1.

Pengertian Spektrofotometri
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia

analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik

secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara
materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri
disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya
visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan
molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.
Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombang spesifik dengan mengguankan monokromator prisma atau
kisi difraksi dengan detector Fototube. Dalam analisis cara spektrofotometri
terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu
daerah UV (200-380 nm), daerah Visible (380-700 nm), daerah Inframerah (7003000 nm).

1.2 Spektofotmetri UV
a. Karakteristik dan Fungsi
Prinsip kerjanya berdasarkan penyerapan cahaya atau energi
radiasi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau energi radiasi yang
diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap dalam
larutan secara kuantitatif (Triyati,1985).
Spektofotometri UV di = 280nm dapat digunakan untuk analisis
triptofan, sementara tirosin dapat ditentukan di 278nm. Fenillalanin
menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang yang lebih
pendek (Rohman, 2013).
b. Metode
Susunan peralatan Spektrofotometer Ultra-violet meliputi bagianbagian sebagai berikut:
Sumber radiasi/cahaya (A)
Sumber cahaya dipergunakan

untuk

pengukuran

absorpsi.

Sumber cahaya ini harus memancarkan sinar dengan kekuatan yang

cukup untuk penentuan dan pengukuran, juga harus memancarkan
cahaya berkesinambungan yang berarti harus mengandung semua
panjang gelombang dari daerah yang dipakai. Kekuatan sinar radiasi
harus konstan selama waktu yang diperlukan. Sumber radiasi Ultraviolet biasa dipergunakan lampu Hidrogen atau Deuterium yang

terdiri

dari

tabung

kaca

dengan

jendela

dari

kwartz

yang

mengandung Hidrogen dengan tekanan tinggi. Oleh karena kaca

menyerap radiasi Ultra-violet, maka sistim optik Spektrofotometer

Ultra-Violet dan sel harus dibuat dari bahan kwartz.

Monokromator (B)
Monokromator dipergunakan untuk memisahkan radiasi ke
dalam

komponen-komponen

panjang

gelombang

dan

dapat

memisahkan bagian spektrum yang diinginkan dari lainnya.

Sel absorpsi (C)
Kualitas data absorbans sangat tergantung pada cara pemakaian
dan pemeliharaan sel. Sidik jari, lemak atau pengendapan zat
pengotor pada dinding sel akan mengurangi transmisi. Jadi sel-sel

itu harus bersih sekali sebelum dipakai.

Detektor (D)
Detektor dipergunakan untuk menghasilkan signal elektrik.
Dimana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap.

Signal elektrik ini kemudian dialirkan ke alat pengukur.

Pencatat (E)
Rekorder dipergunakan untuk mencatat data hasil pengukuran
dari detektor, yang dinyatakan dengan angka.
Gambar 1. Bagan susunan alat Spektrofotometer Ultra-

violet
Keterangan :
A = sumber cahaya.
B = monokromator.
C = sel absorpsi (tempat
larutan).

C1
C2
D
E

= contoh.
= pelarut.
= detektor.
= meter atau rekorder.

Alat susunan spektrofometer Ultra-violetdipancarkan melalui

monokromator (B). Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari
sumber cahaya tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang
diinginkan untuk pengukuran suatu zat tertentu seperti yang tertera
pada tabel 1, yang menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor
mempunyai panjang gelombang maksimum yang berbeda.
Dari monokromator tadi cahaya/energi radiasi diteruskan dan
diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet.
Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan
signal elektrik pada detektor, yang mana signal elektrik ini sebanding
dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal
elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka.
Metode Spektrofotometri Ultra-violet berdasarkan pada hukum
LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah radiasi
Ultra-violet yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan
merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan.

Tabel 1.
Pita

absorpsi

elektronik

untuk

gugus kromofor tunggal (SKOOG & WEST, 1971)

Hal-hal yang harus diperhatikan dalaultrav analisis spektrofotometri
ultraviolet :
Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif
adalah panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum.
Untuk memperoleh panjang gelombang maksimum, dilakukan
dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan

panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi

tertentu.
Pembatan kurva kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan
berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan
berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang
merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi.
Bila hokum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi berupa

garis lurus.
Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya
antara 0,2 sampai 0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa
pada kisaran nilai abssorbansi tersebut kesalahan fotometrik
yang terjadi adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman, 2007).

