Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri

(total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau
terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN
terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test),
dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih
dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif
coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan
untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan
Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan
pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N
2
dari udara dan mengubah ammonium menjadi nitrat (Lim, 1998). Metode MPN biasanya
biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair,
meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat. Perhitungan jumlah suatu
bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap
terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji
penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan
beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung
dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang
didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu
koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat
pada sampel (Plummer, 1987).
Output
metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (
growth unit
) atau unit pembentuk koloni (
colony forming unit
) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah
individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN
memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan
nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim, 1998). Menurut Plummer (1987), ada
beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di
dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu: a.
Perhitungan jumlah sel 1. Hitungan mikroskopik 2. Hitungan cawan 3. MPN (Most Probable
Number) b. Perhitungan massa sel secara langsung 1. Volumetrik 2. Gravimetrik 3.
Kekeruhan (turbidimetri) c. Perhitungan massa sel secara tidak langsung 1. Analisis
komponen sel 2. Analisis produk katabolisme 3. Analisis konsumsi nutrient Metode MPN
biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair,
meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu
membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Metode MPN digunakan medium cair di dalam
tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif
yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau
terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi
terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas (Fardiaz, 1993). Untuk metode MPN (
most probable number

) digunakan medium cair dalam wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan
berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada
mediumnya baik itu berupa perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas pada dasar
tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini digunakan bentuk tiga seri pengenceran,
yang pertama 10
-1
, 10
-2
, dan 10
-3
. Kemudian dari hasil perubahan tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN, dan
untuk jumlah bakterinya maka digunakan rumus (Gobel, 2008). Metode MPN merupakan uji
deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk
menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji positif akan menghasilkan angka
indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah koliform dalam
sampel (Pakadang, S, 2010). Bakteri koliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri
patogenik lain dengan kata lain merupakan bakteri indikator sebagai tanda bahwa adanya
pencemaran bakteri patogen. Penentuan koliform fecal menjadi indikator pencemaran
dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen.
Keuntungan mendeteksi koliform adalah jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada
mendeteksi bakteri patogenik lain. Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan
sebagai indikator adanya pencemaran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air,
makanan, susu dan produk-produk susu. Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni
yang di temukan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sampel bisa di
katakan murni (Umbreit, 1960). Beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat
fermentatif, sehingga diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya
coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan
hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop
terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, gram negatif, tidak-berspora. Bakteri coliform
adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri
coliform adalah bakteri indicator keberadaan
bakteri patogenik lainnya. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri
indicator adanya pencemaran bakteri pathogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator
pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan
bakteri pathogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat dan sederhana
daripada mndeteksi bakteri patogenik lain (Lim, 1998). Salah satu anggota kelompok
coliform adalah
E.coli
. Karena
E.coli
adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka
E.coli
sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan
dengan uji
E.coli
karena hanya memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji
E.coli

(Penn, 19V91). Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas
air minum. Kelompok bakteri coliform, antara lain
Eschericia coli
,
Enterrobacter aerogenes
, dan
Citrobacter fruendi
. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukka
1.1 Latar Belakang
Kuantitasi mikroba menunjukan jumlah koloni yang mampu di bentuk oleh mikroba
tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Seteril
dari bakteri untuk maknan terutama minuman, sangat perlu di ketahui demi menjaga
kesehatan. Air minum dari berbagai tempat memepunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama
untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri (Dwidjoseputro,
1994).
Pertumbuhan sering kali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan untuk
menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dikatakan hidup bila dapat menghasilkan sel baru.
Bila tidak mempunyai kemampuan ini lagi, Maka sel dinyatakan tidak hidup lagi atau mati.
Analisis pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu, membandingkan
jumlah sel, berat kering, konsentrasi protein atau nitrogen dan kekeruhan (Dwidjoseputro,
1994).
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun
tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuann
terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung
terlebih dahulu harus memeberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan.
Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah
memebuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan
penggunaan ruang hitung (counting chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung
hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja.
(Dwidjoseputro, 1994).
Oleh karena itu yang melatar belakangi percobaan ini ialah agar pratikan dapat
mengetahui tentang teknik-teknik perhitungan mikroba dan salah satunya yaitu metode MPN
dan mengerti tentang perhitungan mikroba pad prinsip percobaan metode MPN serta hal yang
berkaitan dengan bakteri koliform pada percobaan yang dilakukan.
1.2 Tujuan

