Deteksi elektrokimia asam lemak non-esterifikasi oleh elektroda

enzim dengan rakitan lapis demi lapis

Abstrak
Dalam studi ini, deteksi dan pengukuran konsentrasi asam lemak nonesterifikasi (NEFA) telah dicapai dengan metode elektrokimia dalam satu
langkah
operasi.
Lapisan
tipis
multilayer
dari
poli(dimethyldiallyammonium klorida) (PDA) dibungkus dengan multi-wall
karbon nanotube (MWCNTs) dan dua enzim asil-CoA sintetase (ACS) dan
asil-CoA oxidase (ACOD) berkumpul di layar karbon elektroda dicetak oleh
imobilisasi lapisan demi lapis (LBL). Lapisan halus polimer-enzim yang
diproduksi dengan metode LBL, memungkinkan transportasi
massa dari reaktan mengalir ke bawah lapisan untuk mencapai
reaksi enzim dua langkah. Polimer-CNTs dan elektroda enzim yang
dimodifikasi memperlihatkan sifat electrokatalitik yang baik dalam
mempertahankan aktivitas enzim. Peningkatan linear arus anoda dari
H2O2 hasil dari oksidasi NEFA diamati dengan peningkatan konsentrasi
asam oleat. Hasil ini menunjukkan teknik menjanjikan dalam hal
kesederhana, kecepatan dalam penentuan satu langkah dari NEFA untuk
pengelolaan diabetes.

Introduction
Diabetes merupakan beban masyarakat yang utama dalam bidang
kesehatan dan sosial-ekonomi . Dengan peningkatan orang yang
didiagnosis ndengan diabetes tipe 2 (T2D), harus ada lebih banyak cara
untuk memantau tidak hanya kadar glukosa darah tetapi juga
metabolisme lainnya yang terkait dengan T2D. Hal ini semakin dipahami
bahwa diabetes adalah gangguan metabolisme energi yang melibatkan
pemanfaatan gula dan lemak. Pasien dengan T2D sering
menunjukkan tingkat asam non-esterifikasi lemak (NEFA)yang
lebih tinggi, terkait dengan peningkatan resistensi insulin (IR) dan
tingkat pembuangan glukosa miskin (GDR) [2,3]. NEFA adalah sumber
bahan bakar otot rangka yang penting. Perubahan dalam NEFAs plasma
adalah indikator yang berguna dari tingkat lipolisis. Banyaknya NEFAs
sebanyak 10% dari asam lemak darah total, biasanya dengan kisaran
konsentrasi fisiologis antar 0,1-1,8 mmol/L [4]. Penyimpangan yang kronis
konsentrasi NEFA di T2D mungkin terlibat dalam disfungsi -cell dan
apoptosi[5]. Konsentrasi plasma NEFA digunakan sebagai penanda
diagnosis untuk mengidentifikasi orang-orang yang lebih besar berisiko

untuk perkembangan T2D sebelum munculnya resistensi dan cacat

sekresi insulin. Hal ini penting dalam awal diagnosa T2D, menilai tingkat
serangan jantung miokardial dan penyakit yang berhubungan dengan
obesitas lainnya. Keberadaan pengelolaan diabetes mempromosikan
pemantauan sendiri terhadap glukosa darah untuk penanganan penyakit
dan pencegahan sekunder [6]. Pemantauan dari perubahan baik gula
maupun NEFA selama proses metabolisme akan memberikan diagnosis
yang lebih akurat, dan kemudian lebih efektif untuk pencegahan dan
pengelolaan penyakit.

