Abstract

Hemangioma infantile merupakan tumor vascular yang sering

terjadi pada anak2. Walaupun tumor jinak, beberapa hemangioma
dapat menyebabkan deformasi dan kerusakan dan dapat
membahayakan hidup. Terapi yang ada sekarang antara lain
corticosteroid atau propranolol yang dikonsumsi untuk beberapa
bulan dan dapat menyebabkan adverse effect terhadap anak2. Kami
mendesign a high throughput screen untuk mengidentifikasi FDAapproved drugs yang bias dipakai untuk mengobati tumor ini.
Rapamycin yang merupakan mTOR inhibitor diidentifikasi
berdasarkan kemampuannya untuk menghambat proliferasi dari
hemangioma-derived stem cell population, sel vasculogenic yang
kami punya. Pada studi in vitro dan in vivo menunjukkan rapamycin
mengurangi self renewal capacity dari stem cell hemangioma,
menghilangkan potensi untuk berdiferensiasi dan menghambat
aktivitas vasculogenic dari sel in vivo tersebut. Longitudinal in vivo
imaging terhadap aliran darah melalui vessels formed with
hemangioma stem cells shows that rpamycin juga dapat
menyebabkan regresi pada pembuluh darah hemangioma, karena
dikenal dengan anti angiogenic activity. Terakhir, kami
mendemostrasikan rapamycin-induced loss of stemness dapat
bekerja dengan corticosteroid, yaitu standard terapi untuk
hemangioma dan untuk memblok pembentukan hemangioma in
vivo. Studi kamu menunjukkan rapamycin menargetkan ke selfrenewal dan diferensiasi vascular potensial pada patient-derived
hemangioma stem cells dan mensarankan therapeutic strategy
untuk mencegah formasi tumor ini.
Intoduction
Infantile hemangioma merupakan tumor pada anak2 yang tersusun
dari pembuluh darah dan sel immature. IH mereprentasikan
gangguan pada vasculogenesis pada neonatal, pembentukan de
novo vessels dari sel progenitor angiogenesis. Di study ini kami
menunjukkan rapamycin, penghambat mTOR pathway,
mennghilangkan self renewal capacity dari IH-derived stem cells,
menginisiasi differensiasi hemSC terhadap perivascular cell
phenotype dan menghambat formasi de novo vessl dari HemSCs.
Aktivitas antivasculogenic dari rapamycin, yang merupakan berbeda
dari antiangiogenic effects, merupakan penemuan yang sangat
wow. Dengan implicasi terhadap mTOR pathway pada neonatal
vasculogenesis dan juga strategi baru untuk mengobati IH.
Walaupun tumor junak biasanya tidak berbahaya, beberapa IH
dapat menyebabkan deformasi atau bahkan merusak wajah dan/
atau menyebabkan obstruksi penglihatan dan pernafasan. 40-80%
hasil pada permanent cutaneous residua, dapat menyebabkan
disfiguring. Kortikosteroid merupakan first line therapy, biarpun
begitu ada banyak adverse effect dan sekitar 16% hemangioma
tidak merespon terhadap pengobatannya. Propranolol baru-baru ini

sudah diperkenalkan sebagai pengobatan yang aman dan efektif.

Tapi, bukan berarti tidak ada resiko, tidak semua tumor merespon.
Jadi, masih dibutuhkan terapi tambahan yang bisa mengurangi
durasi pengobatan atau bahkan pemcegah pembentukan
hemangioma.
Pada jurnal ini, mereka mengisolasi stem sel (HemSCs) dan
endhotelial cells (HemECs) dari specimen yang berproliferasi IH.
HEMSCs mempunyai mesenchymal morphology, robust prolferasi,
menjalani multi-lineage differensiasi dan membentuk pembuluh
darah manusia dengan penampilan IH saat diinjeksi subcutan ke
tikus percobaan. Kortikosteroid menghambat pembentukan vessel
formation dengan menekan VEGF-A di HemSCs, tetapi tidak ada
efek terhadap HemECs atau normal human cord blood-derived
endothelial progenitor cells. Walaupun begitu, kortikosteroid tidak
mempunyai efek terhadap proliferasi HemSC. Maka dari itu, di jurnal
disimpulkan bahwa obat yang menghambat proliferasi HemSCs
dapat mencegah pertumbuhan dan proliferasi IH. Untuk
mendapatkan ini, di jurnal disebuktkan bahwa

