Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang dengan

Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan

Skripsi
Disusun untuk melengkapi syarat-syarat guna memperoleh gelar
Sarjana Sains

Oleh
Erriska Rahma Putri
3325102418
Program Studi Kimia
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
2014

ABSTRAK

Erriska Rahma Putri. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang

dengan Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan. Skripsi. Jakarta:
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Jakarta. 2014.
1

Telah dilakukan ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang. Penelitian

ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh waktu dan rasio perbandingan
antara tepung kulit udang dengan pelarut, terhadap besar ekstrak
Astasantin yang dihasilkan. Tujuan lain dari penelitian ini adalah untuk
menguji aktivitas antioksidan ekstrak yang didapat. Dalam penelitian ini
dilakukan karakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FTIR.
Setelah
proses
karakterisasi
ekstrak
diukur
konsentrasinya
menggunakann KCKT dan diuji aktivitas antioksidannya dengan metode
DPPH. Waktu optimum untuk ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang
dengan metode maserasi yaitu selam 5 hari. Rasio perbandingan optimum
antara tepung kulit udang dengan pelarut pada proses maserasi yaitu,
sebanyak 1:8 (5 gram tepung kulit udang dalam 40 mL pelarut aseton).
Pengukuran panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer UVVis menghasilkan nilai 468 nm, hal ini menjadi salah satu indikasi bahwa
senyawa ekstrak yang dihasilkan berupa senyawa Astasantin.
Karakterisasi spektrum infra merah menguatkan indikasi bahwa gugus
fungsi yang terkandung dalam ekstrak merupakan gugus fungsi senyawa
Astasantin, ini dibuktikan dengan munculnya puncak pada bilangan
gelombang 3369,64 cm-1, 2924,09 cm-1, 1712,79 cm-1, dan 1620,21 cm-1.
Hasil pengukuran konsentrasi ekstrak Astasantin menggunakan KCKT
yaitu sebesar 7,466 0,05 ppm. Uji aktivitas antioksidan ekstrak
Astasantin dengan metode DPPH memberikan nilai IC 50 sebesar 338,500
ppm.

Kata kunci : Astasantin, Tepung Kulit Udang, Pengaruh Waktu Maserasi,

Pengaruh Rasio Pelarut, Spektrofotometer UV-Vis, Fourier Transform
Infrared (FTIR), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Uji Aktivitas
Antioksidan, Metode DPPH.
KATA PENGANTAR
Puji syukur

kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan

karunia yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penulis dapat

menyelesaikan proposal yang berjudul Ekstraksi Astasantin dari Tepung
Kulit Udang dengan Metode Maserasi untuk Uji Aktivitas Antioksidan.
Proposal ini disusun sebagai salah satu prasyarat lulus dalam mata kuliah
Skripsi.

Penulis tidak dapat menyelesaikan proposal ini tanpa bantuan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada :
1. Dr. Riskiono Slamet, M.Sc. sebagai dosen pembimbing I.
2. Dr. Erdawati, M.Sc sebagai dosen pembimbing II.
3. Dr. Yusmaniar, M.Si sebagai dosen mata kuliah Skripsi.
4. Orang tua yang telah memberikan dukungan dan doa.
5. Segenap pihak yang telah berperan dalam proses penyelesaian
proposal ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak
kekurangan. Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari pembaca. Semoga proposal ini dapat memberikan manfaat bagi
pembaca pada khususnya dan perkembangan ilmu pengetahuan pada
umumnya.

Jakarta, 16 Juni 2014

Penulis
ii
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK..........................................................................................

KATA PENGANTAR...........................................................................

ii

DAFTAR ISI.......................................................................................

iii

DAFTAR TABEL................................................................................

vi

DAFTAR GAMBAR............................................................................

vii

DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................

viii

I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang .....................................................................

1.2. Identifikasi Masalah .............................................................

1.3. Pembatasan Masalah ..........................................................

1.4. Perumusan Masalah ............................................................

1.5. Tujuan Penelitian .................................................................

1.6. Manfaat Penelitian ...............................................................

II. LANDASAN TEORI

2.1. Kajian Teori...........................................................................

2.1.1. Udang.......................................................................

2.1.2. Ekstraksi ..................................................................

2.1.3. Astasantin (Pigmen Karotenoid) .............................. 15

2.1.4. Karotenoid Alami dalam Menangkal Radikal Bebas 16
2.1.5. Antioksidan............................................................... 18
2.1.6. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Udang dan
Astasantin Sebagai Antioksidan Alami.................... 22
2.1.7. Spektrofotometri UV-Vis........................................... 23
2.1.8. Spektrofotometri Infra Merah................................... 26
2.1.8. Kromatografi Cair Kinerja
iii Tinggi (KCKT)................. 27
2.2. Kerangka Berpikir................................................................. 29
2.3. Penelitian Sebelumnya......................................................... 29
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tujuan Operasional Penelitian ............................................ 32
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ............................................. 32
3.3. Alat dan Bahan ................................................................... 32

3.4. Prosedur .............................................................................. 33

3.4.1. Pembuatan Tepung Kulit Udang ............................ 33
3.4.2. Pengaruh Waktu Ekstraksi terhadap Jumlah
Ekstrak Astasantin yang didapatkan ..................... 33
3.4.3. Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan
Pelarut Aseton terhadap Jumlah Ekstrak Astasantin
yang didapatkan...................................................... 33
3.4.4. Pemurnian Astasantin dan Penentuan
Panjang Gelombang Maksimum ............................ 34
3.4.5. Karakterisasi Ekstrak Astasantin
dengan Spektrofotometer Infra Merah ................... 35
3.4.6. Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin
dengan KCKT.......................................................... 36
3.4.7. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH................... 37
IV. HASIL dan PEMBAHASAN
4.1. Preparasi Sampel ................................................................

39

4.2. Pemurnian Sampel...............................................................

40

4.3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum........................

42

4.4. Hasil Pengaruh Waktu Maserasi...........................................

42

4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kuli Udang dengan

Pelarut Aseton......................................................................

44

4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIR......................................

46

4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKT....................

48

iv
4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH.................................

49

V. KESIMPULAN dan SARAN

5.1. Kesimpulan...........................................................................

55

5.2. Saran.....................................................................................

56

DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................

57

LAMPIRAN .......................................................................................

63

DAFTAR TABEL
Tabel 1.

Tabel 2.

Tabel 3.

Tabel 4.

Tabel 5.

Tabel 6.

Tabel 7.

Halaman
Komposisi Kimia Limbah Udang dan Kulit Udang
..............................................................................................
6
Perbandingan Sifat Fisik dari Gas, Cairan, dan Fluida
Superkritis
..............................................................................................
..............................................................................................
11
Beberapa Jenis Pelarut Organik dan Sifat Fisiknya
..............................................................................................
..............................................................................................
14
Spektrum
Cahaya
Tampak
dan
Warna-Warna
Komplementer
..............................................................................................
..............................................................................................
24
Pengaruh Waktu Maserasi terhadap Jumlah Ekstrak
Astasantin
..............................................................................................
v
..............................................................................................
34
Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang : Volume Aseton
terhadap
Jumlah
Ekstrak
Astasantin
..............................................................................................
..............................................................................................
34
Interpretasi
Spektra
FTIR

Tabel 8.

Tabel 9.

Tabel 10.

Tabel 11.

Tabel 12.

Tabel 13.

Tabel 14.

..............................................................................................
36
Hasil Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH
..............................................................................................
..............................................................................................
38
Panjang Gelombang Maksimum Pelarut untuk Ekstraksi
Astasantin
..............................................................................................
42
Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Waktu
Maserasi
..............................................................................................
43
Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Rasio
Pelarut
..............................................................................................
44
Interpretasi
Spektra
FTIR
..............................................................................................
46
Nilai Inhibisi terhadap Konsentrasi pada Uji Antioksidan
..............................................................................................
49
Kisaran
Kekuatan
Potensi
Antioksidan
..............................................................................................
51

DAFTARviGAMBAR
Halama
Gambar 1. Alat Soklet .............................................................................
8

Gambar 2. Alat Craig ..............................................................................

9
Gambar 3. Model Kerja Alat Craig...........................................................
10
Gambar 4. Struktur -Karoten dan Astasantin........................................
16
Gambar 5. Diagram Blok Spektrofotometer............................................
25
Gambar 6.................................................................................................
Spektra Infra Merah Ekstrak Astasantin.................................
27
Gambar 7. Deskripsi kurva kalibrasi standar internal..............................
29
Gambar 8. Kerangka Berpikir..................................................................
30
Gambar 9. Alat Spektrofotometer Infra Merah ........................................
35
Gambar 10. Pembuatan Tepung Kulit Udang .........................................
39
Gambar 11. Ekstrak Astasantin Hasil Maserasi dengan 50 mL Aseton
terhadap Waktu Maserasi ..................................................
40
Gambar 12. Ekstrak Astasantin Hasil Maserasi terhadap Volume
Pelarut Aseton 50 mL Aseton Maserasi 5 Hari ...............
40
Gambar 13. Pemurnian Ekstrak Astasantin ............................................
41
Gambar 14. Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak
Astasantin ..........................................................................
43
Gambar 15. Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi
Ekstrak Astasantin..............................................................
45

vii

Gambar 16. Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi pada

Metode DPPH..................................................................
52
DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Bagan Pembuatan Tepung Kulit Udang...............................

