Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA

60 l EDTA 50 mM
40 l larutan sukrosa 25%
21 l EDTA 0,5 M pH 8
1,5 l lisozim 10 mg/mL
18 l NaCl 5 M,
22,5 l SDS 20%,
1,5 l proteinase-K 5 mg/mL
Etanol dingin
30 l buffer TE
Bahan-bahan yang digunakan untuk PCR
Ekstrak DNA,
PCR mix (100 mm Tris-hcl, ph 8,3, 1,5 mm MgCl , 50 mm KCl, 0,1% gelatin),
Deoksinukleotida trifosfat (dntp) yaitu datp, dgtp, dttp, dctp,
Enzim Taq DNA polymerase,
Dua jenis primer (primer forward dan revers)
Bahan-bahan untuk elektroforesis
Gel agarosa 1,5% yang mengandung 0,5 mg/L
Ethidium bromide,
Buffer elektroforesis tris acetic acid-edta (242 g tris base, 57 ml acetic acid, dan 100
ml dari 0,5 mol/l edta, ph 8,0) (Morin et al. 2004)
Alat-alat yang digunakan adalah sebagai berikut:
Alat-alat gelas ( beaker glass, gelas ukur, pipet tetes)
Mikropipet dan pasangan tip-nya
Tube
Botol sampel,
Kotak es (cool box),
Inkubator,
Safety cabinet,
Vortex shaker,
Shaker incubator,
Tabung eppendorf dan raknya,
Sentrifugasi,
Sarung tangan dispossibel,
Mikropipet,
Thermocycler machine,
Freezer -20 c,
Lemari pendingin 4c,
Mesin elektroforesis,
UV transilluminator

Proses Kerja Isolasi DNA

Sampel sebanyak 1,5 mL disentrifugasi dengan kece

Selanjutnya disuspensikan kembali pelet yang didapat dengan 60 l EDTA 50 mM, dan k

40 l larutan sukrosa 25% dan 10,5 l EDTA 0,5 M pH 8 ditambahkan pada pelet yang diperoleh, l

Ditambahkan 18 l NaCl 5 M, 10,5 l EDTA 0,5 M, 22,5 l S

Sediaan kemudian diinkubasi pada suhu 50C selama 1 jam dan dita

Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan

Supernatan dipindahkan (larutan yang terlihat bening)

Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5

Melakukan amplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (Thermocycler machine) sebanyak 40 sik

Keterangan:
(*) = Setiap tabung PCR mengandung 16,9 L air steril, 2 L 10 mM deoxynucleotide
triphosphate mixture (dNTP mix), 1 L 50 mM MgCl, 2,5 L 10X amplifikasi buffer, 0,5 L
10 M forward primer dan 0,5 L 10 M reverse primer, 0,1 L (0,25 U/L) Taq DNA
polymerase dan air steril ditambahkan sampai volume akhir 22,5 L.

Setelah tercampur dengan baik, m

Memasukkan juga marker ke dalam sumur gel agarosa untuk

mengetahui ukuran DNA produk PCR,

Mengelektroforesis selama

Setelah 1 jam, elektroforesis dihentikan dan gel diangkat untuk diamati di bawah sinar Ultra Viole
Data Pengamatan
Tabel 1. Data Pengamatan hasil PCR E.coli pada sampel susu murni
No.
Kode sampel
Hasil PCR Keterangan (terdeteksi/tidak terdeteksi)
(+/-)
1.

2.

3.

Gambar 1. Hasil PCR Deteksi E.coli pada sampel susu

Referensi:
Febby Ester Fany Kandou. 2009. Analisis molekuler escherichia coli serotype o157:h7 pada
air minum dalam kemasan dan isi ulang menggunakan teknik Polymerase Chain
Reaction (PCR) DENGAN rfbE SEBAGAI GEN TARGET. Chem. Prog, 2:1, 8-14
Morin, N.J., Gong, Z. and Xing-Fang, L. 2004. Reverse Transcription-Multiplex PCR Assay
for Simultaneous Detection of Escherichia coli O157:H7, Vibrio cholerae O1, and
Salmonella Typhi. Clinical Chemistry, 50:11, 2037-2044.