USILAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA IAL RAMADHASE MANFAATAN LL. KAWAH JEN PRODUKS ENZIM L-ASPARAGINAS \s SEBAGAI FOOD ADDITIVE FUNGSIONAL. ENZIM KOME PENCEGAH SERANGAN KANKER Diusulkan oleh : Laila Karomah NIM. 101810401027 (Angkatan 2010) Ramadhani NIM. 101810401005 (Angkatan 2010) Bagus Setyabudi NIM. 101810401038 (Angkatan 2010) Ryan Prajonggo NIM. 111810401037 (Angkatan 2011) Nindita Fitria Primasari_ NIM. 121810401001 (Angkatan 2012) UN RSITAS JEMBER JEMBER 2013HALAMAN PENGESAHAN 1. Judul Penelitian : Produksi Enzim Komersial Ramadhase™ Pemanfaatan Enzim L-asparaginase Termofilik Asal Kawah Ijen Sebagai Food Addictive Fungsional Pencegah Serangan Kanker ee a) Nama Lengkap b) NIM c) Jurusan d) Universitas e) Alamat Rumah 6. Dosen Pembimbing a, Nama Lengkap b. NIDN cc. Alamat rumah d. No.telepon/HP 7. Biaya kegiatan total © =DP2M DIKTI © Sumber lain 8. Jangka Waktu Pelaksanaan Menyetujui, Ketua Jurusan Dr. Rer.Nat. Kartika Senjarini NIP. Pembantu Rektor bidang Kemahasiswaan Prof. Dr.£k. Mohammad Shaleh. NIP. 195608311984031002 Bidang kegiatan — : PKMP- Bidang ilmu :MIPA Ketua pelaksana kegiatan/penulis utama Anggota pelaksana kegiatan/penulis, : Laila Karomah 2 101810401027 : Biologi : Universitas jember : Jalan Kalimantan 8/3 : 4orang ‘sti Utarti, SP.,M.Si + Perum Muktisari 123, Jember + 081233661866 + Rp. 12.500.000,- :4 bulan Jember, 25 Oktober 2013 Ketua pelaksana kegiatan aila Karomah NIM:101810401027 Dosen Pembimbing Esti Utarti, SP. M.S NIDN:BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Kebiasaan_masyarakat_- mengonsums jajanan yang digoreng seperti tempe mendoan, bakwan, kentang goreng bahkan ayam goreng tepung secara klinis dapat meningkatkan resiko terkena kanker (Fardiaz, 2002). Peningkatan resiko serangan kanker ini terjadi akibat pembentukan senyawa akrilamid yang melibatkan reaksi antara asam amino asparagin dan karbohidrat yang terkandung dalam bahan makanan pada suhu tinggi (NCI, 2008). Akrilamid dinyatakan sebagai substansi yang diduga bersifat karsinogen (memicu pertumbuhan kanker) oleh IARC (International Agency for Research on Cancer) berdasarkan studi yang dilakukan pada tikus yang diberi akrilamid pada air minumnya (Fubr et al, 2006). NCI (2008) juga menyebutkan bahwa akrilamid adalah senyawa neurotoksin (racun yang mampu merusak syaraf). Aktivitas akrilamid sebagai neurotoksin dilaporkan oleh Mulloy (1996) yang menyebutkan bahwa paparan akrilamid yang tinggi pada pekerja tambang yang bekerja di bagian pemumian air (pada proses tersebut, digunakan akrilamid dengan jumlah besar sebagai penjernih air) mengalami kerusakan sistem syaraf. Pembentukan akrilamid pada kentang goreng dapat diminimalisir dengan mencuei potongan kentang hingga kadar amilumnya berkurang. Namun, cara tersebut tidak efektif untuk jajanan yang berbahan dasar tepung seperti gorengan tahu, tempe dan bakwan, Permasalahan ini dapat diatasi dengan menghilangkan asam amino asparaginin menggunakan enzim L-asparaginase (EC 3.5.1.1). Enzim L-asparaginase mampu mengkatalis hidrolisis rantai samping (side chain) asparaginin menghasilkan L-aspartat dan amonia (Sigh dan Srivasthava, 2012). Namun, pembentukan akrilamid terjadi pada suhu yang relatif tinggi ( 120°C) dan otomatis membutuhkan enzim yang memiliki sifat termostabil (dapat mempertahankan bentuk aktifnya pada suhu yang sangat tinggi). Enzim yang bersifat termostabil umumnya dapat dihasilkan oleh bakteri yang mampu hidup dilingkungan yang memiliki temperatur tinggi danmengandung banyak sulfur seperti sumber air panas bahkan kawah gunung berapi non aktif (Madigan et al., 2010). Kawah ljen merupakan salah satu kawah gunung berapi yang ditambang sulfurnya untuk keperluan _ komersial. Mikroorganisme yang mampu tumbuh didaerah bersuhu dan kadar sulfur tinggi diharapkan memiliki struktur protein (enzim) yang stabil pada suhu sangat tinggi Karena banyaknya asam amino dengan atom sulfur yang disebut sistein pada protein tersebut mampu