Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak

digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam

langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
a.

Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara
kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram

positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat
Komposisi dinding sel
Ketahanan terhadap penisilin
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)
Kebu
tuhan nutrisi
Ketahanaa terhadap

Bakteri garam (+)

Kandungan lipid rendah (1-4%)
Lebih sensitif
Lebih dihambat
Kebanyakan spesies relatif kompleks

Bakteri gram
Kandungan
Lebih tahan
Kurang diha
Relatif sede

Lebih tahan

Kurang taha

perlakuan fisik
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue
Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen
untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun.
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti
asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang
sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam
prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna
itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol
fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga
bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai
mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit
lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu
larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4

menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang.
Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir
Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
a.

Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.

b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.
c.

Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini
dilakukan dalam 4 tahap yaitu:

a.

Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c.

Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan
pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal
violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat
asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar
cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang
berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda.
Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini
bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga
bertujuan supaya bakteri benar-benar melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri

berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu
diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak
terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya
hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi
pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama.
Pemberian iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna
oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma
organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram
negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan
didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin
lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang.
Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau
melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.Alkohol
96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas dengan
aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di
dalam gelas benda.
Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya diteteskan
1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu,
gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna
tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin

memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau
pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna
merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna
ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan
waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan
komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian
zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri
berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas
benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen,
perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar
aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah
pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah
atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

1. PEMBAHASAN

1.1 Analisa Prosedur

Pada Pratikum Mikrobiologi Dasar dengan materi pewarnaan gram yang pertama
kali dilakukan adalah dipersiapkan alat dan bahan alat-alat yang digunakan antara lain
mikroskop, cawan petri, objek glass, jarum loop, pipet tetes dan bunsen. Sedangkan bahan
yang digunakan adalah NA, kristal ungu, iodium, etanol 70% , safranin 83dan aquadest.
Langkah selanjutnya yaitu bakteri diambil dari media isolasi dengan menggunakan
jarum loop karena apabila menggunakan jarum osedapat merusak media, jarum loop juga
terlebih dahulu dipanaskan diatas bunsen agar kondisinya aseptis. Setelah itu disentuhkan
pada medium yang tidak ada bakterinya karena jika kondisi terlalu panas bakteri bisa mati
setelah itu diambil bakteri dan digoreskan pada kaca objek. Kemudian kaca objek difiksasi di
bunsen untuk mengkondisikan aseptis dan untuk memperjelas struktur internal dan
eksternal sel. Setelah fiksasi tetesi dengan larutan kristal ungu yang berfungsi sebagai zat
warna primer dan didiamkan selama 1 menit, karena pada waktu 1 menit diasumsikan
dinding sel bakteri sudah mengunci kristal ungu.
Setelah itu dibilas dengan aquadest hal ini bertujuan agar kristal ungu yang dapat
luntur dan untuk memperjelas pengamatan. Setelah dibilas dengan aquadest lalu ditetesi
iodium dan dibiarkan selama 2 menit. Iodium berfungsi sebagai penguat warna kristal ungu
dan didiamkan selama 2 menit. Perlakuan inidilakukan karena selama waktu tersebut
diasumsikan telah cukup jelas memberikan warna ungu pada bakteri.Setelah itu dibilas lagi
dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri.Kemudian
dicuci dengan menggunakan etanol 70 %, etanol berfungsi untuk melarutkan lemak.
Kemudian dibilas kembali dengan aquadest, hal ini bertujuan untuk memperjelas
pengamatan setelah itu ditetesi dengan menggunukan safranin, safranin disini berfungsi
sebagai pewarna sekunder dan sebagai tanda bahwa bakteri tersebut merupakan gram
negatif (-) lalu dibiarkan setengah menit karena waktu tersebut diasumsikan bahwa dinding
sel telah mengunci safranin. Setelah itu dibilas dengan aquadest hal ini bertujuan untuk
membilas safranin dan untuk memperjelas pengamatan.Kemudian preparat diamati di
bawah mikroskop dan kemudian didokumentasikan.
Perbedaan gram positif dan gram negatif adalah gram positif adalah organismeyang
dapat menahan komplek pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur
(sel tampak biru gelap atau ungu). Sedangkan gram negatif adalah organisme yang
kehilangan komplek warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun
kemudian terwarnai oleh pewarnaan tandingan safranin (sel tampak merah muda)
(Hadioetomo, 1985).
1.2 Analisa Hasil

Dalam pratikum mikrobiologi dasar materi pewarnaan gram diperoleh hasil

pengamatan dari setiap kelompok yang disajikan dalam table berikut ini.
Tabel 9. Hasil Pengamatan Uji Warna Bakteri
Kelompok
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

Jenis bakteri (gram positif/gram )

Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram negative
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram negative
Bakteri gram negative
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram negative
Bakteri gram negative
Bakteri gram negative
Bakteri gram positif
Bakteri gram negative
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif
Bakteri gram positif