Results.
A cell-based screen identifies compounds that selectively inhibit
proliferation of HemSCs.
Di jurnal ditulis bahwa mereka mendesign tes proliferasi assay
untuk tes parallel HemSCs dan sumsum tulang-derived stem cells.
BM-MSCs berbagi beberapa karakteristik dengan HemSCs ; ekspresi
dari mesenchymal markers, spindle shaped morphology dan
potensial untuk berdiferensiasi menjadi tulang, lemak dan kartilago.
Kebalikannya dari HemSCs, BM-MSCs tidak membentuk pembuluh
darah saat diinjeksi sebagai single cell type di matrigel ketikus
percobaan.
Dari Sembilan compound yang diidentifikasi, kami memilih
rapamycin untuk penelitian lebih lanjut karena aktivitasnya yang
bisa dipertahankan pada konsentrasi rendah dan keamanannya
sudah disahkan di pediatric clinical trials. Rapamycin dapat
menghambat proliferasi HemSCs hinggal 40% pada konsentrasi
1ng/ml atau lebih tinggi. Sementara BM-MSCs atau normal human
dermal fibroblast kurang sensitive. Proliferating Cell nuclear antigen
digunakan sebagai ukuran tambahan proliferasi. Rapamycin led to
dose-dependent decrease pada persentase PCNA-positive HemSCs
dengan 80% supresi pada 10ng/ml. tidak ada efek terhadap
viabilitas.

Rapamycin merupakan inhibitor dari mTOR (mammalian target of

rapamycin) untuk memverivikasi bahwa rapamycin menginhibisi
mTOR di HemSCs, mereka tes phosphorylasi status dari dua target
mTOR signaling serine/threonine kinase p 70 S6 kinase dan eIF4ebp1. RAPAMYCIN menyebabkan penurunan dose dependent
terhadap serum/ growth factor stimulated levels of phosphorylated
4Ebp1. Untuk memverifikasi mTor target relevant IH, di jurnal
dianalisa lagi upstream regulator AKT. Phosphorylated AKT dideteksi
pada proliferating IH tumor specimens. Kebalikannya, very low
expression dapat diobservasi pada involution IH specimens.
RAPAMYCIN MENEKAN VASCULOGENESIS PADA IH TUMOR MODEL
Selanjutnya, kami tes dari efek systemic rapamycin terhadap dua
model sel dari IH. HemSCs dan cbEPCs dicampur dengan matrigel
dan diinjeksi subkutan ke tikus percobaan. Dua model sel memiliki
keuntungan dari diinjeksi HemSC saja, pertama lebih rpbust
sehingga lebih sensitive dalam mendeteksi dose response activity.
Dua, bisa dites secara terpisah dari efek rapamycin terhadap
HemSC vs cbEPCs, yang merupakan primary ecS yang diisolasi dari
darah plasenta yang dijadikan sebagai prototypic young ECs.
Rapamycin dimasukkan setiap hari melalui intra-peritoneal injection.
Dibandingkan dengan vehicle-injected mice, rapamycin dapat
menyebabkan dose-dependent inhibisi dari vascularisais dari
matrigel implants. Anti-human CD31 staining verified bahwa
rapamycin menginhibisi formasi de novo dari human CD31-positive
blood vessels : CD31-Positive cellse terdeteksi tetapi tanpa lumen
formation. Rapamycin juga menghambat vessel formation saat
HemSC ditanam sendiri. Dua penghambat mTOR, everolimus dan
temsirolimus, diinjeksi sistemik dan terbukti dapat menghambat
formasi dari pembuluh darah.
Untuk membuktikan HemSCs target untuk rapamycin, versus the
cbEPCs atau murine host cell, mereka pre-treated HemSCs dengan
rapamycin selama tiga hari dalam in vitro, dibersihkan, rapamycintreated di resuspended atau mengendalikan HemSCs dengan
cbEPCs dalam matrigel dan diinjeksikan kedalam tikus percobaan.
Pre-treatmen pada HemSCs dengan rapamycin menunjukkan
penghambatan sebesar 80% terhadap pembentukan pembuluh
darah. Pre treatment cbEPCs tidak mempunyai efek apapun. Hasil
ini membuktikan bahwa HemSCs directly targeted by rapamycin.
An Anti proliferative drug is not sufficient to inhibit vasculogenesis in
ViVO
Kami berhasil mengidentifikasi rapamycin berdasarkan preferential
inhibition of HemSCs proliferasi. Lalu dites lagi apakah terdpat
antiproliferative effect yang sama bila menggunakan obat yang
berbeda, apakah anti-vasculogenic. Untuk melakukan ini, kami