Deteksi NEFA dalam darah dilakukan sejak tahun 1950-an, metode

yang dikembangkan selama ini didasarkan baik pada titrasi kolorimetri
asam lemak dengan adanya indikator pH [9] maupun spektrofotometri
atau dengan menggunakan pengukuran radiokimia kompleks asam lemak
dengan ion logam divalen seperti Cu2+, Ni2+ atau Co2+[10]. Metode-metode
ini memakan waktu dan menunjukkan kurangnya sensitivitas yang baik.
Metode lain menggunakan pengukuran spektroskopi yang berbeda,
seperti kromatografi cair-spektroskopi massa dan Fourier Transform
inframerah telah dikembangkan selama dekade terakhir [11,12].
Hanya terdapat sedikit sekali laporan tentang deteksi elektrokimia
dari NEFA dalam plasma atau serum darah [13,14]. Karube et al. telah
melaporkan sensor elektrokimia NEFA yang pertama yang didasarkan
pada reaksi enzim yang memanfaatkan asil-CoA sintetase (ACS) dan asilCoA oksidase (ACOD) [14]. Mereka memantau konsumsi oksigen terlarut
dengan dua reaksi berurutan yang dikatalisasi oleh enzim terimobilisasi
dalam resin foto-lintas-linkable poli(vinil alkohol). Korelasi linear antara
penurunan arus dan 0,3-2,6 mM asam oleat atau palmitat diamati.
Namun, metode seperti 'sinyal-off' kurang memiliki spesifisitas yang tinggi
karena banyak gangguan potensial yang dapat menyebabkan penurunan
arus pada injeksi sampel dimana hal ini juga dialami oleh metode
imobilisasi mereka dengan teknik jebakan enzim dalam lapisan membran.
Sampai saat ini, terdapat dua uji kolorimetri enzimatik in-viitro
komersial yang tersedia untuk penentuan kuantitatif NEFA dalam serum
sampel. Mereka diproduksi oleh diagnosa Wako dan Roche yang secara
berturut-turut digunakan untuk mendeteksi asam oleat dan asam palmitat
[15,16]. Kedua metode didasarkan pada studi yang diterbitkan oleh
Sakaru et al. [17]. Hal tersebut mengandalkan pada konversi pertama
NEFA menjadi asil-koenzim A (asil CoA) dengan adanya asil-CoA sintetase
(ACS) (Skema 1). Asil-CoA yang dihasilkan dioksidasi oleh asil-CoA oxidase
(ACOD) dengan generasi hidrogen peroksida (H2O2). Dengan keberadaan

peroksidase (POD), hidrogen peroksida yang terbentuk menghasilkan

pigmen merah atau biru/ungu dengan oksidasi kondensasi kuantitatif
menggunakan
TBHB
atau
3-metil-N-etil-N-(betahydroxyethlyl)aniline(Meha), yang dapat diukur dengan spektrometer UV pada panjang
gelombang tertentu
Metode ini mahal, memakan waktu dan hanya dapat dioperasikan di
laboratorium. Oleh karena itu, NEFAs tidak dapat secara rutin diperkirakan
kecuali dalam kontek studi klinis tertentu meskipun NEFAs penting dalam
penelitian diabetes dan penyakit. Jika H2O2 dihasilkan dari langkah 2,
oksidasi asil-CoA oleh ACOD dengan adanya oksigen, dapat dideteksi
secara elektrokimia, hal ini seharusnya memungkinkan untuk menentukan
konsentrasi NEFA elektrokimia dari jumlah H 2O2, mirip dengan metode
kolorimetri. Hal ini bisa memberikan metode yang masuk akal untuk arus
elektrokimia yang berdasarkan biosensor glukosa untuk mengembangkan
platform biosensor multipleks untuk pengukuran simultan dari
metabolisme yang berbeda.

Penelitian ini akan melihat deteksi elektrokimia H 2O2 dari reaksi

dalam Skema 1, menggunakan asam oleat (OA) sebagai NEFA yang
menjadi pusat perhatian. Itu dipilih sebagai peneletian NEFA dalam
penelitian ini karena merupakan salah satu NEFAs plasma yang paling
banyak dan fungsionalnya yang terserap dalam otot dan hati adalah
sama dengan total NEFA.
Teknik Lapis demi lapis (LBL) adalah salah satu metode yang paling
menjanjikan untuk modifikasi permukaan dan imobilisasi biomolekul
karena kesederhanaan, fleksibilitas dan berbagai bahan dapat digunakan
untuk perakitan film dalam metode tersebut [19,20]. Metode tersebut
sebagian besar didasarkan pada pemasangan elektrostatik dari muatan
polielektrolit yang berlawanan dengan muatan permukaan padat. Metode
tersebut sudah banyak digunakan untuk pelapisan fungsional, bahan
enkapsulasi, biosensing dan aplikasi lainnya [21-24]. Karena enzim juga
polielektrolit, yang mana muatannya tergantung pada titik
isoelektrik (Ip) dari protein dan pH larutan, mereka dapat dengan
mudah bergerak dalam film LBL tanpa dehidrasi dan reaksi kimia
yang kompleks. Dengan cara ini, simapan elektrostatis enzim
dapat menyisakan aktivitas biologis yang baik [25]. Namun,
umumnya polielektrolit digunakan dalam teknik LBL seperti poli
(allyalmine hidroklorida) (PAH) / poli (sodium 4-styrenesulfonate) (PSS)
dan poli (dimethyldiallyammonium klorida) (PDA) / asam polymethacrylic
(PMAA) biasanya nonconduktif secara elektrik, yang akan menjadi faktor

