PENDAHULUAN

Virus Epstein-barr (EBV) adalah virus yang termasuk dalam famili

Herpesvirus yang menginfeksi lebih dari 90% populasi manusia di seluruh
dunia dan merupakan penyebab mononucleosis infeksiosa. Infeksi EBV
berasosiasi dengan beberapa penyakit keganasan jaringan limfoid dan
epitel seperti limfoma Burkitt, limfoma sel T, Hodgkin disease, karsinoma
nasofaring (KNF), karsinoma mammae dan karsinoma gaster. KNF adalah
neoplasma epitel nasofaring yang sangat konsisten dengan infeksi EBV.
Infeksi primer pada umumnya terjadi pada anak-anak dan asymptomatik.
Infeksi primer dapat menyebabkan persistensi virus, dimana virus
memasuki periode laten di dalam limfosit B memori. Periode laten dapat
mengalami reaktivasi spontan ke periode litik dimana terjadi replikasi DNA
EBV,

transkripsi

dan

translasi

genom

virus,

dilanjutkan

dengan

pembentukan (assembly) virion baru dalam jumlah besar sehingga sel

pejamu (host) menjadi lisis dan virion dilepaskan ke sirkulasi. Sel yang
terinfeksi EBV mengekspresikan antigen virus yang spesifik untuk masingmasing periode infeksi.
EBV mempunyai potensi onkogenik mengubah sel yang terinfeksi
menjadi sel ganas. Pada penderita KNF, DNA EBV selain dapat ditemukan
pada jaringan (biopsi) tumor juga dapat dideteksi dalam sirkulasi (plasma/
serum) dan sel darah penderita KNF.

Radioterapi dan kemoterapi

merupakan terapi standar dalam penanganan penderita KNF. Lebih

kurang 80% penderita KNF pada stadium awal (stadium I dan II) dapat
mencapai remisi sempurna setelah mendapat radioterapi. Namun
demikian rekurensi setelah radioterapi dan kemoterapi dihentikan masih
merupakan kendala dalam pengobatan KNF.
Penelitian ini merupakan penelitian prospektif yang bertujuan untuk
mengetahui efektivitas radioterapi dan kemoterapi pada penderita
karsinoma nasofaring dengan mendeteksi perubahan eksistensi DNA EBV
plasma/serum dan cairan tubuh seperti saliva penderita KNF yang
1

mendapat radioterapi dan kemoterapi. Deteksi DNA EBV dilakukan

dengan teknik nested PCR

menggunakan primer yang kompatibel

dengan gen EBNA1 sebelum dan sesudah radioterapi.

Perubahan DNA EBV tersebut di dalam plasma/serum dan cairan
tubuh (saliva) setelah terapi memberi peluang penggunaan DNA EBV
sebagai marka/penanda yang sensitif untuk memantau status patologi dan
keberhasilan terapi KNF.

BAHAN DAN CARA KERJA

Sampel penelitian berupa darah dan saliva dari pasien KNF yang
sedang menjalani radioterapi dan kemoterapi di Departemen Radioterapi
RSCM. Skrining penderita KNF dilakukan oleh dokter yang merawat dan
menangani pasien KNF. Sebagai pembanding (kontrol) adalah sampel
darah yang dikoleksi dari donor sehat. Koleksi sampel penelitian dimulai
sejak bulan Juli 2007 hingga Desember 2009 dan telah terkumpul lebih
dari 100 sampel darah dan saliva penderita KNF dengan stadium
bervariasi.
Isolasi