Untuk mengetahui prinsip metode MPN

Untuk mengetahui fungsi dari media EMBA, BGLBB, LB
Untuk mengetahui proses terjadinya gelembung pada tabung durham di setiap uji percoban
MPN

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan
petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil
atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode
MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed
test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform
masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat
fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam
pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti
Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam
meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya
dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro,
1994).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit
tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel.
Namun pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri.
Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit
kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN
terendah dan nilai MPN tertinggi (Dwidjoseputro, 1994).
Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran
pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik
lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fecal adalah bakteri indikator adanya
pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator pencemaran
dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen.
Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi
bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).
Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri
coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal.
Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya
memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 1994).

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan. Bakteri
indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadannya dalam pangan menunjukkan bahwa air
atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia yang mengingat banyaknya
jumlah mikroorganisme ini, maka perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan
pangan tersebut agar aman dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah
bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri
tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap
pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari
usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri patogen lain yang berbahaya.
Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi,
yaitu Escherichia coli, kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium
perfringens (Hastowo, 1992).
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai
macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah
mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara
tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan
membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan
penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung
hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja
(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan
petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil
atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo,
1992).
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi
uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri
patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat
sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama
tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan (Hastowo, 1992).
Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam
praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup
bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif, batang gram negatif dan tidak
membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas
dalam waktu 48 jam pada suhu 35C (Hastowo, 1992).

Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan yang
menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas
dalam tabung durham (Lay, 1992).
Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Metode
MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya
digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya
bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya
yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa
menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37 C. Sampel
ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi untuk setiap kelompok.
Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri.
Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah
tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel
sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang
memiliki komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol
Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS
(Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari
LBDS yaitu 5 gr (Lay, 1992).
MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan
medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung
reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang
ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung
yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di
dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad
renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan
3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih
tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro,
2005).
Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara ini secara
luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air, susu,
biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat untuk kemudian ditanam dalam
medium pembiakan bulyon agar dan setelah inkubasi jumlah koloni dihitung. Setelah

dikonversi sesuai dengan pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter.
Karena pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka yang
diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable Number (MPN) (Irianto,
2006).
Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat
tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam
dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi
tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran
yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah
sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang
tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang
menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang
dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat
memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi
metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi
mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran
pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan
dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung
mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama
sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa
tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo,
2004).
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk
padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad
renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang
digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).
Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-masing
dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap
pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu,
dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan
timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya pada pengnceran pertama, 3
tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran ke 2 tabung positif, pada

pengenceran ke 3 satu tabung positif, dan pada pengenceran teakhir tidak ada tabung yang
positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya
menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian dicocokkan dengan table MPN, kemudian nilai
MPN sampel dapat dihitung sebagai berikut :

MPN sampel = Nilai MPN dari table x

1
Pengenceran tabung tengah

Pembahasan
Metode MPN (Most Probable Number) adalah metode yang digunakan untuk
menghitung koliform di dalam air dengan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung.
Tiga pengujian itu diantaranya adalah uji penduga (Presumtive Test), uji penegas (Confirmed
Test), dan uji pelengkap (Completed Test) Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai
MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni dalam
sampel (Dwidjoseputro, 1994).
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air
khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama
sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak
membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu
24 jam inkubasi pada 37 C (Dwidjoseputro, 1994).
E.coli adalah bakteri koliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli
sering disebut sebagai coliform fekal. Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal,
yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia dan merupakan bakteri indikator keberadaan
bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri
indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator
pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan
bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana
daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).
Media Lactose broth (LB) digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran
coliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment
broth) untuk Salmonella dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada
umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme
bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme
koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk coliform.
Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa
(lay, 1992)
Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) mempunyai keistimewaan mengandung
laktosa dan berfungsi
seperti Staphylcoccus.

untuk memilah
aureus,

P.

mikroba

aerugenosa,

yang
dan

memfermentasikan

Salmonella.