pembatas bagi mereka untuk digunakan dalam perangkat bioelektronik

[23,26].
Karbon nanotube (CNT) telah menarik perhatian besar sebagai
bahan fungsional untuk persiapan elektroda enzim dan biosensor karena
sifat elektrokatalitik yang unik dari mereka [27-30]. PDA adalah polikation
kuat yang dapat dengan baik diserap pada karbon atau elektroda emas
[31,32]. PDA telah dilaporkan memiliki afinitas yang baik untuk CNT dan
nanopartikel emas (GNPs) [33]. Gabungan PDA konduktif dapat digunakan
untuk imobilisasi enzim dengan cara LBL untuk aplikasi biosensor
elektrokimia [34,35].
Dalam pekerjaan ini, gabungan PDA-MWCNT dipekerjakan untuk LBL
pembuatan elektroda enzim yang mengandung dua enzim: ACS dan ACOD
pada cetakan elektroda karbon (C-SPE); enzim dimodifikasi menjadi
elektroda digunakan untuk deteksi NEFA melalui pengukuran arus oksidasi
H2O2
hasil
dari
reaksi
enzim.
Multilayer
dipilih
di
urutan
polimer/ACOD/polimer/ACS, untuk menjaga ketetapan dengan reaksi
enzimatik. Hubungan linear yang baik antara konsentrasi NEFA dan arus
oksidasi H2O2 diperoleh, menunjukkan satu langkah deteksi NEFA dicapai.
Ini menyediakan dasar yang kuat untuk pengembangan platform sensor
multipleks lebih lanjut.

2. Percobaan
2.1 Bahan
Garam litium Oleoil koenzim A (OACoA), garam litium palmitoil koenzim A
(PACoA), garam natrium hidrat Koenzim A (CoA), garam disodium hidrat
adenosine 5-triphosphate (ATP), poli(dimethyldiallyammonium klorida)
(PDA) (Mw=200-250 kDa), natrium dihidrogen fosfat mengalami dehidrasi,
dinatrium hidrogen fosfat dan kalium ferricyanide (K 3[Fe(CN)6]) yang dibeli
dari Sigma-Aldrich (Dorset, Inggris). 1 mM asam oleat (OA) adalah larutan
standar Wako NEFA dibeli dari Wako HR-seri NEFA-HR (2) enzimatik NEFA
assay kit (Neuss, Jerman); asil-CoA sintetase (ACS) juga dipasok dari uji kit
ini dalam campuran solid dengan CoA, ATP dan reagen beberapa lainnya
(R1A) [16]. Solusi enzim dibuat dengan melarutkan reagen R1A di PBS
dengan konsentrasi ACS dari 4 U / ml. ACOD dibeli sebagai enzim murni
dari Wako Kimia GmbH (Jerman). Karya validasi optik dilakukan
menggunakan asam lemak bebas Roche, tes Half-mikro dari Roche
diagnostik (Penzberg, Jerman). Sampel plasma pasien disediakan oleh
Newcastle Medical School (Newcaslte pada Tyne, Inggris). MWCNTs
dengan diameter dalam dari 20-50 nm dan luar diameter 70-200 nm

diperoleh dari Applied Sciences Inc. (Ohio, USA). C-SPE (Model DRP-C110)
berasal dari perusahaan Dropsens (Oviedo, Spanyol) [36]. Elektroda
memiliki diameter bekerja elektroda 0.40 cm dan luas 0,13 cm2. Referensi
elektroda adalah perak / ion perak (Ag) dan elektroda counter karbon.
Dimensi dari elektroda adalah 3,40 cm 1,00 cm 0,05 cm (panjang
lebar tinggi) masing-masing. Ini elektroda pakai digunakan sebagai
dibeli tanpa pra-pengobatan. Potensi digunakan dalam penelitian ini
didasarkan pada referensi elektroda Ag kecuali dinyatakan menyatakan.