membentuk ikatan disulfida. Campbell et al. (2010) dan i ikatan disulfida dalam jumlah besar akan meningkatkan kemampuan enzim tersebut mempertahankan Ngili (2009) menyatakan bahwa enzim yang memilil konformasi dan aktivitas katalitiknyanya pada suhu lingkungan yang sangat tinggi. Penapisan bakteri termofil asal Kawah Ijen yang mampu mendegradasi asparaginin dapat dilakukan untuk memproduksi enzim L-asparaginase yang mampu mendegradasi asparaginin yang terkandung dalam makanan hingga dapat menekan resiko kanker dan keracunan yang ditimbulkan akibat pembentukan dan akumulasi akrilamid pada makanan tradisional berupa gorengan seperti tempe mendoan, bakwan, kentang goreng dan combro. 1.2. Perumusan masalah Permasalahan yang akan dijawab dalam penelitian ini adalah dapatkah enzim L-asparaginase termofilik yang dihasilkan oleh bakteri asal Kawah [jen mendegradasi kandungan L-asparagin dalam tepung bahan makanan tradisional? 1.3. Tujuan dan Manfaat Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menapis bakteri penghasil L~ asparaginase termofilik asal Kawah Ijen dan untuk menghasilkan enzim L- asparaginase komersial dengan hak paten yang bermanfaat meningkatkan mutu Kesehatan masyarakat dengan mencegah pembentukan senyawa karsinogenik dan neurotoksik akrilamid pada proses pembuatan makanan bersuhu tinggi 14 Luaran Luaran dari penelitian ini adalah hak paten atas enzim L-asparaginase termofilik asal bakteri Kawah Ijen dengan merek dagang Ramadhase™ yang dapat digunakan untuk meningkatkan kesehatan masyarakat.BABI INJAUAN PUSTAKA 2.1. Akrilamida Akrilamida (CAS No.79-06-1) telah digolongkan oleh International Agency for Research on Cancer (IARC) ke dalam kelompok senyawa karsinogenik tipe 2A, yaitu berpeluang karsinogenik terhadap manusia (IARC 1994). Sampai saat ini belum ditemukan secara jelas mekanisme pembentukan akrilamida, Jalur pembentukan akrilamida melalui produk-antara reaksi Maillard merupakan kemungkinan jalur yang paling banyak diterima (Yaylayan ef al. 2003). Menurut Stadler er al, (2002), beberapa penelitian menunjukkan bahwa akrilamida terbentuk akibat pengolahan pada suhu tinggi terhadap asam amino fertentu. (seperti asparagin), terutama apabila dikombinasikan dengan gula pereduksi dan produk-antara reaksi Maillard. Pada tahapan intermediet reaksi Maillard, asam amino mengalami dekarboksilasi dan deaminasi untuk membentuk senyawa aldehid yang selanjutnya akan membentuk senyawa akrilamida (Zyzak et «al, 2003). Reaksi pembentukan senyawa akrilamida dapat dilihat pada Gambar 1 Senyawa akrilamida terbentuk apabila setelah diproses permukaan pangan memiliki Aw yang relatif rendah serta diproses pada temperatur di atas 100 °C (Weisshaar 2004). ° © 6 ° + d Suhu eh anh, AA Row Site hae te mans asparagin aula pereduksi akrilamita Gambar 1. Reaksi pembentukan akrilamida (Wilson ef al. 2006) Akrilamida berpotensi kanker terhadap manusia, Hasil metabolit akrilamida (glycidamide) memiliki suatu sistem jenuh elektrofil yang dapat bereaksi dengan pusat nukleofil (WHO 2002). Hasil metabolit i merupakan gugus epoksil yang sangat reaktif terhadap pusat nukleofil protein dan asam amino. Gugus protein dan asam amino menjadi target reaksi utama Karena mempunyai pusat nukleofil. Beberapa penelitian menunjukan akrilamida dapatmenyebabkan tumor dan kanker pada hewan percobaan. Maka dari itu, banyak penelitian yang mengkaji mengenai ruang lingkup senyawa akrilamida ini Kajian paparan akrilamida menyatakan bahwa makanan memiliki kontribusi yang cukup besar dalam paparan senyawa ini, Umumnya, rata-rata paparan al tubuh manusia adalah sebesar 0.3-0.8 ppb per hari (WHO 2002). Nilai NOEL (No. Observed Effect Level) aktilamida yang menunjukkan level tidak ditemukannya lamida pada efek apapun akibat senyawa ini adalah sebesar 0.2 mg/ kg bb/hari berdasarkan kajian terhadap tikus (CODEX 2011). Akrilamida merupakan senyawa yang memiliki tingkat kelarutan yang baik pada air, alkohol, aseton, dan asetonitril serta cukup larut