Berikut merupakan salah satu analisa asam amino :

Asam amino disiapkan dalam Guanidin 6M + HCl 0,2M dan
konsentrasinya diatur 0,05mg/ml untuk tirosin dan triptofan serta
0,2mg/ml untuk fenilalanin. Koreksi baseline selalu digunakan,
dengan lebar celah 2nm. Spektra dibaca pada panjang gelombang
antara 260-300nm, terhadap blanko guanidine 6M + HCl 0,2M.
Spektra order nol (norma) ditransformasi ke turunan kedua dengan
penghalusan titik ( smoothing) sesuai prosedur Savitzky-Golay.
Ekstra daging disiapkan dengan homogenisasi 0,1g daging dalam
10ml Guanidin 6M dengan politron selama 30 detik. Lipid dan
kolagen yang tidak larut dihilangkan dengan penyaringan pada
kertas saring, lalu ekstrak daging ditambah dengan HCl 0,2M untuk
membuat kondisi yang sama, dengan standar asam amino, lalu
dibaca dengan spektrofotometer UV.

Gambar 2. Spektra derivaft kedua 3 AA aromatis dalam GuanidinHCl. Puncak yang digunakan untuk analisis ditandai dengan puncak
tebal. Konsentrasi adalah 0,05mg/ml untuk Trp dan Tyr, serta 0,2
mg/ml untuk Phe.
Gambar ini menunjukkan spectrum turunan kedua tiap AA
aromatis. Trp menunjukkan 2 puncak, yang mayor ada di 288,5nm ,
sementara yang minor ada di 281nm. Tyr menunjukkan puncak
mayor di 282,5 nm dan puncak minor di 275 nm, sementara itu Phe
menunjukkan puncak mayor dan minor masing-masing 263,5 nm
dan 268 nm. Panjang gelombang ini dapat dimanfaatkan

untuk

pengukuran kedua AA aromatis pada sampel daging.

c. Kelebihan dan Kekurangan
Menurut Afriyana (2009), pemakaian Spektrofotometer Ultra-violet
dalam analisis kuantitatif mempunyai beberapa keuntungan:
Dapat dipergunakan untuk banyak zat organik dan anorganik.
Adakalanya bebe
rapa zat harus diubah dulu menjadi senyawa berwarna sebelum

dianalisa.
Selektif. Pada pemilihan kondisi yang tepat dapat dicari panjang

gelombang untuk zat yang dicari.

Mempunyai ketelitian yang tinggi, dengan kesalahan relatif

sebesar 1% 3%, tetapi kesalahan ini dapat diperkecil lagi.

Dapat dilakukan dengan cepat dan tepat.

Kelemahan Spektrofotometer Ultra-violet dan Sinar Tampak dalam

analisis kualitatif adalah kurang teliti. Hal tersebut disebabkan karena
pita-pita absorpsi yang diperoleh melebar, dengan demikian kurang
khusus atau terbatas pemakaiannya. Walaupun demikian, berdasarkan

spektrum serapan Ultra-violet dan Sinar Tampak, dapat dipakai untuk

mengetahui ada atau tidak adanya gugus fungsional tertentu dalam
senyawa organik. Alat ini dapat juga dipergunakan untuk menentukan
jumlah kecil senyawa berkadar rendah yang dapat mengabsorpsi
dalam media non absorben.

Daftar Pustaka
Afriyana,

Rina.

2009.

Penerapan

Metode

Spektrofotometer

Ultraviolet pada Penetapan Kadar NIfedipin dalam Sediaan

Tablet. Skripsi. Universitas Sumatra Utara.
Gandjar, I.G. dan Rohman, A.2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan
II. Yogyakarta : Perpustakaan Pelajar. Halaman 246.
Rohman, Abdul. 2013. Analisis Komponen Makanan.

Graha

Ilmu:Yogyakarta.
Skoog, D.A. dan D.M. West. 1971. Principles Of Instrumental
Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc., New York.
Triyati, Etty. 1985. Spektrofotometer Ultra-Violet Dan Sinar Tampak
Serta Aplikasinya Dalam Oseanologi. Oseana, Volume X, Nomor 1
: 39 - 47, 1985. ISSN 0216-1877.