2.2. Fabrikasi enzim C SPE Lapis demi lapis

Larutan PDA-MWCNT disiapkan dengan mencampur 3 mg dari
MWCNTs di 5 ml 1% PDA bawah sonikasi selama 3 jam dan suspensi
dibiarkan semalam untuk setiap bahan padat sedimen. Setengah bagian
atas dari larutan PDA-MWCNT digunakan. Enzim elektroda (PDAMWCNT/ACOD)n dirakit untuk Penentuan asil CoA dan elektroda bi-enzim
(PDA-MWCNT / ACS / PDA-MWCNT / ACOD)n dirakit untuk penentuan NEFA.
Untuk merakit lapisan multilayer dari (PDA-MWCNT/ACOD) di
elektroda, larutan sebanyak 15 l PDA-MWCNT diteteskan ke elektroda
pada suhu 4C selama 30 menit. Elektroda tersebut kemudian dicuci
dengan 15 l PBS dua kali untuk menghilangkan jumlah yang berlebihan
dari PDA-MWCNT yang tidak atau lemah teradsorpsi. Setelah itu, 15 l
ACOD (4U/ml) larutan diteteskan ke modifikasi elektroda PDA-MWCNT
pada 4C selama 30 menit. Elektroda tersebut kemudian dicuci lagi
dengan 15l dari PBS dua kali untuk menyelesaikan lapisan penyalut
ganda (PDA-MWCNT/ACOD) pertama pada elektroda. Dua lapisan ganda
(PDA-MWCNT / ACOD) telah berkumpul di elektroda untuk fabrikasi enzim
elektroda. Lapisan multilayer dirakit tanpa pengeringan selama tiap-tiap
langkah deposisi. Elektroda bi-enzim disiapkan dengan cara yang sama
dengan alternatif lapisan PDA-MWCNT/ACS dan PDA-MWCNT/ACOD. Satu
atau empat multi-lapisan (PDA-MWCNT / ACS / PDA-MWCNT / ACOD)
berkumpul, masing-masing. Skema untuk proses perakitan ditunjukkan
pada Gambar. 1. Dispersi MWCNT pada muatan positif polikation PDA
adalah mungkin karena lemahnya interaksi supramolekul antara mereka,
yang mengikat secara elektrostatis ke muatan negatif (polyanion) asilkoenzim A oxidase (ACOD) pada pH 7,4, sebagai titik isoelektrik ACOD
adalah 5.5 [37].

2.3. Pengukuran elektrokimia

Pengukuran elektrokimia dilakukan oleh Autolab potensiostatgalvanostat

(PGSTAT302).
Linear
sweep
voltammetry
dan
chronoamperometry dilakukan dalam 0,1 M PBS dengan variasi
konsentrasi PACoA / OACoA atau OA. Perbedaan konsentrasi PACoA/OACoA
dicapai dengan menambahkan sedikit 10 mM larutan PACoA/OACoA ke sel
yang terisi 0,5 ml PBS. Untuk penentuan OA pada elektroda bi-enzim,
perbedaan konsentrasi OA dicapai dengan pengenceran 1 mM larutan
standar OA dalam sel yang terisi dengan PBS yang mengandung ATP dan
CoA sebagai kofaktor untuk asilasi reaksi NEFA (langkah 1 dalam Skema
1). konsentrasi ATP dan CoA keduanya dikendalikan menjadi 1 mM dalam
larutan untuk setiap analisis konsentrasi asil-CoA/NEFA. Pengukuran
impedansi elektrokimia dilakukan untuk memantau pembentukan lapisan
dalam 5 mM K3[Fe(CN)6] sebagai probe redoks dalam rentang frekuensi
antara 0,1 Hz dan 100.000 Hz, pada potensial tetap 0,17 V. Amplitudo dari
alternatif tegangan adalah 10 mV. Semua percobaan elektrokimia
dilakukan pada suhu kamar.