dalam etilasetat, diklorometana, dan dietileter. Senyawa ini bersifat polar sehingga tidak larut dalam pelarut heksana dan pelarut alkana maupun alkena lainnya. Akrilamida juga bersifat volatil meskipun tingkat volatilitasnya rendah (Weisshaar 2004). Sifat fisiko- ia akrilamida dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Sifat fisikokimia akrilamida (Erikson 2005 dan NICNAS 2002) Sifat Satuan Jumlah Titik Teleh °C 84.500 Titik didih (P 25 mmHg) °C 136.000 Densitas (T 30°C) wml 1.122 Water solubility (T 30°C) wml 2.160 Vapour pressure (T 25°C) mmHg 0.007 Mekanisme terbentuknya _akri mida dalam makanan belum dapat diketahui secara pasti, namun diperkirakan mekanismenya melalui reaksi antara karbohidrat dan berbagai asam amino yang terdapat dalam makanan, Beberapa kemungkinan pembentukan akrilamida yang telah diuji melalui berbagi penelitian adalah: (a). Pembentukan akrila Maillard. (b)Melalui reaksi akrolein dengan ammonia dari asam-asam amino dari asparagin melalui mekanisme reaksi bebas. (¢). Melalui reaksi antara asam akrilat dengan ammonia dari asam-asam amino bebas. (d) Reaksi-reaksi kompleks yang melibatkan asam amino (Grivas et al., 2002).2.2 Enzim L. Asparaginase Enzim asparaginase disebut juga dengan amino hidrolase asparagin yaitu enzim hidrolase yang menghidrolisis asparagin menjadi asam aspartat dan ammonia, L-Asparagin dihasilkan di dalam sel oleh enzim asparagin sintetase atau diserap dari lingkungan, yaitu sumber makanan,). L-Asparaginase juga terbukti dapat menurunkan kandungan akrilamida di dalam makanan, L-Asparaginase dapat mencegah pembentukan akrilamida dengan mengkonversi asam amino L- Asparagin sebagai prekursorya menjadi bentuk asam amino lain yaitu asam aspartat yang umum terdapat dalam makanan (Antara, 2009). 2.3 Ekstremozime Mikroba yang hipertermofil dapat tumbuh pada suhu tinggi karena kemampuannya menghasilkan enzim stabil. Ekstremozime adalah istilah yang diciptakan untuk menggambarkan enzim yang berfungsi_ pada beberapa Jingkungan ekstrim, seperti suhu tinggi atau rendah dan pH, Organisme yang menghasilkan extremozime disebut ekstremofil (Madigan et al., 2009: 747-748). Ei m termostabil memungkinkan terjadinya proses pada suhu tinggi, yang lebih tinggi, sedangkan viskositas dan masalah kontaminasi yang lebih rendah yang jelas menguntungkan sebab memiliki reaktifitas, stabilitas, dan ha (Moszhaev, 1993 dalam Jusuf, 2009). Isolasi enzim termostabil dari organisme termofilik memiliki sejumlah keuntungan secara_ komersial__ karena kestabilitasannya, Keuntungan bioproses yang berlangsung pada suhu tinggi adalah kecepatan difusi yang lebih tinggi, menurunkan viskositas. substrat, kecepatan reaksi lebih tinggi, meningkatkan kelarutan reaktan, dan mengurangi risiko terjadinya kontaminasi dengan mikroba patogen (Milo ef al., 1999 dalam Jusuf, 2009). BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah timbangan, alumunium foil, spatula, tisu, labu Erlenmeyer, alat shaker; kapas, mikro pipet, pipet volum, tabung reaksi, petridish, batang L, penggaris, sentrifuse, tabung flakon, spektrofotometer, gelas benda, bunsen, pinset, gelas ukur dan mikroskop.Bahan yang digunakan adalah sampel yang akan digunakan, alkohol 70%, M9 broth, sodium azida, garam fisiologis 0.8%, M9 agar, M9 miring, L~ asparaginase, phenol red, M9 broth, medium L-asparaginin 0,04 M, buffer M-Tris HC, asam trikloro asetat 0,5 M, reagen Nessler, NaOH 2 M, ammonium sulfat, cat Gram (A, B, TSIA. cat Zn (A,B, dan C), malachite green, medium NB, dan 3.2 Prosedur Kerja 1 Pengambilan Sampel Sampel yang akan digunakan diambil dari sumber air panas sekitar Kawah Ijen. Selain itu, sampel juga dapat diambil dari bakteri endofit edamame yaitu yang terdapat pada bintil akar. Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis dan disertai dengan pengukuran suhu dan kondisi pH lokasi dimana sampel diambil. 