DNA

dari

serum

dan

saliva

dimaksudkan

untuk

mendapatkan DNA EBV yang dilepaskan ke sirkulasi dan cairan tubuh

karena reaksi litik pada sel tumor. DNA diekstraksi dengan phenol
khloroform plus isoamyl alkohol (24 :1) dan dipresipitasi dengan
isopropanol.DNA dikeringkan pada suhu kamar selama 30 menit,
disuspensi dengan larutan bufer TE, dan dikuantitasi dengan fotometri.
Untuk

mendeteksi

DNA-EBV,

DNA

diamplifikasi

dengan

PCR

menggunakan primer yang kompatibel dengan gen EBNA1 EBV dengan

pertimbangan gen EBNA1 adalah gen yang aktif dan berexpresi baik pada
infeksi fase latent maupun litik. Disain primer dilakukan menggunakan
program BCM search louncher yang tersedia di website NCBI. DNA EBV
dideterminasi dengan amplifikasi DNA virus dengan nested PCR
2

menggunakan dua pasang primer yang kompatibel dengan gen EBNA I

yang telah didisain sebelumnya. Kondisi PCR diprogram dengan mengacu
pada

program

yang

digunakan

oleh

peneliti-peneliti

sebelumnya.

Pasangan primer yang pertama digunakan untuk mendapatkan DNA

EBNA1 yang cukup untuk amplifikasi kedua, pasangan primer kedua
digunakan untuk menggandakan produk PCR pertama, sehingga
didapatkan produk PCR yang terdeteksi dengan baik.

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari kelompok
kontrol berasal dari individu normal dan sehat, tidak menderita KNF pada
waktu pengambilan sampel dan kelompok KNF berasal dari individu yang
didiagnosis menderita KNF dengan bukti histopatologi oleh dokter yang
menangani kasus tersebut. Dari koleksi sampel sejak Juli 2007 hingga
Desember 2008, sampel yang terkumpul adalah sebagai berikut : Sampel
penderita KNF dikoleksi dari 102 orang penderita terdiri dari 64 laki-laki
(62,7%) dan 38 perempuan (37,3%). Ratio kelompok penderita KNF lakilaki dan perempuan adalah 2,7 : 1. Sampel kontrol dikoleksi dari 106
orang sehat (non-KNF) terdiri dari 56 laki-laki (52,8%) dan 50 perempuan
(47,2%). Ratio kelompok kontrol laki-laki dan perempuan adalah 1,1 : 1

Eksistensi DNA EBV pada pasien KNF yang menjalani Radioterapi

Eksistensi DNA EBV merepresentasikan aktivitas replikasi virus.
Deteksi DNA EBV dilakukan dengan amplifikasi DNA virus dengan PCR
menggunakan primer yang kompatibel dengan gen EBNA1 dengan
pertimbangan gen EBNA1 akan terdeteksi pada setiap fase infeksi, baik
fase laten maupun fase litik.
Dengan teknik nested PCR,

DNA EBV terdeteksi pada serum

pasien KNF maupun kontrol (non-KNF); dengan demikian dapat

3

disimpulkan bahwa hampir semua individu dalam populasi (di Indonesia)

telah terinfeksi EBV, namun infeksi EBV tidak selalu berasosiasi dengan
patogenesis KNF. Faktor penyerta selain infeksi EBV juga berperan pada
patogenesis KNF, namun infeksi EBV merupakan faktor etiologi KNF
berdasarkan fakta bahwa semua penderita KNF selalu terdeteksi DNA
EBV positif pada jaringan tumornya.

Tabel 1. Eksistensi DNA EBV pada serum pasien KNF dan kontrol (nonKNF), dideteksi dengan nested PCR.
Subyek
Kontrol
Pasien KNF

Gambar

1.

Hasil

Jumlah
31
32

amplifikasi

DNA EBV (-)

8
0

DNA-

EBV

DNA EBV (+)

23
32

dengan

nested

PCR

menggunakan primer yang kompatibel dengan gen EBNA1.