63
Lampiran 1 Bagan Penentuan Waktu Optimum...........................
64
Lampiran 2 Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Rasio Pelarut
Optimum)..............................................................................
65
Lampiran 3 Bagan

Karakterisasi

Ekstrak

Astasantin

dengan

Spektrofotometer Infra Merah..............................................

66
Lampiran 4 Bagan Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan
KCKT....................................................................................
67
Lampiran 5 Bagan Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM Uji Aktivitas
Antioksidan...........................................................................
68
Lampiran 6 Bagan

Pembuatan Larutan Blanko

Uji

Aktivitas

Antioksidan...........................................................................
69
Lampiran 7 Bagan Pembuatan Larutan Uji Aktivitas Antioksidan.
70
Lampiran 8 Pembuatan Larutan Kontrol Uji Aktivitas Antioksidan
71

viii

Lampiran 9 Spektra Infra Merah Hasil Ekstrak Astasantin...........

72
Lampiran 10 Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk Standar Astasantin...................................................
73
Lampiran 11 Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
untuk Ekstrak Astasantin....................................................
74
Lampiran 12 Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan
KCKT..................................................................................
75
Lampiran 13 Hasil Uji Antioksidan pada Ekstrak Astasantin dengan
DPPH..................................................................................
76
Lampiran 14 Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Sampel Ekstrak Astasantin.........................
77
Lampiran 15 Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada Metode DPPH
untuk Larutan Kontrol Asam Askorbat................................
78
Lampiran 16 Perhitungan Nilai IC50 pada Metode DPPH...........
79
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Udang adalah komoditas handalan sektor perikanan yang umumnya
diekspor dalam bentuk beku. Indonesia merupakan salah satu negara
pengekspor udang terbesar di dunia. Pada

proses pembekuan udang

(cold storage) dihasilkan limbah sebanyak 60-70% dari berat udang,

dalam bentuk kepala dan kulit udang. Limbah sebanyak ini, jika tidak
ditangani secara tepat, akan menimbulkan dampak negatif bagi
lingkungan, karena dapat menyebarkan bau busuk dan ketidaknyamanan
bagi lingkungan sekitarnya.
Selama ini pemanfaatan limbah kulit udang hanya terbatas untuk
campuran pakan ternak serta sumber kitin dan kitosan. Salah satu alasan
pemanfaatan limbah kulit udang sebagai pakan ternak adalah kandungan
karotenoid yaitu pigmen Astasantin pada kulit udang yang dapat
meningkatkan warna kuning telur ayam dan itik serta mencerahkan warna
kulit ikan hias.
Penelitian mengenai karotenoid dari kulit udang sebagai pigmen,
masih jarang ditemukan dan umumnya penelitian terhadap kulit udang
lebih

difokuskan

untuk

menghasilkan

kitin

dan

kitosan.

Hal

ini

menyebabkan perlu dilakukan penelitian mengenai pigmen karotenoid

yang terdapat pada kulit udang.
Karotenoid pada kulit udang berada dalam bentuk kompleks karoteno
protein yang apabila diberi perlakuan panas dapat menyebabkan
renggangnya ikatan karotenoid dengan protein sehingga warna kulit
udang dapat mengalami perubahan dari gelap menjadi merah terang
(Hendry dan Houghton, 1996). Menurut Khanafari et al. (2007), jenis
pigmen karotenoid utama yang terdapat pada kulit udang ialah Astasantin.
Astasantin merupakan kelompok pigmen karotenoid jenis xantofil yang
memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan jenis pigmen
karotenoid lainnya (Astawan dan Kasih, 2008; Hendry dan Houghton,
1996).
Salah satu metode untuk mengekstrak Astasantin dari limbah kulit
udang adalah maserasi dengan pelarut organik seperti aseton, metanol,
etanol, heksana, isopropanol, etil asetat, dan petroleum eter (Sachindra et
al., 2006). Menurut Mezzomo et al. (2011), metode maserasi dengan
pelarut aseton akan menghasilkan Astasantin bebas terbanyak diantara
jenis pelarut lainnya yaitu 1312 g g1ekstrak dan menurut Storebakken et

al. (2004), Astasantin bebas memiliki aktivitas antioksidan yang besar.

Selain itu metode maserasi dipilih karena tidak membutuhkan suhu tinggi
dalam pelaksanaannya sehingga sesuai dengan sifat pigmen Astasantin
yang yang tidak tahan pada suhu tinggi. Menurut Pu (2008), Astasantin
akan mulai terdegradasi pada suhu di atas 60C, sehingga dalam
penelitian ini digunakan suhu maserasi yang tidak melebihi suhu 60C.
Beberapa kegunaan Astasantin dalam industri pangan yaitu sebagai
pewarna, antioksidan, dan prekursor pembentukan vitamin A, (Hendry dan
Houghton, 1996). Oleh karena itu penelitian ini juga bertujuan untuk
melakukan uji terhadap aktivitas antioksidan pada ekstrak Astasantin dari
tepung kulit udang.
1.2. Identifikasi Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah di atas, masalah yang dapat
muncul dalam penelitian ini diantaranya :
1. Bagaimana proses pembuatan tepung kulit udang dari limbah
udang?
2. Apa metode yang tepat untuk mengekstrak Astasantin dari tepung
kulit udang?
3. Apa pelarut yang tepat untuk menghasilkan absorbansi ekstrak
yang besar?
4. Berapa lama waktu ekstraksi yang diperlukan untuk menghasilkan
absorbansi ekstrak yang besar?
5. Berapa perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung udang
yang diperlukan untuk menghasilkan absorbansi ekstrak yang
besar?
6. Apakah ekstrak yang didapatkan berupa senyawa Astasantin?
7. Berapa besar konsentrasi ekstrak Astasantin yang terdapat pada
ekstrak tepung kulit udang?
8. Berapa besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang?

1.3. Pembatasan Masalah

Pada penelitian ini, masalah yang dikaji dibatasi untuk mengetahui
waktu ekstraksi dan perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung
udang terhadap absorbansi ekstrak Astasantin, menginterpretasikan
senyawa hasil ekstrak yang didapat dengan spektrofotometer infra merah,
mengetahui konsentrasi ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang dengan
metode

KCKT,

dan

pengujian

aktivitas

antioksidan

dilakukan

menggunakan uji penangkapan radikal 1,1-difenil-pikrilhidrazil (DPPH).

1.4. Perumusan Masalah
Berdasarkan pembatasan masalah di atas, perumusan masalah pada
penelitian ini adalah :
1. Berapa lama waktu ekstraksi yang diperlukan untuk menghasilkan
ekstrak Astasantin yang besar?
2. Berapa perbandingan rasio pelarut dengan massa tepung kulit
udang

yang

diperlukan

untuk

menghasilkan

ekstrak Astasantin yang besar?

3. Apakah ekstrak yang didapatkan berupa senyawa Astasantin?
4. Berapa besar konsentrasi ekstrak Astasantin yang terdapat pada
ekstrak tepung kulit udang yang diukur menggunakan KCKT?
5. Berapa besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang jika diuji dengan metode DPPH?
1.5. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan ekstrak Astasantin dari
tepung kulit udang dengan absorbansi ekstrak yang besar dan
mengetahui besar aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang dengan menggunakan metode DPPH.
1.6. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan nilai guna limbah kulit
udang, memberi informasi mengenai absorbansi, konsentrasi, dan

aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang.

BAB II
Landasan Teori
2.1. Kajian Teori
2.1.1. Udang
Udang adalah hewan yang hidup di perairan, khususnya sungai
maupun laut atau danau. Udang dapat ditemukan di hampir semua
genangan air yang berukuran besar, baik air tawar, air payau, maupun air
asin pada kedalaman bervariasi, dari dekat permukaan hingga beberapa
ribu meter di bawah permukaan. Udang diklasifikasikan sebagai berikut :
Filum : Arthropoda
Subfilum : Crustacea (binatang berkulit keras)
Sub Kelas : Malacrostraca (udang-udangan tingkat tinggi)
Super Ordo : Eucarida
Ordo : Decapoda (binatang berkaki sepuluh)
Sub Ordo : Natantia (kaki digunakan untuk berenang)
Famili : Palaemonidae, Penaidae
(Departemen Kelautan dan perikanan Republik Indonesia, 2003)
Udang biasa dijadikan makanan laut (seafood). Sama seperti
seafood lainnya, udang mengandung sejumlah besar kalsium dan protein,
tetapi rendah kalori. Makanan dengan bahan utama udang merupakan
sumber kolesterol.
Dewasa ini budi daya udang tambak telah berkembang dengan
pesat, karena udang merupakan komoditi ekspor yang dapat diandalkan
dalam meningkatkan ekspor non migas dan merupakan salah satu jenis
biota laut yang bernilai ekonomis tinggi. Indonesia merupakan salah satu
negara pengekspor udang terbesar di dunia dengan nilai ekspor antara
850 juta sampai 1 miliar dollar AS per tahun (Departemen Kelautan dan
Perikanan Republik Indonesia, 2006). Udang yang diekspor diantaranya

