu dikontrol,
gangguan factor lingkungan luar selalu diminimalkan-sumber ketidakpastian
pengukuran)
Sementara internal kalibrasi adalah :
Kalibrasi harus dilakukan secara periodic
Selang waktu kalibrasi dipengaruhi oleh jenis alat ukur, frekuensi pemakaian dan
pemeliharaan
Bisa dinyatakan dalam berbagai cara yaitu : dengan waktu kalender dan dengan
waktu pemakaian kombinasi cara pertama dan kedua, tergantung mana yang
lebih dulu tercapai.

Bagaimana mengkalibrasi Spektrofotometer UV-VIS

Spektrofotometer UV-VIS banyak digunakan untuk penentuan konsentrasi
senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiiasi pada daerah ultraviolet (200
400 nm) atau daerah sinar tampak ( 400 800 nm) (Sastromidjojo,1991).
Analisis dengan instrument ini dilakukan dengan penentuan absorbansi dari
larutan sampel yang diukur.
Prinsip penentuan spektrofotometer UV-VIS adalah aplikasi dari hukum LambertBeer, yaitu :
A = - log T = - log I / I = x. b. C
Dimana :
A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur
x = Koefisien ekstingsi
T = Transmitansi
b = Tebal kuvet yang digunakan

I = Intensitas sinar masuk

I = Intensitas sinar yang diteruskan
C = konsentrasi dari sampel
Faktor penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis
menggunakan spectrophotometer adalah :
1. Adanya serapan oleh pelarut
Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi
matrik selain komponen yang akan dianalisis.
2. Serapan oleh kuvet
Kuvet yang dapat digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa. Kuvet kuarsa
memberikan kualitas yang lebih baik, namun tentu saja harganya jauh lebih
mahal. Serapan oleh kuvet ini dapat diatasi dengan penggunaan jenis, ukuran
dan bahan kuvet yang sama untuk tempat blanko dan sample.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat
rendah atau sangat tinggi.
Hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi , sesuai dengan kisaran
sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan.

DAFTAR PUSTAKA