Eksistensi DNA EBV dalam serum dan cairan tubuh seperti saliva
pasien KNF dapat dipakai sebagai indikator/penanda progresifitas tumor,
terkait dengan aktivitas replikasi virus dalam sel KNF yang pada gilirannya
akan membebaskan virion ke sirkulasi atau cairan tubuh yang paling dekat
dengan sumber replikasi virus, yaitu saliva.
Eksistensi DNA EBV dalam serum maupun saliva pasien KNF
diinterpretasi dari hasil elektroforesis produk nested PCR gen EBNA1.
Dinyatakan negatip (-) apabila tidak ada pita DNA yang terdeksi; positip
(1+) apabila jumlah DNA EBV sedikit ditunjukkan dengan pita (band) DNA
tipis; positip (2+) apabila jumlah DNA EBV sedang, ditunjukkan dengan
pita DNA yang jelas tetapi tidak tebal; positip (3+) apabila jumlah DNA
EBV banyak sekali, ditunjukkan dengan pita DNA yang jelas dan tebal.
Eksistensi DNA EBV dalam serum maupun saliva pasien KNF
diinterpretasi dari hasil elektroforesis produk nested PCR gen EBNA1.
Dinyatakan negatip (-) apabila tidak ada pita DNA yang terdeksi; positip
(1+) apabila jumlah DNA EBV sedikit ditunjukkan dengan pita (band) DNA
tipis; positip (2+) apabila jumlah DNA EBV sedang, ditunjukkan dengan
pita DNA yang jelas tetapi tidak tebal; positip (3+) apabila jumlah DNA
EBV banyak sekali, ditunjukkan dengan pita DNA yang jelas dan tebal.

Gambar 2. Perubahan eksistensi DNA EBV dalam serum dan saliva

pasien KNF sebelum dan sesudah terapi.

Pengobatan dengan radioterapi ternyata efektif menurunkan DNA

EBV atau virus dengan jumlah besar (3+) sebesar 20% dalam serum dan
45% dalam saliva, tetapi belum efektif untuk menurunkan virus dengan
6

jumlah sedang (2+) dan sedikit (1+). Perubahan/penurunan DNA EBV di

dalam saliva setelah terapi ternyata lebih nyata dan lebih cepat apabila
dibandingkan dengan yang terjadi di dalam serum; kenyataan ini
mengisyaratkan

bahwa

aktivitas

litik

tumor

lebih

cepat

(segera)

membebaskan virion ke saliva daripada ke sirkulasi darah.

KESIMPULAN
1. Eksistensi DNA EBV pada pasien KNF yang menjalani radioterapi
dapat dipakai sebagai indikator efektifitas terapi. Radioterapi efektif
untuk pasien dengan viremia DNA EBV dalam jumlah besar, namun
kurang efektif untuk pasien dengan viremia DNA EBV dalam jumlah
kecil.
2. Eksistensi DNA EBV dalam saliva lebih informatif apabila dipakai
sebagai

indikator

keberhasilan

terapi,

karena

memperlihatkan

frekuensi penurunan DNA EBV yang lebih tinggi dan lebih cepat.

DAFTAR PUSTAKA
1. Mutirangura A. Molecular mechanisms of nasopharyngeal carcinoma
development. Research advances and research updates in
medicine 2000; 1:18-27.
2. Mutirangura A, Tanunyutthawongese C, Pornthanakasem W,
Kerekhanjanarong V, Sriuranpong V, S. et al. Genomic alteration
in nasopharyngeal carcinoma: loss of heterozygosity and
Epstein-Barr virus infection. Brit J. Cancer 1997; 76:770-6.
3. Roezin A. dan Adham M. Karsinoma Nasofaring. Dalam: Soepardi EA,
Iskandar N, Bashiruddin J, dan Restuti RD. Editor. Buku Ajar
Ilmu Kesehatan : Telinga Hidung Tenggorok Kepala dan Leher.
Edisi ke 6. Balai Penerbit FKUI, Jakarta. 2007.
4. Feng, Ren EC, Liu D, Chan SH, Hu H. Expression of Epstein-Barr virus
lytic gene BRLF1 in nasopharyngeal carcinoma: potential use in
diagnosis. J Gen Virol 2000; 81: 2417-2423.