dalam bentuk beku (block frozen) yang terdiri dari produk head on (utuh),
headless (tanpa kepala) dan peeled (tanpa kepala dan kulit).
Usaha ekspor udang tersebut menghasilkan limbah udang dalam
jumlah cukup besar yang terdiri dari bagian kepala, kulit dan ekor. Limbah
udang yang dihasiikan dari proses pembekuan udang, pengalengan
udang dan pengolahan kerupuk udang berkisar antara 60-70 % dari berat
udang. Dengan demikian, jumlah bagian yang terbuang dari usaha
pengolahan udang cukup tinggi.
Di Indonesia saat ini ada sekitar 170 industri pengolahan udang
dengan kapasitas produksi sekitar 500.000 ton per tahun. Diperkirakan,
dari proses pengolahan oleh seluruh unit pengolahan yang ada, akan
dihasilkan limbah sebesar 325.000 ton per tahun (Departemen Kelautan
dan Perikanan Republik Indonesia, 2006). Limbah sebanyak itu, jika tidak
ditangani secara tepat, akan menimbulkan dampak negatif bagi
lingkungan sebab limbah tersebut dapat menimbulkan bau busuk yang
memberikan ketidaknyamanan pada lingkungan. Sebagian kecil dari
limbah udang sudah termanfaatkan dalam hal pembuatan kerupuk udang,
petis, terasi, dan bahan pencampur pakan ternak serta pupuk.
Pemanfaatan limbah udang tidak hanya memberikan nilai tambah
pada usaha pengolahan udang, tetapi juga dapat menanggulangi masalah
pencemaran lingkungan yang ditimbulkan, terutama masalah bau yang
dikeluarkan serta estetika lingkungan yang kurang baik (Manjang, 1993).
Limbah kulit udang mengandung konstituen utama yang terdiri dari
protein, kalsium karbonat, khitin, pigmen dan abu. Kulit udang
mengandung protein sebanyak (25 % - 40%), kalsium karbonat (CaCO3)
(45% - 50%) dan kitin (15% - 20%), tetapi besarnya kandungan komponen
tersebut tergantung pada jenis udangnya (Focher et al., 1992). Komposisi
kimia limbah udang dan kulit udang dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Komposisi Kimia Limbah Udang dan Kulit Udang (No et al, 1989)

Komposisi
Protein kasar (%)

Limbah Udang
35,8

Kulit Udang
16,9

Lemak (%)
9,9
0,6
Serat Kasar (%)
13,20
0
Abu (%)
38,1
63,6
Ca (%)
12,3
24,8
Astasantin (ppm)
78
108
Astasantin merupakan pewarna alam yang sehat dan aman
dimakan, maka perlu diuji metode esktraksi yang paling banyak
mengekstrak Astasantin. Pada penelitian digunakan metode ekstraksi
dengan cara maserasi menggunakan pelarut aseton.
2.1.2. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan proses pemisahan dua zat atau lebih dengan
menggunakan pelarut yang tidak saling campur. Pemindahan komponen
dari padatan ke pelarut pada ekstraksi padat-cair melalui tiga tahapan,
yaitu difusi pelarut ke pori-pori padatan atau ke dinding sel, di dalam
dinding sel terjadi pelarutan padatan oleh pelarut, dan tahapan terakhir
adalah pemindahan larutan dari pori-pori menjadi larutan ekstrak.
Ekstraksi padat-cair dipengaruhi oleh waktu ekstraksi, suhu, pengadukan,
dan banyaknya pelarut yang digunakan (Harborne, 1987). Tingkat
ekstraksi bahan ditentukan oleh ukuran partikel bahan tersebut. Bahan
yang diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah
kontak antara bahan dan pelarut sehingga ekstraksi berlangsung dengan
baik. Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu ekstraksi
bertahap, ekstraksi kontinyu, ekstraksi counter current dan ekstraksi fluida
super kritis.

a. Ekstraksi Bertahap
Ekstraksi bertahap adalah metode ekstraksi yang paling mudah dan
sederhana, dan pada pengerjaannya hanya memerlukan corong pisah.
Pada metode ini larutan sampel yang akan diekstrak, dimasukkan ke
dalam corong pisah, kemudian tambahkan pelarut yang sesuai. Campuran
tersebut kemudian digoncang beberapa lama sampai komponen yang

diekstrak berada dalam kesetimbangan dengan komponen yang terdapat

dalam sampel. Diamkan larutan sampai pelarut dan larutan sampel
terpisah. Pelarut yang mengandung komponen sampel yang diekstrak
dipindahkan ke dalam wadah lain untuk dianalisis Iebih lanjut.

b. Ekstraksi Kontinyu
Ekstraksi kontinyu dapat dilakukan dengan menggunakan sokletasi.
Sokletasi dilakukan dengan pemanasan, sehingga uap yang timbul
setelah dingin secara kontinyu akan membasahi sampel, secara teratur
pelarut tersebut akan kembali kedalam labu dengan membawa senyawa
kimia yang terekstrak oleh pelarut tersebut. Pada gambar 1 menunjukkan
bagian dari alat soklet. Perangkat untuk sokletasi terdiri dari kolom
ekstraksi (B) yang dilengkapi dengan pipa-pipa penghubung di salah satu
kolom, labu bulat (A), kondesor dan alat pemanas.

A schematic representation of a Soxhlet extractor

1: Stirrer bar
2: Still pot (the still pot should not be overfilled and the volume of solvent in the still pot should be 3 to 4 times the vo
3: Distillation path
4: Thimble
5: Solid
6: Siphon top
7: Siphon exit
8: Expansion adapter
9: Condenser
10: Cooling water in
C
11: Cooling water out

Gambar 1. Alat Soklet (anonim, 2013)

Jika sampel yang akan diekstrak berupa zat padat, maka zat tersebut
dihaluskan, kemudian dimasukkan ke dalam sebuah tabung yang terbuat
dari kertas yang kalis air. Selanjutnya tabung (kertas yang berisi sampel)
tersebut dimasukkan ke dalam kolom B. Lalu dimasukkan beberapa butir

batu didih kedalam labu A. Susun alat seperti gambar 1 sokletasi. Isi labu
A dengan pelarut. Kemudian alirkan air pendingin, nyalakan alat pemanas,
sehingga pelarut dalam labu A mendidih. Uap dari labu A naik akan naik
ke kolom B melalui pipa C. Dalam kolom B, uap dari pelarut akan
terkondensasi menjadi cair, dan setelah beberapa lama, sampel yang ada
dalam tabung kertas akan terendam dengan cairan pelarut.
Karena labu A terus dipanaskan, maka uap dari pelarutnya terus
menerus terbentuk, dan tabung B lama kelamaan akan penuh dengan
pelarut. Jika permukaan pelarut sama tinggi dengan permukaan pipa di
sisi soklet, secara otomatis pelarut ini akan masuk ke dalam labu A sambil
membawa komponen yang terlarut. Proses ini terus berlangsung selama
alat pemanas dinyalakan. Akhirnya pada labu A akan terkumpul komponen
yang diekstraksi, dan pada kolom B tinggal komponen yang tidak
terekstraksi.
c. Ekstraksi Counter Current (Ekstraksi Craig)
Sebuah

metode

multiple

ekstraksi

cair-cair

adalah

ekstraksi

berlawanan, yang memungkinkan pemisahan zat dengan koefisien

distribusi yang berbeda (rasio). Lyman C. Craig pada tahun 1943
menciptakan desain cerdas untuk metode ekstraksi berlawanan yang
dikenal sebagai alat Craig seperti pada gambar 2.
Gambar 2. Alat Craig. Dioperasikan secara manual yang terdiri dari 25 tabung ( E.

Efstathiou, 2000)

Prinsip kerja alat Craig adalah ekstraksi berganda yang dilakukan

berulang-ulang seperti pada gambar 3. Dalam perhitungannya diandaikan
bahwa koefisien distribusi (Kd) = 1, dan volume fasa organik maupun
volume fasa air jumlahnya sama.

10

Gambar 3. Model Kerja Alat Craig ( E. Efstathiou, 2000)

d. Ekstraksi Fluida kritis

Ekstraksi

fluida

superkritis

adalah

suatu

proses

ekstraksi

menggunakan fluida superkritis sebagai pelarut. Teknologi ekstraksi ini

memanfaatkan kekuatan pelarut dan sifat fisik dari komponen murni atau
campuran pada temperatur dan tekanan kritisnya dalam keseimbangan
fase (Palmer, 1995). Fluida superkritis adalah fluida dengan tekanan dan
suhu di atas titik kritisnya (Mc Hugh dan Krukonis, 1986), yaitu suatu
keadaan dimana fluida berada dalam keadaan seimbang antara fase gas
dan fase cairnya. Untuk beberapa zat misalnya suhu dan tekanan
kritisnya ialah 31C dan 73 atm.
Fluida kritis mempunyai kerapatan dan daya pelarutan yang sama
dengan pelarut-pelarut cair, namun mempunyai karakteristik tertentu yaitu
daya difusinya sangat cepat dan viskositasnya sama dengan viskositas
gas. Daya pelarutan yang mirip cairan dan difusi yang mirip gas ini
menghasilkan kondisi yang ideal untuk mengekstraksi zat dari berbagai
bahan dengan tingkat perolehan yang tinggi dalam waktu yang singkat.
Kerapatan fluida super kritis yang dapat divariasikan dan dikendalikan
dengan mengatur tekanan dan suhu.

