KULTUR JARINGAN & Biosintesis: FAR 5222 (2 SKS)
KULTUR JARINGAN & Biosintesis: FAR 5222 (2 SKS)
SI,
.
S
,
IH
S
G
N
NI
A
T
I
R
M.SI
BY :
JURUSAN BIOLOGI
FMIPA UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI
PENDAHULUAN
Potensi sel somatik = sel zigotik
Embrio Somatik
Tanaman Utuh/Lengkap
(Embriogenesis Somatik)
Teknik Kultur Jaringan utk merealisasikannya
Muir Nicotiana tabacum, Steward Daucus carota
Aplikasi :
- penelitian : morfogenesis, regenerasi, fisiologis, biokimia, genetika
- bisnis : agro-industri, nursery, produksi metabolit sekunder
(farmasi)
Perbanyakan vegetatif modern
- hemat waktu, ruang, tenaga, biaya
- hasil beribu-ribu bahkan berjuta-juta
- sifat anakan pasti sama dgn induk
- memungkinkan dilakukan perbaikan sifat (pemuliaan)
Pelaku msh terbatas kalangan ilmuwan instansi terkait & akademisi
PT
PENGERTIAN
Kultur Jaringan : metode mengisolasi bgn tanaman (protoplasma, sel,
sekelompok sel, jaringan & organ), menumbuhkannya dlm kondisi
aseptik (suci hama) pd medium budidaya mprbnyk diri &
bregenerasi tanaman lengkap kembali.
PRINSIP DASAR
1. Sel bersifat autonom mampu atur rumah tangga sendiri
maksudnya melakukan metabolisme utk hidup/bereproduksi.
Schleiden & Schwan (1938)
2. Totipotensi kemampuan sel tumbuhan (baik sel somatik maupun
sel gametik) untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap
kembali, jika kondisinya sesuai.
Dibuktikan o/ White (1930) stlh ditemukan auksin (IAA)
3. Regenerasi organ & akar in vitro dikontrol scr hormonal O/ ZPT
Miller & Skoog (1957) nisbah sitokinin-auksin > 1 : pmbntkn pucuk
a : tanaman induk
b : eksplan
c : planlet
c
Syarat Ruangan :
Tertutup rapat (tanpa ventilasi)
negara kita tropis banyak debu & sulit dihindari.
Dipasang pengatur temperatur udara (AC)
(25 28C).
Dipasang Exhauter utk menyedot debu dlm
ruangan.
Lantai & dinding dr porselen spy mdh dibersihkan.
Bebas hewan kecil & insekta.
Pekerja hrs bersih (alas kaki dilepas, pakai jas
lab, pakaian bersih, badan bersih).
MENDESAIN LABORATORIUM
Teknik KJT
RUANG PERSIAPAN
Persiapan eksplan :
Pencucian
Pemotongan/pembuangan bgn2 tnmn
yg tdk dipakai.
Perlakuan awal sterilisasi
Persiapan medium :
Penimbangan bhn kimia medium
Pembuatan larutan stok
Pengenceran & peracikan medium
Penuangan dlm wadah kultur
Sterilisasi
Persiapan alat :
Persiapan & sterilisai alat2 diseksi
(autoklaf/oven) & LAFC/entkas (UV
light atau alkohol 70%).
RUANG INOKULASI
Ruang ini mutlak hrs steril
Kegiatan meliputi :
Sterilisasi
Isolasi bagian2 tnmn
Penanaman eksplan dlm medium
Kegiatan subkultur
Sterilisasi medium dg
ultrafiltrasi
Ruangan dilengkapi :
Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Tempat cuci tangan
Pengatur suhu (AC)
Lampu ultraviolet & TL
Ruang ini hrs terisolir tp msh bs
brhub dg ruang stok, inkubasi,
mikroskop.
Pintu penghubung usahax selalu
tertutup.
RUANG MIKROSKOP
Utk pengamatan
(morfologi/anatomi) & analisa
selama kultur berjalan.
Diperlukan :
Mikroskop binokuler
(stereoscope)
Mikroskop fase kontras
(inverted)
Fluorescent microscope yg
dilengkapi fotografi.
Micro-manipulator (utk microinjection DNA or organel ke dlm
sel/protoplas)
Ruangan: kering, bersih, meja dr
beton utk meletakan mikroskop.
RUANG AKLIMATISASI
Aklimatisasi :
Tahapan dmn planlet/tunas mikro
dipindahx ke lingkungan luar botol
(rumah kaca, rumah plastik,
screenhouse).
Tujuan rumah kaca : utk meletakx
pot-pot bibit tanaman baik yg akan
dijadix eksplan atau bibit hasil
perbanyakan kultur jaringan yg siap
dijual or dipelihara sendiri.
Lokasi : di luar laboratorium tapi tdk
jauh dr laboratorium.