2.4. Validationof deteksi elektrokimia NEFA terhadap metode kolorimetri

Beberapa konsentrasi OA dari 0,0 mM ke 0,9 mM diukur dengan
metode kolorimetri menggunakan larutan standar NEFA komersial dari
Wako[16] dan metode elektrokimia kami pada elektroda enzim, berturutturut. Masing-masing konsentrasi diukur tiga kali dan nilai rata-rata
digunakan untuk memperoleh grafik kalibrasi untuk
masing-masing
metode. 0,3 mM dan 0,6 mM sebagai dua konsentrasi OA yang diketahui
diukur tiga kali secara independen oleh kolorimetri dan metode
elektrokimia, dan nilai rata-rata yang diperoleh dari masing-masing
konsentrasi digunakan agar sesuai dengan kurva kalibrasi dari setiap
metode, masing-masing.
2.5. Deteksi elektrokimia NEFA dalam plasma manusia pada elektroda
enzim
Sampel plasma pasien disediakan oleh Sekolah Newcastle Medis
dimana pertama-tama diencerkan ke dalam konsentrasi yang berbeda
dengan buffer PBS dan kemudian dianalisis dengan Roche kit untuk
menentukan konsentrasi NEFA. Sampel yang sama kemudian dianalisis
dengan

Metode

elektrokimia

MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS).

pada

elektroda

Pengukuran

enzim

elektrokimia

linear sweep voltammetry dan chronoamperometry.

(PDA-

mencakup

3. Results and discussion

3.1. Penentuan PACoA di C-SPE dengan ACOD dalam larutan
Deteksi PACoA yang merupakan bentuk terasilasi dari NEFA asam
palmitat (PA) (langkah 1 dalam Skema 1) berkaitan dengan penentuan PA,
demikian NEFAs. Pertama, kelayakan penentuan PACoA dari reaksi enzim
dilakukan pada C-SPE yang memiliki ACOD dan PACoA dalam larutan PBS.
Gambar. 2a menunjukkan chronoamperometry yang (CA) (E = 500 mV)
untuk konsentrasi PACoA hingga 1,2 mM. Grafik kalibrasi A (Gbr. 2b)
diperoleh dari arus yang dihasilkan dalam 500 s. peningkatan arus
Linear diamati dengan meningkatnya konsentrasi PACoA. Arus
oksidasi ini terkait dengan dekomposisi H 2O2 menjadi O2. Jumlah
H2O2 yang dihasilkan dari reaksi sebanding dengan jumlah PACoA.
Hasil ini menunjukkan bahwa pendeteksian PACoA secara
elektrokimia adalah layak. Demikian pula, deteksi elektrokimia
OACoA, bentuk terasilasi OA juga dicapai (Gambar. S1).

3.2. Pembuatan dan karakterisasi polimer-enzim multilayer dimodifikasi

elektroda
Teknik LBL diterapkan untuk membuat elektroda enzim dengan
imobilisasi ACOD dan ACS pada polimer PDA. Spektroskopi impedansi
elektrokimia (EIS) digunakan untuk memantau perubahan resistensi
transfer muatan (Rct) selama perakitan lapisan tipis multilayer dari (PDAMWCNT/ACOD) atau (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS) selama proses
modifikasi. Pemilihan 0,17 V adalah karena besarnya tegangan tersebut
dekat dengan keseimbangan tingkat reduksi dan oksidasi dari pasangan
K3[Fe(CN)6]:K4[Fe(CN)6], dan spesies redoks tidak akan habis di dekat
permukaan elektroda selama pengukuran impedansi [31]. Gambar. 3
menunjukkan plot Nyquist dari modifikasi elektroda dengan berbagai
lapisan (PDA-MWCNT/ACOD). Diameter Unsur semicicular masing-masing
sesuai dengan Rct, yang pada 1000 pada C-SPE sebelum modifikasi
permukaan; nilai tersebut meningkat menjadi 3400 setelah satu lapisan
(PDA/MWCNT/ACOD) diendapkan pada elektroda dan peningkatan lebih
lanjut untuk sekitar 5000 setelah dua lapisan. Rct meningkat seiring
dengan peningkatan jumlah lapisan lapisan polimer-enzim. Hal ini
juga diamati dengan pembentukan lapisan polimer-bienzyme (PDA-

MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS) (data tidak ditampilkan). Resistensi

transfer muatan mengontrol probe redoks proses kinetik transfer elektron
pada antarmuka elektroda [38], dan Rct tergantung pada fitur dielektrik
dan isolasi pada elektroda/elektrolit antarmuka [39]. Peningkatan Rct
karena polimer dan deposisi enzim mengkonfirmasi langkah-langkah
pembentukan film multilyer.