11

Tabel 2. Perbandingan Sifat Fisik Dari Gas, Cairan, dan Fluida Superkritis (Sumber
: Hbshmann, H.J., 2009)

Fase
Gas
Fluida Superkritis
Cair

Densitas
(g.cm-3)
10-3
0,1-1,0
1

Difusivitas
(cm2.s-1)
10-1
10-3-10-4
<10-5

Viskositas
(g.cm-1.s-1)
10-4
10-3-10-4
10-2

Biasanya untuk ekstraksi fluida super kritis digunakan gas CO 2. Sifat

gas CO2 yang non polar, mudah mencair, dan mudah melarutkan
senyawa-senyawa organik yang non polar. Daya larut dan sifat kepolaran
gas CO2 dapat ditingkatkan atau dikurangkan dengan memfariasikan suhu
dan tekanan.Tetapi jika peningkatan suhu dan tekanan tidak dapat
meningkatkan kepolarannya, sehingga tidak dapat melarutkan senyawasenyawa non polar, maka perlu ditambahkan sedikit pelarut lain modifier
seperti metanol, isopropanol, asetonitril, air atau benzena. Kelarutan
komponen dalam fluida superkritis tergantung pada densitas dari pelarut,
juga afinitas fisik kimia dari zat terlarut terhadap pelarut.
Selain itu menurut jenis bahan yang diekstrak, ekstraksi dibedakan
menjadi padat-cair, yaitu dengan cara sokletasi, perkolasi dan maserasi
dengan atau tanpa pemanasan. Metode lain yang lebih sederhana dalam
mengekstrak padatan adalah dengan mencampurkan seluruh bahan
dengan pelarut, lalu memisahkan larutan dengan padatan tak terlarut.

a. Sokletasi
Ekstraksi dengan menggunakan alat soklet ini dipakai untuk
mengekstrak senyawa organik dari bahan alam seperti daun, akar, dan
batang. Keuntungan ekstraksi dengan metode ini yaitu sampel dan pelarut
yang diperlukan sedikit, proses ekstraksi berlangsung cepat, dan dapat

12

mengambil senyawa organik dengan optimal. Kekurangan metode ini yaitu

tidak baik digunakan untuk mengekstraksi senyawa yang dapat rusak
karena pemanasan (Dinda, 2008).
b. Perkolasi
PerkoIasi adalah ekstraksi dengan mengalirkan pelarut melalui
serbuk sampel bahan alam yang telah dibasahi. Keuntungan metode ini
yaitu sampel padat telah terpisah dari ekstrak. Kekurangan metode ini
adalah, pelarut tidak melarutkan komponen secara optimal (Dinda, 2008).
c. Maserasi
Maserasi adalah perendaman sampel dalam pelarut organik pada
temperatur ruangan. Saat perendaman, senyawa bahan alam dapat
terekstrak karena terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat
perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar (Lenny, 2006). Keuntungan
metode ini adalah peralatan yang digunakan sederhana dan balk untuk
senyawa bahan alam yang tidak tahan panas. Kekurangan dari metode ini
adalah membutuhkan waktu lama dan banyak pelarut.
Menurut Harborne (1987), metode maserasi digunakan untuk
mengekstrak

jaringan

tanaman

yang

belum

diketahui

kandungan

senyawanya yang kemungkinan bersifat tidak tahan panas sehingga

kerusakan komponen tersebut dapat dihindari. Kekurangan dari metode
ini adalah waktu yang relatif lama dan membutuhkan banyak pelarut.
Ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan prinsip kelarutan.
Prinsip kelarutan adalah like dissolve like, yaitu (1) pelarut polar akan
melarutkan senyawa polar, demikian juga sebaliknya pelarut nonpolar
akan melarutkan senyawa nonpolar, (2) pelarut organik akan melarutkan
senyawa organik. Ekstraksi senyawa aktif dari suatu jaringan tanaman
dengan berbagai jenis pelarut pada tingkat kepolaran yang berbeda
bertujuan untuk memperoleh hasil yang optimum, baik jumlah ekstrak
maupun senyawa aktif yang terkandung dalam contoh uji.
Polaritas

sering

diartikan

sebagai

adanya

pemisahan

kutub

bermuatan positif dan negatif dari suatu molekul sebagai akibat

13

terbentuknya konfigurasi tertentu dari atom-atom penyusunnya. Dengan

demikian, molekul tersebut dapat tertarik oleh molekul yang lain yang juga
mempunyai polaritas yang kurang lebih sama. Besarnya polaritas dari
suatu pelarut proporsional dengan besarnya konstanta dielektriknya
(Adnan, 1997). Menurut Stahl (2003), konstanta dielektrik () merupakan
salah satu ukuran kepolaran pelarut yang mengukur kemampuan pelarut
untuk menyaring daya tarik elektrostatik antara isi yang berbeda.
Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa seperti
komponen fenolik, karotenoid, tannin, dan asam-asam amino. Pelarut non
polar dapat mengekstrak senyawa kimia seperti lilin, lemak, dan minyak
yang mudah menguap. Metanol merupakan senyawa polar yang umum
disebut sebagai pelarut universal karena selain mampu mengekstrak
komponen polar juga dapat mengestrak komponen non polar seperti lilin
dan lemak
Prosedur klasik untuk memperoleh kandungan senyawa organik dari
jaringan

tumbuhan

kering

adalah

dengan

proses

ekstraksi

berkesinambungan atau bertingkat dengan menggunakan beberapa

pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya (Harborne 1987). Ekstraksi
berkesinambungan dilakukan secara berturut-turut dimulai dengan pelarut
nonpolar (misalnya n-heksan atau kloroform) dilanjutkan dengan pelarut
semipolar (etil asetat atau dietil eter) kemudian dilanjutkan dengan pelarut
polar (metanol atau etanol). Pada proses ekstraksi akan diperoleh ekstrak
awal (crude extract) yang mengandung berturut-turut senyawa nonpolar,
semipolar, dan polar. Hasil ekstrak yang diperoleh tergantung pada
beberapa faktor, yaitu kondisi alamiah senyawa tersebut, metode ekstraksi
yang

digunakan,

ukuran

partikel

contoh

uji,

kondisi

dan

waktu

penyimpanan, lama waktu ekstraksi, dan perbandingan jumlah pelarut

terhadap jumlah contoh uji.
Pelarut yang digunakan untuk proses ekstraksi harus memenuhi
beberapa persyaratan yaitu pelarut tersebut merupkan pelarut terbaik
untuk bahan yang akan diekstraksi dan pelarut tersebut harus terpisah

14

dengan cepat setelah pengocokkan. Beberapa jenis pelarut organik yang

umum digunakan disertai sifat-sifat fisiknya dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Beberapa Jenis Pelarut Organik dan Sifat Fisiknya (Nur dan Adijuwana, 1989)

Titik Didih

Titik Beku

Konstanta

(C)

(C)

Dielektrik

Dietil eter

35

-116

4,3

Karbon disulfit

46

-111

2,6

Aseton

56

-95

20,7

Kloroform

61

-64

4,8

MetanoI

65

-98

32,6

Tetrahidrofuran

66

-65

7,6

Di-isopropil eter

68

-60

3,9

N-heksan
Karbon

69

-94

1,9

76

-23

2,2

tetraklorida
Etil asetat

77

-84

6,0

Etanol

78

-117

24,3

Benzena

80

5,5

23

Siklolieksana

81

6,5

2,0

Isopropanol

82

-89

18,3

Air

100

78,5

Dioksan

102

12

2,2

Toluena
Asam asetat

111

-95

2,4

118

17

6,2

N.N
dimetil
glacial

154

61

34,8

formamida
Dietilenaglikol

245

-10

37,7

Pelarut

Kelarutan suatu zat di dalam pelarut bergantung pada jenis ikatan di

dalamnya apakah polar atau non polar. Zat yang polar seperti air hanya
larut di dalam pelarut polar, sedangkan zat-zat non polar hanya larut di
dalam pelarut non polar.

15

Metode maserasi dengan pelarut organik telah digunakan

untuk

mengekstrak karotenoid dari limbah kulit udang karena tidak memerlukan

suhu tinggi dalam pelaksanaannya (Sachindra et al., 2006). Menurut Pu
(2008), Astasantin yang merupakan jenis karotenoid utama dalam kulit
udang akan mulai terdegradasi pada suhu di atas 60C. Karotenoid yang
terdapat pada kulit udang berikatan dengan protein membentuk kompleks
karotenoprotein sehingga dalam metode maserasi diperlukan jenis pelarut
organik yang dapat memutuskan ikatan karotenoid dengan protein
(Hendry dan Houghton, 1996).
2.1.3. Astasantin (Pigmen Karotenoid)
Astasatin merupakan sebuah pigmen warna karotenoid. Nama
karotenoid berasal dari pigmen utama wortel (Daucus carota). Karotenoid
merupakan kelompok pigmen alami yang berperan cukup baik dalam
memberikan warna kuning, oranye, dan merah. Warna itu adalah akibat
dari adanya ikatan rangkap dua yang terkonyugasi. Makin banyak ikatan
rangkap yang terkonyugasi dalam molekul, pita serapan utama makin
bergeser ke daerah panjang gelombang yang lebih tinggi; akibatnya, rona
makin merah. Diperlukan minimum tujuh ikatan rangkap terkonyugasi
sebelum warna kuning yang dapat diserap timbul. Warna yang dihasilkan
dari karotenoid merupakan warna sitentik, namun telah dianggap sama
dengan pewarna alam dan karena itu tidak perlu pemeriksaan toksikologi
secara ketat seperti bahan tambah lain (DeMan, 1997).
Karotenoid merupakan golongan besar senyawa yang tersebar luas
dalam produk yang berasal dari hewan dan tumbuhan. Pigmen ini
terdapat dalam ikan dan krustasea, sayur dan buah, telur, produk susu,
dan serealia. Pada hewan air senyawa karotenoid banyak ditemukan pada
kulit, kulit, dan kerangka luar (eksoskeleton). Selain itu, karotenoid juga
dapat ditemukan pada bakteri, kapang, ganggang, dan tanaman hijau
(Hendry dan Houghton,1996). Karotenoid yang terkandung pada hewan
disebabkan oleh aktivitas hewan tersebut yang mengkonsumsi tumbuh-

16

tumbuhan yang mengandung komponen karotenoid,

seperti inisalnya

warna merah muda pada salmon dan kulit udang yang disebabkan
adanya komponen karotenoid jenis Astasantin yang berasal dari tumbuhtumbuhan laut yang dimakannya (Schwartz, 1994).
Berdasarkan unsur-unsur penyusunnya, karotenoid digolongkan
menjadi dua kelompok pigmen, yaitu karoten dan xantofil. Karoten
memiliki susunan kimia yang hanya terdiri dari gugus C dan H seperti
alfa, beta, dan gamma karoten, sedangkan xantofil terdiri atas gugus
atom C, H, dan O. Contoh-contoh dari senyawa yang termasuk golongan
xantofil yaitu kantaxantin, Astasantin, kapaxantin, rodoxanthin, dan
torularhodin (Hendry dan Houghton, 1996). Menurut Khanafari et al.
(2007), Astasantin merupakan jenis karotenoid utama yang terdapat
pada kulit udang.