Ruang tamu
Ruanga administrasi
Runag staf
Kamar mandi & WC
Ruang ganti pakaian
Ruang penyimpanan bahan
kimia dan alat-alat dr gelas
Ruang preparasi
Ruang penimbangan &
sterilisasi
Rumah kaca (green house)
R4
Ruang Inkubator/kultur
R6
Ruang Steril/transfer
R7
Ruang Administrasi
R5
Ruang Mikroskop
R1
Ruang Persiapan
R2
R3
Ruang Timbang
Ruang Stok
R8
Ruang Cuci
A. GARAM-GARAM ANORGANIK
1. Unsur Makronutrien (C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg)
Nitrogen (N)
Penyusun asam nukleat, protein, klorofil, alkaloid, derivat purin,
pirimidin, hormon endogen, koenzim.
Lebih berperan pd pertumbuhan vegetatif.
Diserap dlm bentuk ion ammonium (NH4+) dan Nitrat (NO3-)
Konsentrasi ion NH4+ berkisar 2 8 mM, ion NO3- ( 25 40 mM).
Persenyawaan : KNO3, NH4NO3, Ca(NO3)2.4H2O, NH4Cl dll
Fosfor (P)
Dlm bntk persenyawaan : K2HPO4, NaH2PO4, NH4H2PO4
Diserap dlm bentuk ion PO4- dg konsentrasi berkisar 0,5 20 mM/l
Fungsi sbg pmbntk senyawa RNA, DNA, aktivator enzim.
Berperan terutama saat pertumbuhan benih, pembungaan,
pemasakan buah & biji.
Kelebihan unsur P dpt menghambat akibat kompetisi penyerapan dg
unsur lain spt Zn, Fe dan Cu.
Kalium (K)
Diberikan dlm bntk KNO3, KH2PO4, K2HPO4, KCl, K2SO4.
Diserap dlm bntk ion K+ berkisar 1,8 25 mM/l.
Utk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat, protein,
pembuatan klorofil, mereduksi nitrat, melancarkan metabolisme.
Peranan utama sbg pengatur hidratasi sel, shg mempengaruhi
keluar masuknya nutrient ke dlm sel.
Sulfur (S)
Calsium (Ca)
Diberikan dlm bentuk : Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O, Ca(PO4)2
Pemberian ion Ca+ berkisar antara 1 3 mM/l
Fungsi : pembentukan dinding sel (Ca pektat), sbg kation selular,
kofaktor enzim, pengaruhi hidratasi, permeabilitas & penyerapan
nutrisi, mempengaruhi tingginya pH, menetralisir racun dlm bntk Ca
oksalat.
Fungsi umum : merangsang pembentukan bulu-bulu akar,
mengeraskan batang & merangsang pembentukan biji krn Ca
bersama2 Mg memproduksi cadangan makanan.
Magnesium (Mg)
Diberikan dlm bentuk MgSO4.7H2O
Fungsi : elemen utama pmbntkn klorofil, aktivator enzim,
meningkatkan kandungan fosfat.
Besi (Fe)
Diperlukan sedikit lebih banyak drpd unsur mikro lainnya.
Diberikan dlm bentuk kelat dengan senyawa NaEDTA.
Tujuan agar tetap pd jaungkauan pH yg luas dlm jangka waktu yg
lama sehingga dpt diserap oleh jaringan.
Fungsi : sintesis klorofil, konversi energi pd fotosintesis & respirasi
(bagian dr molekul sitokrom).
Diberikan dlm bentuk : FeCl.6H2O, NaFeEDTA.2H2O, Fe(SO4)3
Boron (B)
Diberikan dlm bentuk asam borak (H3BO3).
Fungsi : translokasi karbohidrat, diferensiasi seluler & perkembangan,
sbg aktivator & inaktivator zat pengatur tumbuh.
Kekurangan zat ini dpt meningkatkan ZPT yg akhirx menghambat
pertumbuhan.
Molybdenum (Mo)
Diberikan sbg sodium molibdat (Na2MoO4.2H2O).
Berperan dlm konversi nitrogen ke ammonia & fiksasi nitrogen, ikut
dlm metabolisme protein, sintesis asam askorbat, kofaktor enzim.
Mangan (Mn)
Dlm bentuk MnSO4
Fungsi : sbg komponen esensial pd membran kloroplas, aktifator
enzim sbg perantara proses fosforilasi atau sbg gugus redoks Mn 2+,
bahan pembentuk klorofil, metabolisme protein, pmbentukn vitamin C.
Cobalt (Co)
Dlm bentuk Cobalt Chloride (CoCl2)
Fungsi : elemen vitamin B kompleks, penting dlm fiksasi nitrogen.
Zincum (Zn)
Dlm bentuk Zinc sulfat (ZnSO4).