Mikroba

laktosa
yang

memfermentasikan laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap
logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin

dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika
media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P.
Aerugenosa dan Salmonella sp. dan dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini
sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB
(levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri E.coli
dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan
methylene blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang
meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan
bakteri E.coli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa (Hastowo, 1992).
Media BGBB (Brilliant Green Bile Broth) digunakan untuk mengkonfirmasi hasil
tes positif dugaan. Brilliant Green Bile Broth (BGBB) juga disebut sebagai Brilliant Green
Lactose Bile Broth (BGLBB). Enzimatik Intisari dari Gelatin adalah sumber karbon dan
nitrogen digunakan untuk kebutuhan pertumbuhan umum di Brilliant Green lactose Bile
Broth. Oxbile dan Brilliant Green menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
banyak, selain E.coli. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Bakteri yang fermentasi
laktosa dan menghasilkan gas yang terdeteksi Penggunaan utama dari media ini adalah untuk
mengidentifikasi keberadaan E.coli pada makanan. Selama inkubasi 24 jam pada suhu 37 C
E.coli akan memfermentasi laktosa dalam kaldu dengan produksi gas dan Gas ini akan
terkumpul dalam sebuah tabung durham terbalik (Hastowo, 1992).
Uji Penduga (Presumptive Test) : satu seri yang berisi 9 atau 12 tabung yang berisi
Lactose Broth dan tabung durham diinokulasikan dengan sampel air untuk menguji apakah
air tersebut mengandung bakteri yang bisa memfermentasikan laktosa yang memproduksi
gas. Jika setelah inkubasi gas timbul pada Lactose Broth, diduga ada bakteri coliform di
sampel air tersebut. Uji penduga merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran
bakteri coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan karena fermentasi
laktosa oleh bakteri golongan E.coli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media
laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung durham yang berupa gelembung
udara. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung
tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan dibandingkan
dengan tabel MPN. dan jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham, dihitung sebagai hasil
negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri, MPN penduga dapat
dihitung dengan melihat tabel MPN (Lay, 1992).
Uji penguat atau pelengkap. Merupakan uji dari tabung yang positif terbentuk asam
dan gas terutama pada masa inkubasi 1 x 24 jam, suspensi diinokulasikan pada media Eosin

Methylen Blue Agar (EMBA) secara aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni
bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilap metalik (Lay, 1992).
Uji penegas untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna
pada uji penguat atau pelengkap. Uji penegas merupakan suatu uji sebelum dilakukanya uji
pelengkap dimana digunakn media (BGLBB) Brilliant Green Lactose Bile Broth. Dimana
pada media ini di lihat fermentasi laktosapada bakteri E.coli dengan terbentuknya asam dan
gelembung. Pada uji penegas banyaknya kandungan bakteri E.coli dilihat dengan menghitung
tabung yang terdapat gelembung di dalam tabung durham dan dihitung MON count dengan
melihat hasil dari MPN tabel dikali sepuluh per pengenceran tengah dan dari hasil uji penegas
akan disimpulkan dengan uji penguat atau pelengkap (Dwidjoseputro, 1994).
Hasil pengamatan pada perhitungan jumlah bakteri dengan menggunakan metode
MPN diketahui, pada uji penduga digunkannya media lactose borth dengan sampel air minum
yang digunakan diketahui seri pengamatan 10 terdapat empat gelembung, pengenceran 1
terdapat empat gelembung, pengenceran 10-1 terdapat tiga gelembung, dan pengenceran 10-2
terdapat satu gelembung. Pada MPN tabel diketahui 33 nilai MPN tabelnya dan dari
perhitungan MPN count didapatkan hasi 3300 Cfu /100 ml.
Pada uji penegas dengan menggunakan media Brilliant Green Lactose Bile Broth
dapat diketahui seri pengamtannya pada pengenceran 10 terdapat lima gelembunng, pada
pengencera 1 terdapat empat gelembung, dan pada pengenceran 10-1 terdapat satu gelembung
sedangkan pada pengenceran 10-2 terdapat dua gelembung. Dari hasil pengenceran didapatkan
hasl nilai MPNtabelnya 26, dengan perhitungan mencari Mpn count hasil yang didapat dari
MPN-nya adalah 2600 Cfu/100 ml.
Pada uji penguat atau pelengkap dari setiap seri pengenceran tidak didapatkan hasil
adanya bakteri E.coli yang tumbuh pada sempel air minum. Jadi, hasil yang didapat adalah
nihil atu tidak ada bakteri E.coli yang tumbuh.
Faktor kesalahan pada percobaan perhitungan jumlah mikroba pada metode MPN.
Trejadi pada cara penggoresan pada media EMBA yang tidak sesuai dengan alur dan
melewati dari garis pembatas kolom, serta kurang hati-hati dalam melakukan percobaan
sehingga terdapat tabung reaksi yang pecah akibat kecerobohan.