3.3 penentuan
termodifikasi

PACoA

pada

multilayer

(PDAMWCNT/ACOD) 2

C-SPE

Gambar. 4 menunjukkan voltamogram linear sweep pada elektroda

C-SPE dimodifikasi dengan lapisan (PDA-MWCNT/ACOD) 2 dengan
konsentrasi PACoA yang berbeda (hingga 1,2 mM). Arus meningkat
dengan meningkatkan konsentrasi PACoA. Kurva kalibrasi
diperoleh pada 500 mV memperlihatkan korelasi linear (R 2 = 0.99)
antara konsentrasi PACoA dan arus oksidasi, yang berasal dari
H2O2 hasil oksidasi PACoA oleh ACOD dan oksigen. Hal ini sesuai
dengan studi larutan dalam Bagian 3.1. Hal ini menunjukkan bahwa
aktivitas ACOD dipertahankan dalam multilayer PDA-MWCNT, dan
elektroda enzim dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi PACoA.
OACoA juga ditentukan berdasarkan elektroda enzim ini dalam cara yang
sama (Gambar. S2).

3.4. Penentuan NEFA dalam

termodifikasi

(PDACNT / ACOD / PDACNT / ACS) C-SPE

Setelah penegasan dari bfungsi multilayers PDA-MWCNTACOD untuk menentukan konsentrasi PACoA, elektroda enzim
mengandung enzim ACOD dan ACS dibuat untuk penentuan
konsentrasi asam oleat.
Gambar. 5a menunjukkan LSVs diperoleh dari berbagai konsentrasi
OA
pada
C-SPE
termodifikasi
dengan
(PDA-MWCNT/ACOD/PDAMWCNT/ACS)1. Kalibrasi OA (Gambar. 5b) diperoleh pada 500 mV
menunjukkan korelasi linier yang baik antara konsentrasi OA dan arus
oksidasi, menunjukkan metode yang menjanjikan untuk penetuan NEFA
dengan satu langkah operasi. Puncak sekitar 370 mV ini disebabkan oleh
ACS yang digunakan dari kotak penetuan NEFA Wako komersial.
Untuk menguji pengaruh jumlah lapisan polimer-enzim pada
respon arus, tes spiking OA dilakukan pada satu lapisan bienzyme
dari (PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ ACS) 1 dan empat lapisan

bienzyme
dari
(PDA-MWCNT/ACOD/PDA-MWCNT/ACS)4.
Hasil
penelitian menunjukkan bahwa metode LBL menghasilkan
ketebalan yang baik dari lapisan polimer-enzim. Dan lapisan ini
tidak mencegah transportasi massa reaktan mengalir ke bawah lapisan
untuk memenuhi dua langkah reaksi enzimatik secara berurutan (Gambar.
S3). Elektroda dengan empat lapisan bienzyme menunjukkan
respon arus yang lebih tinggi daripada satu lapisan elektroda
bienzyme baik sebelum maupun setelah menambahkan OA. Hal ini
disebabkan oleh arus lebih banyak dihasilkan dari jumlah lapisan polimerenzim yang lebih banyak pula, dan peningkatan jumlah enzim ini. Lapisan
satu bienzyme dari (PDA-MWCNT / ACOD / PDA-MWCNT / ACS) 1 umumnya
diadopsi sebagai kondisi perakitan multilayer untuk deteksi NEFA dalam
studi arus kecuali dinyatakan lain, yang merupakan kondisi yang optimal
untuk fabrikasi elektroda enzim yang sangat reptoducible dan juga untuk
deteksi NEFA efektif.