-Karoten

Astasantin

Gambar 4. Struktur -Karoten dan Astasantin (DeMan, 1997)

2.1.4. Karotenoid Alami dalam Menangkal Radikal Bebas

Karotenoid merupakan kelompok pigmen warna dan antioksidan
alami yang dapat meredam radikal bebas. Sebagai pigmen warna,
karetonoid dapat memunculkan warna kuning jingga dan merah pada
tanaman maupun kulit hewan (Gross, 1991; Roddrigues-Amaya, 2004;
Stahl dan Sies, 2003). Selain sebagai pigmen warna, karotenoid juga
merupakan sumber prekursor vitamin A, antioksidan, peningkatan daya
tahan tubuh, dan pengubahan metabolisme kanker (Zeb dan Mehmod,
2004).
Ditinjau karotenoid sebagai penangakap radikal bebas (antioksidan),
maka karotenoid dapat berfungsi sebagai pemadam oksigen singlet dan
pendeaktifasi radikal bebas (Palozza dan Krinsky, 1992; dalam RodriguezAmaya, 2001). Strategi pertahanan karotenoid adalah yang paling

17

mungkin dalam pencarian dua spesies oksigen berupa molekul singlet

oksigen (1O2) dan peroksida radikal. Lebih lanjut karotenoid adalah
deaktivator efektif terhadap sensitaizer elektron exitasi molekul, dengan
melibatkan generasi dari radikal dan singlet oksigen. Interaksi dari
karotenoid dengan 1O2 tergantung kekuatan pemadaman proses fisika,
dimana terlibat langsung energi transfer diantara kedua molekul. Energi
dari molekul singlet oksigen berpindah ke molekul karotenoid, selanjutnya
diperoleh ground state (keadaan dasar) oksigen dan ketriplet exitasi
karotenoid (Stahl dan Sies, 2003). Kelebihan energi dari molekul yang
tereksitasi

akan

ditransfer

melalui

mekanisme

pelepasan

energi.

Mekanisme karotenoid sebagai pemadam oksigen singlet adalah:

1

O2 + 1Karotenoid

O2 + 3Karotenoid

Energi akan dilepas melalui interaksi rotasi dan vibrasi antara

karotenoid triplet dengan pelarut untuk mengembalikan karotenoid
kekeadaan semula (He, dkk., 2000; Palva dan Russel, 1999; Pokorny dan
Gordon, 2001, Stahl dan Sies, 2003).
3

Karotenoid*

Karotenoid + energi panas

Fungsi karotenoid sebagai pendeaktivasi radikal bebas terjadi

melalui

proses

transfer

elektron.

Reaksi

karotenoid

sebagai

pendeaktivasi radikal bebas adalah:

R* + Karotenoid

RH + Karotenoid*

R + Karotenoid

R- + Karotenoid+

Karotenoid jenis Astasantin yang merupakan karotenoid utama pada

hewan golongan crustacea seperti lobster, udang, dan kepiting merupakan
jenis karotenoid yang memiliki aktifitas antioksidan terkuat (Astawan dan
Kasih, 2008). Menurut Naguib (2000), aktifitas antioksidan pada
Astasantin 10 kali lebih kuat dibandingkan dengan jenis karotenoid
lainnya.

Aktivitas

antioksidan

pada

karotenoid

didasarkan

pada

kemampuan karoten untuk menangkal singlet oxygen dan radikal proksil.

Kemampuan

karotenoid

dalam menangkal

singlet oxygen

bergantung pada jumlah ikatan rangkap molekul yang terkonjugasi.

sangat

18

2.1.5. Antioksidan
Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda,
memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus,
antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya
reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid.
Tubuh dapat menghasilkan antioksidan yang berupa enzim yang
aktif bila didukung oleh nutrisi pendukung atau mineral yang disebut juga
ko-faktor. Antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh antara lain:
1. Superoksida dismulase
Antioksidan

ini

merupakan

enzim

yang

bekerja

bila

ada

pembantunya yaitu berupa mineral-mineral seperti tembaga, mangan

yang bersumber pada kacang-kacangan, padi-padian. Dengan demikian
sangat diperlukan sekali mengkonsumsi bahan tersebut di atas.
Sayangnya kita lebih senang mengkonsumsi bahan yang enak dimakan.
Bagi orang yang mampu, kekurangan mineral dapat dilakukan dengan
meminum multivitamin dan suplemen mineral tetapi bagi orang yang
hidupnya biasa saja lebih balk mengkonsumsi mineral dari tanaman
karena banyak juga tanaman yang dapat menghasilkan SOD antara lain
brokoli, bayam, sawi dan juga hasil-hasil olahan seperti tempe.
2. Glutathione peroksidase
Adalah enzim yang berperan aktif dalam menghilangkan H 2O2 dalam
tubuh dan mempergunakannya untuk merubah glutathione (GSH) menjadi
glutathine teroksidasi (GSSG).
Enzim tersebut mendukung aktivitas enzim SOD bersama-sama
dengan enzim katalase dan menjaga absorbansi ekstrak oksigen akhir
agar stabil dan tidak berubah menjadi pro-oksidan. Makanan yang kaya
glutahione adalah kubis, brokoli, asparagus, alpukat dan kenari.
Glutathione sangat penting sekali melindungi selaput-selaput sel.
Senyawa ini merupakan tripeptida yang terdiri dari asam amino glisin,
asam glutamat dan sistein.

19

3. Katalase
Enzim katalase di samping mendukung aktivitas enzim SOD juga
dapat mengkatalisa perubahan berbagai macam peroksida dan radikal
bebas menjadi oksigen dan air.
Enzim-enzim

tersebut

di

atas

dalam

bekerjanya

membutuhkan mineral-mineral penyusun sebagai berikut :

Copper (Cu)

Manganese (Mn)

Zinc (Zn)

Besi (Fe)

Selenium (Se)

sengat

20

Berdasarkan
dikelompokkan

sumbernya,

menjadi

dua

antioksidan
kelompok,

di

yaitu

luar

tubuh

antioksidan

dapat
sintetik

(antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesis reaksi kimia) dan

antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) (Kochar and
Rossell, 1990).
Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari (a) senyawa
antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, (b)
senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses
pengolahan, (c) senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan
ditambahkan ke makanan sebagai bahan tam bahan pangan (Pratt, 1992).
Asupan bahan makanan yang mengandung antioksidan kuat
dibutuhkan bila kapasitas antioksidan dalam tubuh menurun. Terdapat
banyak sekali jenis makanan yang memiliki kekuatan antioksidan,
misalnya -karoten, vitamin A, E dan C.
Terdapat sekitar 732 jenis antioksidan dari golongan karotenoid.
Karotenoid tidak bisa disintesis oleh tubuh, karena itu antioksidan jenis ini
diperoleh dari asupan makanan. Terdapat dua kelas antioksidan dari
kelompok karotenoid, yaitu xantofil dan karoten. Antioksidan dari kelas
karoten misalnya -karoten dan likopen, sedangkan dari kelas xantotil
contohnya Iutein dan Astasantin. Berdasarkan fungsinya, antioksidan
dapat dibedakan atas:
1. Antioksidan primer
Antioksidan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal
bebas baru, karena antioksidan ini dapat merubah radikal bebas yang ada
menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya, sebelum sempat
bereaksi. Antioksidan primer yang ada dalam tubuh adalah enzim
superoksida dismutase. Enzim ini sangat penting karena dapat melindungi
sel-sel tubuh dari serangan radikal bebas. Kerja enzim ini sangat
dipengaruhi oleh mineral seperti mangan, seng, tembaga dan selenium
yang terdapat dalam makanan.
2. Antioksidan sekunder

21

Antioksidan

sekunder

merupakan

senyawa

yang

berfungsi

menangkap radikal bebas serta mencegah terjadinya reaksi berantai

sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih besar. Contoh antioksidan
sekunder adalah vitamin E, vitamin C dan beta karoten yang dapat
diperoleh dari buah-buahan.
3. Antioksidan tersier
Antioksidan tersier merupakan senyawa yang memperbaiki sel-sel
dan jaringan yang rusak karena serangan radikal bebas. Biasanya yang
termasuk kelompok ini adalah jenis enzim, misalnya metionin sulfoksidan
reduktase yang dapat memperbaiki DNA dalam inti sel. Enzim ini
bermanfaat untuk perbaikan DNA pada penderita kanker.
4. Oxygen scavenger
Antioksidan yang termasuk oxygen scavenger mengikat oksigen
sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi. misalnya vitamin C.
5. Chelator /sesquesstrant
Antioksidan jenis ini mengikat logam yang mampu mengkatalisis
reaksi oksidasi, misalnya asam sitrat dan asam amino.
Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat
oksidasi Iemak. Oksidasi lemak terdiri dari tiga tahap utama, yaitu inisiasi,
propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal
asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak
stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen. Pada
tahap propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen
membentuk radikal peroksi. Radikal peroksi akan menyerang asarn lemak
menghasilkan

hidroperoksida

dan

radikal

asam

lemak

baru.

Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi

lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek
seperti aldehida dan keton yang bertanggungjawab atas flavor makanan
berlemak (Gordon, 1990).
Proses

penuaan

kardiovaskuler,

dan

penyumbatan

penyakit

degeneratif

pembuluh

darah

seperti
yang

kanker
meliputi

22

hiperlipidemik, aterosklerosis, stroke, dan tekanan darah tinggi serta

terganggunya sistem imun tubuh dapat disebabkan oleh stres oksidatif.
Stres oksidatif adalah keadaan tidak seimbangnya jumlah oksidan dan
prooksidan dalam tubuh. Pada kondisi ini, aktivitas molekul radikal bebas
atau reactive oxygen species (ROS) dapat menimbulkan kerusakan
seluler dan genetika. Kekurangan zat gizi dan adanya senyawa xenobiotik
dari makanan atau lingkungan yang terpolusi akan memperparah keadaan
tersebut.
Umumnya masyarakat Jepang atau beberapa masyarakat Asia
jarang memiliki masalah dengan berbagai penyakit degeneratif. Hal ini
disebabkan oleh menu sehat tradisionalnya yang kaya zat gizi dan
komponen

bioaktif.

Zat-zat

ini

mempunyai

kemampuan

sebagai

antioksidan, yang berperan penting dalam menghambat reaksi kimia

oksidasi yang dapat merusak makromolekul dan dapat menimbulkan
berbagai masalah kesehatan.
Peran

positif

kardiovaskuler

antioksidan

(terutama

terhadap

yang

penyakit

diakibatkan

oleh

kanker

dan

aterosklerosis

(penyumbatan) dan penyempitan pembuluh darah) juga banyak diteliti.

Antioksidan berperan dalam melindungi lipoprotein densitas rendah (LDL)
dan

sangat

rendah

(VLDL)

dari

reaksi

oksidasi.

Pencegahan

aterosklerosis ini dapat dilakukan dengan menghambat oksidasi LDL

menggunakan antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan.
Untuk kanker dan tumor, banyak ilmuwan spesialis setuju bahwa penyakit
ini berawal dari mutasi gen atau DNA sel. Perubahan pada mutasi gen
dapat terjadi melalui mekanisme kesalahan replikasi dan kesalahan
genetika yang berkisar antara 10-15 %, atau faktor dari luar yang merubah
struktur DNA seperti virus, polusi, radiasi, dan senyawa xenobiotik dari
konsumsi pangan sebesar 80-85 %. Radikal bebas dan reaksi oksidasi
berantai yang dihasilkan berperan pada proses mutasi ini. Resiko ini dapat
dikurangi dengan mengkonsumsi antioksidan dalam jumlah yang cukup.

23

2.1.6. Ekstraksi Astasantin dari Tepung Kulit Udang Sebagai

Antioksidan Alami
Ekstraksi Astasantin dari tepung kulit udang dapat dilakukan dengan
menggunakan

metode

maserasi,

karena

metode

maserasi

tidak

memerlukan suhu tinggi dalam pelaksanaannya. Hal ini sesuai dengan

sifat pigmen Astasantin yang merupakan jenis karotenoid utama pada kulit
udang yang tidak tahan pada suhu tinggi. Menurut Pu (2008), Astasantin
akan mulai terdegradasi pada suhu diatas 60C, sehingga dalam
penelitian ini digunakan suhu maserasi yang tidak melebihi suhu 60C.
Pada proses maserasi tepung kulit udang diperlukan suatu pelarut
yang tepat, menurut Sachindra et al. (2006) pelarut organik merupakan
pelarut yang baik untuk mengekstrak karotenoid dari limbah kulit udang.
Karotenoid yang terdapat pada kulit udang berikatan dengan protein
membentuk kompleks karotenoprotein sehingga dalam metode maserasi
diperlukan jenis pelarut organik yang dapat memutuskan ikatan karotenoid
dengan protein (Hendry dan Houghton, 1996). Kelarutan suatu zat di
dalam pelarut bergantung pada jenis ikatan di dalamnya apakah polar
atau non polar. Zat yang polar seperti air hanya larut di dalam pelarut
polar, sedangkan zat-zat non polar hanya larut di dalam pelarut non polar.
Pelarut yang bersifat polar mampu mengekstrak senyawa seperti
komponen fenolik, karotenoid, tannin, dan asam-asam amino. Pelarut non
polar dapat mengekstrak senyawa kimia seperti lilin, lemak, dan minyak
yang mudah menguap.
Menurut Khanafari et al. (2007), jenis pigmen karotenoid utama yang
terdapat pada kulit udang ialah Astasantin. Astasantin merupakan
kelompok pigmen karotenoid jenis xantofil yang memiliki aktivitas
antioksidan tertinggi dibandingkan jenis pigmen karotenoid lainnya
(Astawan dan Kasih, 2008; Hendry dan Houghton, 1996). Menurut
Mezzomo et al. (2011), metode maserasi dengan pelarut aseton
mengandung Astasantin bebas terbanyak diantara jenis pelarut lainnya

24

yaitu 1312 g g1ekstrak dan menurut Storebakken et al. (2004), Astasantin

bebas memiliki antioksidan yang besar.
Struktur karotenoid mempengaruhi bioaktivitas yang dimilikinya,
seperti faktor ikatan rangkap, rantai terbuka, dan sedikitnya jumlah
substituen oksigen akan meningkatkan aktivitas antioksidan karotenoid (Di
Mascio et al., 1989). Salah satu cara meningkatkan aktivitas antioksidan
alami dari limbah kulit udang yaitu dengan maserasi menggunakan pelarut
aseton, hal ini dikarenakan hasil karotenoid yang didapat berupa
Astasantin dalam bentuk bebas.

Ketidakstabilan Astasantin bebas

terhadap cahaya, oksigen, kadar asam, dan suhu tinggi membuat

Astasantin bebas ini mudah teroksidasi, degradasi, dan isomerisasi. Hal
tersebut membuat kemampuan Astasantin bebas sebagai antioksidan
dalam menangkap radikal bebas semakin meningkat (Storebakken, 2004).
2.1.7. Spektrofotometri UV-Vis
Teknik spektroskopik adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia
yang mengamati interaksi antara atom atau molekul dengan radiasi
elektromagnetik (REM). Terdapat tiga jenis spektrum yang dihasilkan
antara atom atau molekul dengan REM, diantaranya adalah hamburan,
absorpsi, dan emisi. Salah satu spektrum absorpsi REM adalah
spetrofotometri UV-Visibel (Mulja, 1995:19).
Spektrofotometri UV-Visibel (UV-Vis) merupakan teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet
(190 - 380 nm) dan sinar tampak (380 780 nm) dengan memakai
instrumen spektrofotometer (Mulja, 1995:26). Spektrofotometri UV Vis
lebih banyak digunakan untuk analisis kuantitatif daripada kualitatif karena
melibatkan energi elektronik pada molekul yang dianalisis. Panjang
gelombang yang terpilih harus memiliki warna berbeda dengan sampel
(warna komplementer).
Tabel 4. Spektrum Cahaya Tampak dan Warna-Warna Komplementer (Day, 2002)

25

Panjang Gelombang

Warna yang

Warna

(nm)

diabsorp

komplementer

400-435

Violet

Kuning-hijau

435-480

Biru

Kuning

480-490

Hijau-biru

Jingga

490-500

Biru-hijau

Merah

500-560

Hijau

Ungu

560-580

Kuning-hijau

Violet

580-595

Kuning

Biru

595-610

Jingga

Hijau-biru

610-750

Merah

Biru-hijau

Spektrofotometer UV-Vis terdiri dari beberapa bagian penting, yaitu:

sumber radiasi (sinar), monokromator, sel (tempat) sampel dan detektor
yang dihubungkan dengan printer atau komputerisasi (Sitorus, 2009).
Runtunan instrumentasi ini akan menghasilkan nilai absorbansi yang
sesuai dengan panjang gelombang yang dikehendaki.