3.2.2. Pengkayaan Isolat Sampel yang akan digunakan ditimbang sebanyak 5 gram atau 5 ml, kemudian ditambahkan dengan 245 ml M9 Broth steril yang sebelumnya sudah ditambahkan dengan Sodium azida, Larutan tersebut kemudian dihomogenkan dan diinkubasi pada shaker selama 24 jam. 3.2.3. Isolasi Bakteri Sebanyak 1 ml sampel hasil pengkayaan dipipet ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi larutan garam fisiologis 0.8% dan dijadikan sebagai pengenceran 107, Selanjutnya dilakukan langkah yang sama untuk masing-masing tabung hingga pengenceran 10°. Untuk pengenceran 10° sampai_ 10 masing- masing diambil sebanyak 100 1! dan diinokulasikan pada M9 agar secara spread plate. Hasil spread plate kemudian diinkubasi selama 2x24 jam dengan suhu yang, sesuai dengan tempat asal sampel diambil Setelah diinkubasi, isolat yang tumbuh dipilih sebanyak 20 isolat dengan karakter (morfologi koloni) berbeda. Morfologi koloni dari masing-masing isolat dicatat untuk identifikasi. Masing-masing isolat terpilih dimurnikan pada media M9 agar dengan metode sireak plate (quadrant), kemudian diinkubasi selama2x24 jam dengan suhu yang sesuai dengan tempat asal sampel diambil. Koloni ‘tunggal yang ada diinokulasikan pada media M9 miring, kemudian diinkubasi kembali selama 2x24 jam dengan suhu yang sesuai dengan tempat asal sampel diambil. Morfologi koloni dilakukan pengamatan lebih lanjut untyuk melengkapi data identifikasi. 3.2.4 Skrining Bakteri Penghasil L-asparaginase dan Uji Aktivitas L- asparaginase Secara Semikuantitatif Isolat terpilih (20 isolat) diremajakan pada media M9 miring, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Masing-masing isolat diinokulasikan pada media ‘modified M9 (dengan penambahan L-asparaginase dan phenol red). Kemudian diinkubasi selama 2x24 jam. Hasil positif ditandai dengan timbulnya warna merah muda (pink zone) di sekitar koloni. Sedangkan hasil negative ditandai dengan tidak ada perubahan warna di sekitar koloni. Perhitungan aktivitas en L- asparaginase secara semikuantitatif dilakukan dengan menggunakan rumus @Koloni Indeks aktivitas encim = 2°20" _ @ Pink Zone Gambar x.y Rumus pengukuran indeks akt 3.2.5. Uji kuantitatif aktivitas crude enzyme L-asparaginase (Nessler Assay) a, Preparasi (poduksi L-asparaginase dengan submerged fermentation) Isolate positif hasil skrining diremajakan kembali pada media M9 miring dan diinkubasi selama 24 jam. Hasil peremajaan, diinokulasikan pada 50 ml M9 Broth modified (M9 broth + L-asparaginin), kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada shaker 100 rpm. Setelah diinkubasi, kultur disentrifugasi (800 rpm) pada suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk ditampung dalam tabung flakon secara aseptis dan disimpan pada suhu 4°C. b. Nessler’s Assay Supernatan hasil sentrifugasi diambil sebanyak 0.5. ml_ kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 0,5 ml medium L- asparaginin 0,04 M dan 0,5 ml buffer M-Tris HCl Larutan tersebut kemudiandii sam trikloroasetat 0,5 M sebanyak 0.5 ml. pada campuran, ditambahkan reagen kubasi selama 30 menit. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan Nessler dan NaOH 2 M, kemudian didiamkan selama 20 menit lalu dilakukan spektroskopi (500 nm). Hasil spektroskopi dikomparasikan dengan kurva standart ‘ammonia dengan menggunakan ammonium sulfat. 3.2.6 Identifikasi Identifikasi_ dilakukan secara morfologi makroskopis, morfologi sel, karakterisasi fisiologis, uji biokimia. Untuk identifikasi morfologi makroskopis, data hasil pengamatan morfologi koloni didapat dari tahap pemurnian dan isolasi Identifikasi melalui pengamatan morfologi sel dilakukan dengan cara pengecatan Gram, uji KOH, pengecatan endospora, pengecatan Zn dan pengamatan bentuk dan rangkaian sel. Identifikasi melalui pengamatan karakterisasi_fisiologis dilakukan dengan cara melakukan uji pH, uji suhu, uji peroksidase dan uji kebutuhan oksigen dengan cara menumbuhkan isolate dalam medium NB. Identifikasi melalui pengamatan uji biokimia dilakukan dengan cara melakukan uji pertumbuhan dalam berbagai sumber karbon dan TSIA.