3.5. Validasi deteksi elektrokimia NEFA terhadap metode kolorimetri

Dengan metode elektrokimia dan metode kolorimetri, secara
berturut-turut 0,3 mM dan 0,6 mM sebagai dua konsentrasi OA yang
diketahui diukur secara independen. Arus yang dihasilkan dari dua
konsentrasi ini pada elektroda termodifikasi menunjukkan kesesuaian
yang bagus di kurva kalibrasi yang diperoleh sebelumnya oleh metode
elektrokimia (Gambar. 6a) (kesalahan 2.7% dan 1.1%, berturut-turut). Hal
ini konsisten dengan pembacaan diperoleh dengan metode kolorimetri
menggunakan kit penentuan NEFA komersial dari Wako (Gambar. 6b)
(kesalahan adalah 5,9% dan 1,0%, masing-masing). Hasil ini
mengkonfirmasi bahwa metode elektrokimia menggunakan elektroda
multienzim sangat handal dan direproduksi untuk penentuan NEFA.
Pekerjaan lebih lanjut akan dilakukan untuk menyelidiki efek dari
gangguan dan menguji dengan sampel serum.

3.6. Deteksi elektrokimia NEFA dari plasma manusia

Elektroda enzim digunakan untuk sampel plasma manusia untuk
deteksi NEFA dalam kondisi aplikasi nyata. Sampel dari satu
pasien telah dipilih untuk penelitian, Konsentrasi NEFA pertama
dianalisis oleh kit Roche, dan mereka dianalisis secara
elektrokimia menggunakan elektroda enzim. Seperti yang
ditunjukkan pada Gambar. 7, hubungan linear antara konsentrasi sampel
dan arus (E = 500 mV) dihasilkan dari voltamogram linear sweep.
Karakterisasi oleh chronoamperometry menunjukkan hasil yang sangat
konsisten (Gambar. S4). Rentang arus yang diperoleh dari sampel plasma

lebih tinggi daripada yang dihasilkan

dari pengukuran standar OA
(Gambar. 5b). Hal ini diharapkan karena ada beberapa gangguan hadir
dalam plasma manusia, yang bervariasi pada pasien yang berbeda dan
juga dengan waktu. Karena profil pasien yang berbeda, matriks kalibrasi
perlu dibentuk untuk meningkatkan penentuan NEFA oleh elektroda enzim
dalam aplikasi nyata.
Namun, hal tersebut dapat diharapkan bahwa lapisan polimer-enzim
yang dirakit pada permukaan elektroda sudah dapat memberikan
beberapa pencegahan dasar ikatan non-spesifik dari biomolekul lainnya
(yang mengganggu) dibandingkan dengan elektroda telanjang. Juga, salah
satu Keuntungan dari teknik LBL adalah kemampuan menggabungkan
polimer yang berbeda untuk multifunctionalities dalam film. Berbeda
polimer seperti bovine serum albumin, poli (asam metakrilat) dan poli
(sodium stirena sulfonat) sedang diselidiki sebagai tambahan melapisi
lapisan pada film enzim ini, bertujuan untuk memberikan peningkatan
stabilitas dan mengurangi gangguan.

4. Kesimpulan
Elektroda bi-enzim dibuat menggunakan konfigurasi lapis demi lapis
mengandung multilayer dari lapisan tipis PDA-MWCNT/enzim komposit
untuk deteksi elektrokimia NEFA. Konsentrasi NEFA ditentukan dengan
mengukur arus oksidasi H2O2. Sebagai produk dari oksidasi asil-CoA untuk
rute Beta oksidasi untuk NEFA, jumlah H2O2 sebanding dengan jumlah
substrat. Enzim ACS dan ACOD memiliki aktivitas biologis yang tetap
dalam lapisan, dan elektroda enzim menunjukkan aktivitas elektrokatalitik
yang baik untuk langkah oksidasi NEFA. Lapisan polimer-enzim yang
diproduksi baik dengan metode LBL mengijinkan transportasi massa dari
reaktan mengalir ke bawah lapisan untuk mencapai reaksi enzim dua
langkah. Hubungan linier yang baik antara konsentrasi NEFA dan arus
oksidasi menunjukkan teknik yang menjanjikan untuk satu langkah
penentuan NEFA untuk pengeloalaan diabetes. Membangun matriks
kalibrasi membuktikan butuhnya menggunakan elektroda bi-enzim untuk
Penentuan NEFA dalam aplikasi klinis nyata. Karya ini memberikan
teknologi untuk platform sensor multipleks mengukur berbagai biomarker
metabolisme secara bersamaan.