Gambar 5. Diagram Blok Spektrofotometer

(http://faculty.sdmiramar.edu/fgarces/LabMatters/Instruments/UV_Vis/Cary50.htm)

26

Hubungan antara besarnya absorbansi dan konsentrasi

sampel

dirumuskan oleh Beer (1959). Dimana jika satuan konsentrasi adalah

molaritas (yaitu jumlah mol per liter), maka tetapannya adalah
keterserapan molar ().
Keterangan :
A : absorbansi
a : absorptivitas (tergantung satuan); a (ppm) dan (Molar)
c : konsentrasi larutan
b : tebal media/kuvet
: absorptivitas molar/epsilon (L mol-1 cm -1)

2.1.8. Spektrofotometri Infra Merah

Spektrofotometri infra merah merupakan suatu metode yang
mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada
pada daerah panjang gelombang 0,75 1.000 m atau pada bilangan
gelombang 13.000 10 cm-1 (Giwangkara, 2007). Spektrofotometer infra
merah atau Fourier Transform Infra Red merupakan alat untuk
mendeteksi

gugus

fungsional,

mengidentifikasi

senyawaan

dan

menganalisis campuran. Banyak pita absorpsi yang terdapat dalam

daerah yang di sebut daerah sidik jari spektrum. Spektrum FTIR suatu
sampel dapat di ketahui letak pita serapan yang dikaitkan dengan adanya
suatu gugus fungsional tertentu (Day dan Underwood, 1999).
Jenis instrumen untuk absorbsi inframerah ada dua macam yaitu
instrumen dispersi dan instrumentasi yang menggunakan Fourier
Transform (FTIR). Pada prinsipnya bentuk spektra yang diperoleh dari dua
metode tersebut adalah sama, namun kualitas dan cara memperoleh
spektra sangat berbeda. Perbedaan dari keduanya adalah bila pada
sistem dispersi menggunakan prisma (grating) sebagai pengisolasi
radiasi,

maka

pada

sistem

Fourier

Trasform

Infra

Red

(FTIR)

menggunakan interferometer yang dikontrol secara otomatis dengan

komputer. Pada sistem FTIR dipakai LADER yang berguna sebagai
radiasi yang diinterferensikan dengan radiasi IR agar sinyal yang diterima
oleh detektor utuh lebih baik (Hayati, 2007).
Spektrokopi FTIR digunakan sebagai alat secara kualitatif untuk
menentukan gugus fungsi. Gugus fungsi dapat diintepretasi dengan
memeriksa puncak absorbsi dari spektrum FTIR. Widmer, et al. (1981)
menjelaskan struktur Astasantin pada umumnya memberikan serapan
sedang-kuat antara 3750-3000 cm -1 (uluran -OH), serapan yang cukup
kuat antara 2955-2935 cm-1 (uluran C-H asimetris dari alifatik jenuh dan
rantai samping aromatik), dan serapan lemah-sedang antara 1900-1650
(Uluran C=O). Adapun spektra infra merah yang dihasilkan seperti yang
terdapat pada gambar 6 berikut :

Gambar 6. Spektra infra merah ekstrak Astasantin, (Widmer, 1981).

2.1.9. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT adalah istilah yang umum dipakai ilmuwan di Indonesia yang
merupakan singkatan dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sebagai
pengganti istilah HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Manfaat dan tujuan penggunaan KCKT yaitu untuk mendapatkan
pemisahan suatu komponen senyawa yang baik dengan waktu proses
yang relatif singkat. Hasil yang didapat dari proses pemisahan suatu
komponen senyawa menggunakan KCKT disebut dengan kromatogram
KCKT.
Jika ditinjau dari sistem peralatannya maka KCKT termasuk
kromatografi kolom karena fasa diam yang digunakan ter packing
didalam kolom. Kolom kromatografi cair kinerja tinggi dibedakan menjadi
dua jenis, jika ditinjau dari fase diam dan fase geraknya (Mulja, 1995).
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal
bersifat polar dan fasa geraknya bersifat non polar disebut kolom fase
normal. Sedangkan kromatografi dengan kolom yang fase geraknya

bersifat polar dan fase diamnya bersifat non polar disebut kolom fase
terbalik. Fase diam pada kolom fase terbalik yang umum digunakan
antara lain adalah C18, C8, dan C2.
KCKT selain digunakan untuk pemisahan suatu komponen juga
dapat digunakan untuk mengetahui besar konsentrasi komponen yang
terkandung didalamnya. Penggunaan metode kurva kalibrasi absolut dan
standar internal dapat digunakan dalam penentuan konsentrasi suatu
komponen,

yaitu

setelah

pemisahan

preparatif

dilakukan

pengidentifikasian berdasarkan waktu retensi, pengamatan pada spektrum

UV atau instrumen analitis lainnya.
Penentuan

konsentrasi

suatu

komponen

dilakukan

dengan

membandingkan luas atau tinggi puncak standar dengan sampel. Kurva

kalibrasi dibuat terlebih dahulu dengan menggunakan standar. Pembuatan
kurva kalibrasi standar internal harus memperhatikan beberapa syarat
antara lain ialah standar harus memiliki sifat kimia yang mirip dengan zat
sampel dan puncak standar harus tampil relatif dekat dari zat sampel.
Adapun deskripsi kurva kalibrasi standar internal dapat dilihat pada
gambar 7.

Gambar 7. Deskripsi kurva kalibrasi standar internal (Munson, 1981)

Menurut Meija et al. (1988), metode KCKT merupakan metode

identifikasi dan purifikasi karotenoid yang sedang berkembang pesat. Hal
ini disebabkan KCKT mempunyai kepekaan yang tinggi dan dapat
langsung

digunakan

dalam

proses

pemisahan

serta

penentuan

konsentrasi. Kelebihan lain dari metode identifikasi KCKT dibandingkan

metode identifikasi lainnya adalah kemampuannya untuk mendeteksi
isomer cis-trans pada karotenoid. Analisis dengan menggunakan KCKT
dilakukan dengan mengukur luas area peak yang tertentu dengan
mengacu karotenoid yang terbentuk pada retention time pada standar
yang digunakan (Hendry dan Houghton, 1996).
2.2. Kerangka Berpikir
Pada kulit udang banyak terdapat karotenoid. Karotenoid memiliki
pigmen warna Astasantin, dimana Astasantin dapat dihasilkan dengan
mengekstraksi tepung kulit udang menggunakan pelarut aseton tanpa
adanya pemanasan, sehingga metode ekstraksi yang tepat adalah

maserasi. Penggunaan pelarut polar seperti aseton membuat Astasantin

bebas semakin banyak. Astasantin bebas ini dapat berperan sebagai
antioksidan alami dengan meredam radikal bebas.
Kulit Udang
Mengandung
Karotenoid
Maserasi dengan aseton menghasilkan pigmen
Astasantin bebas
Bermanfaat untuk meredam radikal bebas
Antioksidan
Gambar 8. Kerangka Berpikir

2.3. Penelitian Sebelumnya

Penelitian sebelumnya yang relavan dengan penelitian ini adalah
penelitian yang dilakukan oleh Mezzomo et al. (2011). Penelitian yang
dilakukan oleh Mezzomo adalah penentuan metode ekstraksi terbaik
untuk menghasilkan konsentrasi karotenoid yang besar menggunakan
limbah udang P. brasiliensis dan P. paulensis. Metode ini dapat
meningkatkan nilai guna limbah udang.
Kelebihan

lain

dari

penelitian

Mezzomo

adalah

terdapatnya

beberapa macam perlakuan untuk mengekstrak karotenoid dari kulit

udang sehingga didapat konsentrasi karotenoid yang berbeda-beda.
Variasi perlakuan yang dilakukan oleh Mezzomo antara lain untuk
membandingkan konsentrasi ekstrak kulit udang antara kulit udang natural
(tanpa diberi perlakuan awal) dengan kulit udang yang diolah terlebih
dahulu menjadi tepung kulit udang. Pada proses ektraksi, Mezzomo
menggunakan variasi metode dan pelarut berbeda. Metode ekstraksi yang
digunakan antara lain maserasi, sokletasi, Ultrasound extraction (UE), dan
Hot and cold oil extraction (OilH and OilC). Variasi pelarut yang digunakan

antara lain heksana, pencampuran heksana dengan isopropanol,

isopropanol, etanol, dan aseton.
Berdasarkan hasil penelitian Mezzomo kulit udang yang diolah
terlebih dahulu menjadi tepung kulit udang mengandung ekstrak
karotenoid lebih banyak, dari pada kulit udang yang tanpa perlakuan awal.
Pelarut terbaik untuk mengekstrak karotenoid berdasarkan penelitain
Mezzomo antara lain adalah aseton dan pencampuran antara heksana
dengan isopropanol. Metode terbaik untuk ekstraksi karotenoid adalah
maserasi. Metode maserasi menggunakan pencampuran pelarut heksana
dengan isopropanol akan menghasilkan ekstraksi karotenoid yang lebih
banyak dari pada metode maserasi menggunakan aseton, namun pigmen
karotenoid yang berupa Astasantin bebas yang dihasilkan lebih sedikit.
Pada penelitian Mezzomo tidak menjelaskan waktu maserasi dan
rasio penggunaan pelarut dengan massa tepung kulit udang, untuk
menghasilkan konsentrasi Astasantin yang besar. Selain itu Mezzomo
tidak memaparkan aktivitas antioksidan dari pigmen karotenoid yang
berupa Astasantin bebas.
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Tujuan Operasional Penelitian
Tujuan Operasional Penelitian ini antara lain sebagai berikut :
1. Mengetahui waktu maserasi yang tepat untuk mendapatkan ekstrak
Astasantin yang besar dari tepung kulit udang.
2. Mengetahui rasio tepung kulit udang dengan pelarut aseton yang
tepat untuk mendapatkan ekstrak Astasantin yang banyak.
3. Mampu menginterpretasikan senyawa hasil ekstrak yang didapat
dengan spektrofotometer infra merah.
4. Mengetahui konsentrasi ekstrak ekstrak Astasantin yang didapat
dengan menggunakan KCKT.

