Anda di halaman 1dari 2

Hal ini sering diperlukan untuk memurnikan DNA plasmid dari E.coli.

Sebagai
contoh, setelah
melakukan ligasi dan transformasi percobaan, Anda akan perlu memeriksa
plasmid untuk memastikan bahwa itu berisi fragmen DNA yang Anda tertarik
di. manipulasi lebih lanjut dari DNA plasmid sering mengikuti sukses
kloning percobaan, dan ini juga akan membutuhkan pemurnian plasmid.
Untungnya, pemurnian DNA plasmid dari bakteri adalah pro rutin
cedure. Ini melibatkan tumbuh budaya sel dari koloni tunggal yang mengandung
plasmid, panen sel-sel ini dan kemudian melanggar mereka terbuka (disebut
sebagai "lisis sel"), menghapus komponen asam non-nukleat, dan kemudian
pemilihan tersebut
-masing memulihkan asam nukleat oleh presipitasi dengan etanol. Untuk beberapa
tujuan, perlu juga untuk memisahkan DNA plasmid dari lainnya
asam nukleat (RNA dan DNA kromosom). Secara tradisional, langkah kedua ini
dicapai dengan sentrifugasi pada gradient cesium klorida dalam tekanan
ence dari ethidium bromide, teknik kadang-kadang masih digunakan untuk
penjernihan yang
kasi DNA kromosom. Teknik yang Anda pilih bergantung pada
sejumlah faktor seperti seberapa murni DNA perlu, berapa banyak
Anda butuhkan, dan berapa banyak sampel yang berbeda Anda perlu untuk
mengisolasi plasmid
dari. Salah satu teknik yang paling mudah dan dapat diandalkan untuk purification DNA plasmid disebut lisis alkali. Teknik ini dapat digunakan sebagai
metode cepat untuk mengisolasi DNA plasmid untuk tujuan analisis atau dapat
disempurnakan untuk menghasilkan sejumlah besar DNA berkualitas tinggi untuk
kloning. Ini Prosedur sering digambarkan sebagai " Miniprep " ( Gambar 3.7 ) , dan
hasil sekitar 1 g DNA , yang cukup untuk berbagai tujuan analisis seperti
pembatasan-pemetaan tion ( Bagian 3.10 ) .
The " Miniprep " metode pemurnian DNA plasmid dapat dimodifikasi

untuk menghasilkan jumlah besar dari DNA berkualitas tinggi . Sebuah volume yang
lebih besar dari
budaya semalam digunakan dan seluruh prosedur ditingkatkan sesuai.
Selain itu , upaya yang lebih besar dilakukan untuk memastikan bahwa tidak ada
contamiNATing asam nukleat dalam persiapan . The lisat mentah biasanya lebih
dimurnikan dengan melewatkannya melalui kolom pertukaran ion . The mengikat
kolom
asam nukleat , sehingga mencemari protein dan karbohidrat dihapus . Saya t
kemudian dicuci dengan buffer untuk menghilangkan RNA apapun dan kemudian
dielusi : plasminogen yang
pertengahan DNA dalam eluat (lihat Gambar 3.8 ) .

Pemurnian DNA plasmid pada kolom pertukaran ion .


Lisat dibersihkan diturunkan kolom pertukaran ion . mencemari
protein dan karbohidrat tidak mengikat kolom . Kolom kemudian dicuci
dengan larutan yang mengandung garam 1M , yang menghilangkan RNA . The double stranded
plasmid DNA kemudian dielusi dari kolom dengan buffer yang mengandung 1,25 M
garam .