menggunakan obat antiproliferative roscovitine, purine analogue

dan cyclin-dependent kinase inhibitor. Pertama dititrasi effect dari
roscovitine pada HemSCs proliferasi, terdapat efek yang sama
rapamycin, assayed pada experiment yang sama. Selanjutnya di
pre-treated HemSCs in vitro selama tiga hari dengan roscovitine
atau rapamycine, dibersihkan, lalu sel diinjeksi dengan untreated
cbEPC kedalam tikus. Rapamycin inhibited microvessel density
sebesar 60%. Sebaliknya, roscovitine tidak. Hasil ini membuktikan
pretreatmen HemSC in vitro dengan anti proliferative drug tidak
cukup untuk mengurangi vasculogenic potential.
HemSC self renewal and multi lineage differentiation are disrupted
by rapamycin
Aktivitas mTOR terbukti penting dalam mempertahankan
pemberharuan stemcell. Untuk membuktikan kapasitas
pemberharuan dari HemSCs, dilakukan clonogenic assay. Pretreatmen dari HemSCs dengan rapamycin didapatkan hasil
penurunan 60% untuk jumlah HemSC colonies yang terbetuk dalam
9 hari. Moreover, penumpukan colonies menjadi groups dengan
peningkatan jumlah sel membuktikan rapamycin pretreatmen
menghilangkan penampilan colonies dengan >500cells, mengurangi
persentasi dari clonies dengan 100-250 atau 250-500 celss
percolony dan peningkatan persentasi colonies dengan 10 atau
kurang. Hasil ini memperlihatkan bahwa pre-treatmen dari cells
dengan rapamycin selama 4 hari menghasilkan berkurangnya
jumlah dari proliferative clones. Clonally derived population dari
HemSCs mempunyai kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi ECs
dan adipocytes dalam in vitro dan in vivo. Di assay apakah multilineage differentiation dari HemSCs dapat altered oleh rapamycin.
Rapamycin memblok ekspresi dari adipgenic markers lipoprotein
lipase. CCAAT enhancer binding protein alpha dan akumulasi dari
lipid droplet saat HemSC were wubjected to an adipogenic
differentiation protocol. Tidak ada efek yang ditemukan pada
kemampuan HemSC untuk berdiferensiasi dibawah empiricallydefined in vitro condition, terhadap endothelial phenotype.
Observasi ini mengindikasikan bahwa rapamycin menghambat
adipogenic differentiative activity of HemSCs.
Rapamycin leads to mesenchymal maturation dan impaired
vasculogenic potential
Reduksi pada self-renewal capacity dan inhibisi dari adipogenesis
memperlihatkan bahwa rapamycin mendorong HemSCs untuk
maturasi melewati state of multipotency. Bersambungan dengan
hypothesis ini, HemSCs diinukbasi dengan rapamycin mempunyai
elongasi morphology dibandingkan dengan control cells. Maka dari
itu kami tes apakah rapamycin-treated HemSCs akan berdiferensiasi
terhadap smooth muscle cell atau pericytic phenotype. Sebagai

control positive, kami menggunakan endothelial co-culture untuk

menstimulasi HemSCs terhadap SMC/Pericytic differentiation. Sama
terhadap co-cultures dari mesenchymal progenitor cells dan ECs
saat clonal HemSCs are co-cultured dengan ECs terdapat
upregulation terhadap SMC dalam HemSCs dimulai pada hari ketiga.
Inkubasi dari HemSCs dengan rapamycin selama 4 hari
menunjukkan upregulation dari smooth muscle myosin heavy chain
dan SM22-Alpha transcript levels. Hal yang sama juga terjadi pada
SM22-alpha dan alpha smooth muscle actin yang meningkat pada
protein level. Ekspresi level dari calponin, NG2 dan PDGF-Rbeta
tidak berubah. Untuk tes functional features dari SMCs, dianalisa
calcium influx di HemSC treated dengan rapamycin atau DMSO
selama 6 hari. Hasilnya mengindikasikan rapamycin-treated HemSC
mengekspresikan L-type voltage gated channels. Untuk
memverivikasikan bahwa mesenchymal maturation mempunyai
efek negative terhadap vasculogenic capability, kami plated HemSC
sendiri atau dengan cbEPC selama 4 hari, setelah 4 hari cbEPCs
terpisahkan dari HemSCs menggunakan anti-CD31-conjugated
magnetic beads. HemSC yang terdiferensiasi digabungkan dengan
cbEPC segar yang disuspensi di matrigel dan diinjeksikan ke tikus
percobaan. Prior co-culture menujukkan penurunan sebesar 75%
dalam hal microvessel density. Penemuan ini mengindikasikan
independent of the means by terdapat induksi diferensiasi
mesenchymal, antara rapamycin pre-treatment atau endothelial coculture, vasculogenic potential dari HemSCs tidak ada.