Hasil uji warna

Ungu
Ungu
Merah
Ungu
Ungu
Ungu
Merah
Merah
Ungu
Ungu
Ungu
Ungu
Merah
Merah
Merah
Ungu
Merah
Ungu
Ungu
Ungu
Ungu
Ungu
Ungu

Dalam pewarnaan gram ada 2 kemungkinan yang akan terjadi yaitu menjadi warna
ungu yang menunjukkan gram positif dan warna merah yang menunjukkan gram negatif.
Warna ungu yang terdapat digram positif didapat karena pada saat bakteri ditetesi dengan
etanol dinding selnya mengkerut. Sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan sekunder )
bakteri tetap dapat mempertahankan warna primernya karena pengaruh ketebalan dinding,
oleh karena itu disebut gram positif. Sedangkan gram negatif didapat karena pada saat
bakteri ditetesi dengan etanol dinding selnya tidak dapat mengkerut dengan kuat karena
strukturnya yang tipis., sehingga saat diberi safranin ( pewarnaan sekunder ) bakteri tidak
dapat mempertahankan warna primernya, sehingga warna ungu pudar menjadi merah
muda, oleh karena itu disebut gram negatif. Perbedaan antara bakteri gram positif dan
bakteri gam negatif terletak pada struktur dinding sel dan kandungan asam ribonukleatnya.
Hasil yang diperoleh dari setiap kelompok mengenai pewarnaan gram bakteri berbeda
beda. Ada yang jenis bakterinya gram (+) dan ada yang jenis bakterinya gram (-). Gram (+)

berwarna ungu karena bakteri tersebut mengikat komplek zat warna kristal ungu, gram (-)
berwarna merah karena mengikat zat warna sekunder.
Jika sedian kemudian di cuci dengan air, lalu dengan alkohol maka dua kemungkinan
dapat terjadi. Pertama zat warna tambahan terhapus, sehingga yang nampak ialah zat
warna yang asli (ungu). Dalam hal ini sedian (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat
warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak, dalam hal ini sedian
(bakteri)

kita

katakan

gram

negatif(Dwidjosaputro,2005)

Tabel 10. Mekanisme Penyerapan Warna

Reaksi dan Tampang Bakteri
Larutan dan Urutan
penggunaannya
Gram Positif
Sel berwarna ungu.
Kompleks
UK-Y
terbentuk di dalam sel,
sel
tetap
berwarna
ungu.

Gram Negatif
Sel berwarna ungu.
Kompleks UK-Y terbentuk di
dalam
sel;
sel
tetap
berwarna ungu.

1
2

Ungu Kristal (UK)

Larutan Yodium (Y)

Alkohol

Dinding sel mengalami

dehidrasi,
pori-pori
menciut, daya rembes
dinding
sel
dan
membran menurun, UKY tak dapat keluar dari
sel; sel tetap ungu.

Lipid
terekstraksi
dari
dinding
sel,
pori-pori
mengembang,
kompleks
UK-Y keluar dari sel; sel
menjadi tak berwarna.

Safranin

Sel tak terpengaruhi,

tetap ungu.

Sel menyerap zat pewarna

ini, menjadi merah.

Bakteri yang diwarnai dalam pewarnaan gram ini dibagi menjadi 2 kelompok , salah
satunya gram positif yang mempertahankan zat warna ungu kristal. Bakteri gram negatif
kehilangan warna ungu Kristal ketika dicuci dengan alkohol dengan waktu diberi pewarnaan
kandungan dengan safranin yang berwarna merah ( Zubaidah, 2006 ).

2. PENUTUP
2.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari pratikum Mikrobiologi Dasar materi Pewarnaan Gram adalah
-

Pewarnaan adalah umtuk membuktikan larutan dalam prosesnya yaitu zat warna

penutup, zat warna lawan dan zat warna pelunturan warna.

Pewarnaan dibedakan menjadi 3 yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial,

dan pewarnaan gram.

Pewarnaan bertujuan untuk menjelaskan sel bakteri dengan menempelkan zat warna

ke permukaan sel bakteri

Macam-macam pewarnaan yaitu pewarnaan tunggal, pewarnaan negatif, pewarnaan

tahan gram dan pewarnaan struktur sel

Bahan-bahan yang digunakan yaitu Kristal ungu, iodium, etanol 70%, dan safranin.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel yang tipis, dan

kandungan lemak tipis

Bakteri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berbeda diantara dua lapis

membran sel dan kandungan lemak tebal

Tujuan difiksasi adalah untuk mematikan bakteri dan membuat lekat sel bakteri pada

objek glass tanpa merusak strukturnya

Pewarnaan gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna, dibedakan

menjadi 2 yaitu gram positif dan gram negatif

Contoh bakteri gram positif yaitu Bacillus Subtilis dan gram negatif contohnya E. Coli

Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan tersebut
dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan

pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu.

2. akteri gram positif ialah yang dapat mempertahankan warna kristal violet dan

bentuk bakterinya berbentuk basil dan cocus.

3. Pada penyataan bakteri semua kelompok adalah mono pada semua sampel yang

diteliti.
4. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram.
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran

sel bakteri.
5. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam

teknik pewarnaan bakteri antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri
b. Fiksasi
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.
6. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
.