5. McDermott Al, Dutt SN, Watkinson JC. The aetiology of

nasopharyngeal carcinoma. Clin otolaryngol 2001; 26:82-92.
6. Yu MC and Yuan JM. Epidemiology of nasopharyngeal carcinoma.
Semin Cancer Biol 2002; 12: 421-9.
7. Jeannel D, Hubert A, de Vathaire F, Eliouz R, Camoun M, et al. Diet,
living conditions and nasopharyngeal carcinoma in Tunisia: A
case-control study. Int J cancer 1990; 46:421-425.
8.
Cheung F, Pang SW, Hioe F, Cheung KN, Lee A, et al.
Nasopharyngeal carcinoma in situ: Two cases of an emerging
diagnostic entity. Cancer 1998; 83:1069-73.
9. Shanmugaratnam K and Sobin L. Histological typing of upper
respiratory tract tumor. Geneva, World Health Organization:
1978; 31-39.
10. Neel HB, Pearson GR, Taylor WF, Antibodies to Epstein-Barr virus in
patient with nasopharyngeal carcinoma and in comparison
groups.Ann Otol Rhinol Laryngol 1984; 93:447-82.
11. Lin CT, Lin CR, Tan GK, Chen W, Dee AN,, et al. The mechanism of
Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma cells.
Am J Pathol 1997; 150: 1745-1756.
12. Sastroasmoro S. dan Ismael S. Dasar-Dasar Metodologi Penelitian
Klinis. Edisi ke-2. CV Sagung Seto, Jakarta. 2002.
13. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular Cloning : A Laboratory
manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, 1989.
14. Promega. GoTaq PCR Core System. Instruction for use products.
Technical Bulletin. Madison USA. 2007.
15. Medis R. Statistical handbook for non-statistician.McGraw-Hill Book
Company (UK) Limit. London. 1975.
16. Stell RGD & Torrie JH. Prinsip dan prosedur statistika : Suatu
pendekatan biometrik (terjemahan). Edisi 3. PT. Gramedia
Pustaka Utama, Jakarta 1993.
17.
Nussbaum
RL,
McInnes
RR,
Willard
HF.
(2001)
Thompson&Thompson : Genetics in Medicine. 6th Ed.
Philadelphia, USA : WB Saunders Co. : 87.
18. Armstrong MW, Armstrong MJ, Yu MC, Henderson BE. Salted fish
and inhalant as risk factors for nasopharyngeal carcinoma in
Malaysian Chinese. Cancer res 1983; 43: 2967-2970.
19. Parkin DM, Whelan SK, Ferlay J, Raymond L, Young J. Cancer
incidence in five continent. Vol. 7, Lyon, France: IARC Scient.
Publ. No. 143. IARC Press
20. Roezin A. Food and Social Background of Nasopharyngeal Cancer
Patient in Jakarta. ASEAN Otolaryngol Head & Neck Surg J
1997; 1 : 21-27.
21. Roezin A. Berbagai Faktor Penyebab dan Predisposisi Karsinoma
Nasofaring. Maj Kedok Indon 1999; 49 (3) : 85-88.

22. Masrin I, Proporsi hasil pemeriksaan serologi virus Epstein-Barr pada

pasien karsinoma nasofaring: menggunakan reagen NPC
REAAD INFLECTION dengan metode ELISA. PPDS Bidang
Studi Ilmu Penyakit THT FKUI Jakarta; 2006.
23. Chan ATC, Lo YMD, Zee B, Chan LYS, Ma BBY. Plasma Epstein-Barr
Virus DNA and residual disease after radiotherapy for
undifferentiated nasopharyngeal carcinoma. J. Natl. Cancer. Inst.
94 : 1614 1619, 2002.