Fungsi : aktivator enzim, penyusun klorofil, pemacu pembentukan
ZPT terutama IAA.
Curprum (Cu)
Dlm bentuk Cupric sulfat (CuSO4.5H2O).
Fungsi : bagian dr enzim, komponen fenolase, laktase, askorbat
oksidase, ikut berperan dlm fotosintesis & reduksi nitrit.
Chlorin (Cl)
Dlm bentuk Calcium Chlorida (CaCl2)
Berperan dlm aktifitas enzim & memacu fotosintesis.
B. ZAT-ZAT ORGANIK
Senyawa yg mengandung unsur karbon.
Biasanya disintesis sendiri oleh tanaman.
Tapi krn eksplan berukuran sangat kecil tdk mampu mensintesis
sendiri shngga hrs ditambahkan pd medium kultur.
Gula
Kultur in vitro blm sempurna dlm berfotosintesis shg perlu tambahan
gua dlm medium kultur.
Fungsi : sumber energi, bahan pembangun struktur tubuh, penjaga
keseimbangan potensial osmotik dlm medium.
Diberikan dlm bentuk sukrosa (gula pasir), gluktosa, maltosa,
fruktosa tp harga sangat mahal dg hasil tdk selalu lbh baik dr
sukrosa.
Konsentrasi yg diperlukan sekitar 1 5% (10 50 g/l).
Sukrosa lebih berpengaruh dlm perkembangan kalus.
Maltosa lebih baik utk kultur mikrospora krn dpt memicu
embriogenesis.
Myo-Inositol
Gula alkohol (heksitol).
Terbukti mampu merangsang pertumbuhan jaringan yg dikulturkan.
Berperan pula dlm bbrp reaksi metabolik yg berhubungan dg pembelahan
sel, sbg perantara pd perubahan glukosa menjadi asam galaktironat yg
mrpkn prazat utk pektin & penyusun dinding sel.
Digunakan pd kisaran konsentrasi 100 5000 mg/l.
Vitamin
Fungsi : mempercepat pertumbuhan & diferensiasi kalus, sbg kofaktor atau
bagian kofaktor dr reaksi2 enzimatis penting, sbg senyawa protektif
(antioksidan).
Thiamin : mempercepat pembelahan sel, konsentrasi 0,1 30 mg/l
Nicotinic acid : prekursor bbrp alkaloid.
Asam askorbat (antioksidan): mencegah pencoklatan pd permukaan irisan
jaringan akibat oksidasi polifenol menjadi kuinon yg berwarna coklat.
Vitamin E (tocopherol) : merangsang pembentukan kalus friabel dlm kultur
embrio jagung, merangsang dispersi sel pd kultur suspensi sel kedelai.
Asam-asam Amino
Sumber N organik yg lebih cepat diambil sel drpd N-anorganik dlm
medium yg sama.
Jenisnya : glutamin, glisin, L-sistein, L-arginin, L-metionin dll.
Auksin
Sitokinin
Sitokinin akan aktif apabila ada auksin.
Peranan : memacu pembelahan sel & morfogenesis, memicu
pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal),
perkembangan daun, menghambat penuaan daun, mempengaruhi
perkembangan kloroplas.
Prekursor : adenin
Lokasi sintesis : ujung akar & biji yg sedang tumbuh.
Pengangkutan : kebalikan auksin (akropetal) melalui xilem.
Jenis sitokinin : alami spt kinetin dan zeatin.
sintetik spt BAP (6-benzylaminopurin), Thidiazuron.
Manipulasi rasio auksin : sitokinin dpt mempengaruhi
organogenesis
auksin/sitokinin tinggi pembentukan akar
auksin/sitokinin seimbang pembentukan kalus
auksin/sitokinin rendah pembentukan tunas
Gibberellin (GA)
D. BAHAN PEMADAT
E. ARANG AKTIF
Arang aktif adl arang yg sdh dipanaskan selama beberapa jam dgn
menggunakan uap atau udara panas.
Memiliki daya absorpsi yg kuat.
Dpt ditambahkan pd media inisiasi, regenerasi, atau perakaran.
Kisaran konsentrasi 0,5 6 % trgantung tujuan.
Fungsi :
1. Mengadsorpsi senyawa2 toksik dlm media (fenolik).
2. Mengadsorpsi ZPT shgga mencegah pertumbhn kalus yg tdk
diinginkn, membantu emriogenesis kultur dlm media tanpa auksin
dg cara menarik auksin endogen, merangsang perakaran dgn
cara mengurangi tingkat cahaya.