EKSISTENSI DNA-EBV DI DALAM SERUM DAN SALIVA SEBAGAI

PENANDA UNTUK MEMANTAU TERAPI KNF

*Purnomo Soeharso, Yurnadi*, Dwi Anita Suryandari*

Departemen Biologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas
Indonesia, Jakarta.
ABSTRAK
Pengantar: Karsinoma nasofaring (KNF) adalah penyakit yang konsisten
dengan infeksi virus Epstein-Barr (EBV), sehingga eksistensi DNA-EBV di
dalam cairan tubuh dapat dipakai sebagai penanda status patologi KNF
dan/atau progresivitas tumor.
Tujuan: Penelitian bertujuan untuk mendapatkan metoda efektif untuk
memantau kemajuan atau keberhasilan terapi KNF dengan melihat
perubahan eksistensi DNA-EBV di dalam darah dan saliva pasien KNF
sebelum dan sesudah radioterapi. Deteksi DNA-EBV dilakukan dengan
amplifikasi DNA virus dengan PCR menggunakan primer yang kompatibel
dengan gen EBNA1 dengan pertimbangan gen EBNA1 akan terdeteksi
pada setiap fase infeksi. Eksistensi DNA-EBV di dalam serum maupun
saliva pasien KNF dan kontrol diinterpretasi dari hasil elektroforesis
produk nested PCR gen EBNA1.
Hasil: Pengobatan dengan radioterapi ternyata efektif menurunkan DNAEBV atau virus dengan jumlah besar (3+) sebesar 20% dalam serum dan
45% dalam saliva, tetapi belum efektif untuk menurunkan virus dengan
jumlah sedang (2+) dan sedikit (1+). Perubahan atau penurunan DNAEBV di dalam saliva setelah radioterapi ternyata lebih nyata dan lebih
cepat apabila dibandingkan dengan yang terjadi di dalam serum;
kenyataan ini mengisyaratkan bahwa aktivitas litik tumor lebih cepat
membebaskan virion ke saliva daripada ke sirkulasi darah.
Kesimpulan: Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa eksistensi DNAEBV dalam saliva lebih informatif apabila dipakai sebagai indikator atau
penanda keberhasilan terapi, karena memperlihatkan frekuensi penurunan
DNA-EBV yang lebih besar dan lebih cepat.
Kata kunci : KNF, EBV, DNA-EBV dalam darah dan saliva.

10

THE EXISTENCE OF EBV DNA IN THE SERUM AND SALIVARY AS A

MARKER FOR MONITORING NPC THERAPY

Purnomo Soeharso*, Yurnadi*, Dwi Anita Suryandari*

Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, University of
Indonesia, Jakarta
ABSTRACT
Background: Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a disease associate
consistently with Epstein-Barr Virus (EBV) infection; therefore the
existence of EBV-DNA in the liquid of the body may be considered as a
marker for NPC pathology and/or tumor progression.
Objective: This study aims to discover effective method for monitoring the
progression or succeeding of NPC therapy as reflected by changes of
EBV-DNA existence in blood and saliva of NPC patients detectable before
and after radiotherapy.
Methods: EBV-DNA detection was done by viral DNA PCR amplification
using primers which are compatible with EBNA1 gene, as it is always
detectable in either phases of infection. The existence of EBV-DNA in
either serum or saliva of NPC patients and control groups was concluded
by the evaluation of EBNA1 gene nested PCR product which was
assessed by electrophoresis.
Result: Radiotherapy treatment seemingly decrease EBV-DNA with large
concentration (3+) effectively as to the proportion of 20% in serum and
45% in saliva, nevertheless it did not effectively decrease virus with
moderate concentration (2+) and small concentration (1+). The decrease
of EBV-DNA in saliva after radiotherapy occurred more obvious and take
less time than that occurred in serum; this situation reflect the litic activity
of NPC tumor which release virions to saliva sooner than it does to blood
circulation.
Conclusion: The result of this study indicate that the existence of EBVDNA in saliva is more informative and beneficial as a marker or indicator of
successful therapy, as reflected by the decrease of EBV-DNA in larger
concentration and in shorter period as well.
Keywords : NPC, EBV, EBV-DNA in circulation and salivary.

11