Tambahan Penting :
pH yg dibutuhkan dlm media kultur sekitar 4,5 5,8, diatur dg pH
meter atau kertas indikator dgn penambahan NaOH 1M dan HCl
1M, dilakukan sblm sterilisasi media
TEKNIK ASEPTIK
SYARAT KJT : aseptik bebas bakteri, jamur, yeast & jasad renik
Kontaminasi faktor pembatas penentu keberhasilan
- selama prosedur
- selama kultur dipelihara
Sumber Kontaminasi :
1. Eksplan, baik eksternal maupun internal
2. Organisme kecil yg msk ke dlm media (semut)
3. Botol kultur, media or alat-alat tanam yg kurang steril
4. Lingkungan kerja & ruang kultur yg kotor (spora di udara)
5. Kecerobohan dlm pelaksanaan
Kontaminasi o/ mikroorganisme masalah serius
- Nutrisi dlm Media cpt habis oleh mikroba
- Jaringan tnmn mati krn kekurangan hara & keracunan senyawa toksik
hasil metabolisme mikroba
Kontaminasi bs terjadi pd setiap tahap pelaksanaan KJT
A.
Cara sterilisasi lampu UV min 30 menit dan semprot or lap dgn alkohol
70%, utk entkas bisa pakai tablet formalin yg diuapkan.
Eksplan in vitro
C. STERILISASI EKSPLAN
Tujuan : induksi kalus, diferensiasi akar serta tunas lalu jadi planlet.
Beberapa eksplan justru hrs lembek spt mikrospora, helaian daun tipis.
2. Metode Cair
Disbt jg kultur suspensi sel, kultur dr sel-sel bebas di dlm medium cair
Tujuan :
1. memecah kalus jd single cell
2. memperbanyak kalus dg sub kultur berulang
3. menumbuhkan protokormus atau plb (protocorm like body)
Pembuatan media lebih mudah krn tanpa agar shg tdk perlu
dimasak.
ZPT yg digunakan biasanya 2,4-D sebanyak 2 ppm.
Dipelihara di atas shaker dgn kecepatan 120 rpm.
Sub kultur dilakukan dlm wkt 1 2 minggu, jika terlambat terjadi
embryogenesis atau pencoklatan dan berhenti tumbuh.
Sub kultur ada 2 cara : memecah biomasa mnjadi 2 bagian yg
msng2 ditambah media baru dg volume sama, atau biomasa tetap
tp dlm wadah yg lebih besar dgn jumlah media ditambah 2 kali lipat.
Utk skala besar biasa digunakan fermentor.
Kalus yg difermentasi utk berbagai keperluan : produksi metabolit
sekunder, sumber protoplas, sumber kultur sel.
B. MENABUR/MENANAM EKSPLAN
Dilakukan di dlm LAFC dgn kondisi aseptik.
Caranya:
- Lepaskan gelang, cincin, jam tangan.
- Gunakan masker penutup hidung & kepala jika perlu;
- Basahi tangan sampai lengan dgn alkohol 70%.
- Matikan lampu UV, nyalakan blower & lampu neon, semprot meja
laminar dg alkohol, semprot dg alkohol semua alat & media yg akan
masuk laminar.
- Buka penutup botol kultur, letakkan eksplan yg sdh dipotong dgn
pola & ukuran yg tepat pada media tumbuh. Usahakan permukaan
yg teriris menyentuh media. Kerjakan dekat dg api.
- Ingat!!! Pinset, scalpel sblm memegang eksplan hrs dibakar dulu
lalu di celup ke akuades steril.
- Tutup kembali botol kultur dg alumunium foil.
- Simpan di ruang kultur.
- Bereskan semua alat2, lap kembali dgn alkohol permukaan laminar,
matikan blower & neon, tutup laminar, nyalakan lampu UV.
C. MELAKSANAKAN SUB-KULTUR
Sub kultur upaya mengganti media tanam dengan media baru shg
nutrisi utk kebutuhan eksplan (kalus or plb) tetap terpenuhi.
1. Sub Kultur pd media cair
- Nutrisi pd media cair cpt habis oleh plb or kalus.
- sub kultur setiap 4 hari sekali, secara aseptik.
- pengambilan media dgn pipet.
- pengambilan plb or kalus dgn pinset.
- dari satu erlenmeyer biasa menjadi 7 erlen meyer.
2. Sub kultur pd media padat
- dengan meletakkan eksplan (kalus or koloni tunas) dlm petridish
lalu dipotong-potong or dipisah-pisah setelah itu ditanam lagi pd
media baru.
D. Menumbuhkan Planlet
Komposisi media dasar biasanya separuh dr media induksi kalus.
ZPT 2,4-D atau NAA dihilangkan sbb akan mbentuk kalus terus.
ZPT yg dianjurkan sitokinin (kinetin) dan auksin (IAA) dengan
perbandingan tertentu.
Utk induksi pucuk maka sitokinin diperbanyak komposisinya,
sebaliknya utk akar diperbanyak auksinnya.