5. Menguji aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit udang

dengan menggunakan metode DPPH.
3.2.Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik FMIPA UNJ
Jakarta Timur. Waktu penelitian dari Januari sampai April 2013.
3.3. Alat dan Bahan
Alat yang diperlukan
Alat-alat gelas yang umum digunakan, corong pisah, spatula,
homogeniser, blender, pipet volumetrik, bulp, mikro pipet, aluminum foil,
neraca

analitik,

rotary

evaporator,

spektrofotometer

UV-Vis,

spektrofotometri infra merah, dan KCKT.

Bahan yang diperlukan
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini yaitu limbah kulit
udang yang diperoleh dari limbah kulit udang di pasar tradisional, larutan
aseton pro analisis dan Astasantin murni yang digunakan sebagai larutan
standar. Bahan lainnya yang digunakan pada penelitian ini yaitu kitosan,
HCl 6 M, larutan n-heksana, metanol, asetonitril, dan senyawa 1,1dipheny1-2-picrylhydrazyl (DPPH).
3.4. Prosedur
3.4.1. Pembuatan tepung kulit udang
Kulit udang dicuci, kemudian dikukus selama 10 menit pada suhu
100C. Hal ini karena karotenoid pada kulit udang berada dalam bentuk
kompleks karotenoprotein, yang apabila diberi perlakuan panas dapat
menyebabkan renggangnya ikatan yang mengikat karotenoid dengan
protein sehingga warna udang dapat mengalami perubahan dari gelap
menjadi merah terang (Hendry dan Houghton, 1996). Dengan demikian
protein akan terdenaturasi berupa koagulasi dengan pengendapan di air.

Perlakuan selanjutnya adalah mengeringkan kulit udang pada suhu yang

tidak melebihi 60C. Pengeringan dilakukan hingga didapatkan massa
yang stabil. Lalu kulit udang yang telah kering digiling sampai menjadi
tepung.
3.4.2. Pengaruh waktu ekstraksi terhadap jumlah ekstrak Astasantin
yang didapatkan
Ekstraksi Astasantin dilakukan dengan metode maserasi, 5 gram
tepung kulit udang dilarutkan dengan 50 mL aseton. Perendaman
dilakukan selama beberapa hari pada suhu ruang dan setiap hari diaduk.
Esktrak

dipisahkan

dengan

menggunakan

kertas

saring.

menghasilkan ekstrak yang banyak dengan absorbansi ekstrak

Untuk
yang

besar dilakukan maserasi pada waktu yang berbeda beda yaitu 3, 5, dan
7 hari seperti yang ditunjukkan pada tabel 5.

Tabel 5. Pengaruh Waktu Maserasi terhadap Jumlah Ekstrak Astasantin

Waktu maserasi (hari)

3

*Absorbansi

5
7
*Nilai absorbansi didapatkan setelah ekstrak dimurnikan

3.4.3. Pengaruh rasio tepung kulit udang dengan pelarut aseton

terhadap jumlah ekstrak Astasantin yang didapatkan
Proses optimasi dilanjutkan dengan mengganti perlakuan waktu
maserasi dengan rasio tepung kulit udang dan pelarut aseton. Setelah
didapatkan waktu yang optimum pada penelitian sebelumnya, meserasi
diulangi dengan mengganti volume pelarut menjadi 40 mL dan 45 mL
aseton. Proses maserasi dilakukan selama waktu optimum. Data yang

didapatkan berupa nilai absorbansi dan disajikan seperti pada tabel 6.

Proses pengukuran absorbansi dilakukan setelah ekstrak dimurnikan.
Tabel 6. Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang : Volume Aseton terhadap Jumlah
Ekstrak Astasantin

N
o
1
2

Rasio tepung kulit udang : pelarut

*Absorbansi

1 : 8 (5 mL : 40 g)
1 : 9 (5 mL : 45 g)
*Nilai absorbansi didapatkan setelah ekstrak dimurnikan

3.4.4. Pemurnian Astasantin dan Penentuan Panjang Gelombang

Maksimum
Sebelum dilakukan pengukuran absorbansi, ekstrak dari masingmasing perlakuan maserasi dimurnikan terlebih dahulu, cara pemurnian ini
diadopsi dari penelitian Sachindra et al. (2006). Proses pemurnian
dilakukan dengan metode ekstraksi sederhana dengan menggunakan
corong pisah.
Mula-mula ekstrak dimurnikan dengan petroleum eter. Penggunaan
petroleum eter berfungsi untuk menarik pelarut (aseton) dari ekstrak yang
dihasilkan. Untuk menghilangkan sisa aseton, ekstrak Astasantin kembali
diekstraksi dengan larutan garam NaCl 1% digunakan dan ekstrak yang
telah dipisahkan dari larutan garam ditambahkan dengan padatan natrium
sulfat anhidrat. Lalu filtrat disaring dan dialirkan gas nitrogen selama 5
menit, selanjutnya

untuk mendapatkan ekstrak murni asatasantin

kemudian ekstrak dipekatkan dengan menggunakan alat rotary evaporator

dengan suhu 40oC (Sachindra, 2006).
Ekstrak

yang

telah

bebas

dari

pelarut

kemudian

diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri cahaya tampak.

Pengukuran

absorbansi

dilakukan

dengan

menggunakan

panjang

gelombang maksimum. Kisaran panjang gelombang yang digunakan

untuk mengukur absorbansi Astasantin adalah 460-490 nm (Rodriguez,

2001).
3.4.5. Karakterisasi Ekstrak Astasantin dengan Spektrofotometer
Infra Merah
Karakterisasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak yang
dihasilkan

dilakukan

dengan

menggunakan

spektrofotometer

infra

merah.Pada penelitian spektrofotometer infra merah yang digunakan ialah

Shimadzu IR untuk sampel berupa cairan, dengan tipe wadah sampel
ATR-8200 H/8200 HA.

Gambar 9. Alat Spektrofotometer Infra Merah

Data yang diperoleh dari hasil spektrum infra merah berupa informasi
gugus-gugus fungsional yang menyusun suatu struktur senyawa. Gugus
tersebut diidentifikasi sesuai dengan yang ditunjukkan pada tabel 7.
Tabel 7. Interpretasi Spektra FTIR

Bilangan
No

Gelomban
g (cm-1)

Range

Intensitas

(cm-1)

Referensi

3750-3000

Sedang-kuat

Vibrasi Referensi

Uluran O-H dari ikatan

hidrogen intermolekuler

Uluran C-H asimetris dari

2

2955-2935

Sedang-kuat

alifatik jenuh dan rantai

samping aromatik

1900-1650

1665-1630

Lemah
Lemahsedang

Uluran C=O
Uluran C=C dari alkena

3.4.6. Pengujian konsentrasi ekstrak Astasantin dengan KCKT

Penggunaan instrumen kromatografi cair kinerja tinggi juga dapat
digunakan untuk menghitung konsentrasi Astasantin yang terdapat dalam
ekstrak limbah kulit udang (Mezzomo et al., 2011). Adapun tahap
pengujian Astasantin menggunakan KCKT diadopsi dari penelitian
Mezzomo et al. (2001).
Proses pengujian kadar Astasantin menggunakan KCKT adalah
sebagai berikut, mula-mula sampel ekstrak Astasantin yang sudah
dimurnikan diencerkan dengan 2 mL pelarut n-heksana, lalu dilakukan
penghomogenisasian menggunakan homogeniser selama 5 menit.
Tahapan selanjutnya sebanyak 5 L ekstrak Astasantin diinjeksikan
kedalam injektor KCKT.
Pengoperasian KCKT dilakukan dengan suhu kolom 40C. Kolom
yang digunakan pada proses pemisahan yaitu kolom fasa balik C 18. Fasa
gerak yang digunakan pada pengujian yaitu campuran antara asetonitril
dengan metanol (90:10, v/v). Laju alir pada pengujian diatur menjadi 0,8
mL/menit. Pengujian dilakukan dengan pengulangan sebanyak 3 kali
(triplicate)

3.4.7. Uji aktivitas antioksidan dengan DPPH

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil
pikrilhidrazil). Parameter hasil pengujian dengan metode DPPH adalah

dengan IC (Inhibition Concentration), yaitu konsentrasi larutan sampel

yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal bebas.
Radikal

DPPH

merupakan

senyawa

organik

yang

memiliki

kandungan nitrogen yang tidak stabil dengan nilai absorbansi yang kuat
pada panjang gelombang 517 nm dan memiliki warna ungu gelap. Warna
ungu pada DPPH akan tereduksi menjadi warna kuning apabila bereaksi
dengan senyawa antioksidan. Besarnya tingkat perubahan warna yang
terjadi diukur dengan menggunakan spektrofotometer (Molyneux, 2004).
Pada pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dilakukan proses pembuatan larutan DPPH 0,4 mM adalah dengan cara
melarutkan

DPPH

melarutkannya

sebanyak

dalam

7,4

methanol

mg
pro

(BM
analisis.

394,32

g/mol)

Larutan

dan

kemudian

dipindahkan ke labu ukur 50 mL dan diencerkan sampai tanda batas.

Sampel dibuat menjadi larutan dengan berbagai variasi konsentrasi yaitu
5 g/mL, 10 g/mL, 25 g/mL, 50 g/mL dan 100 g/mL. Kontrol positif
yang digunakan pada penelitian adalah larutan vitamin C. Perlakuan yang
sama seperti sampel, kontrol pun dibuat menjadi larutan dengan berbagai
variasi konsentrasi yaitu 3 g/mL, 6 g/mL, 9 g/mL, 12 g/mL dan 15
g/mL. Masing-masing larutan sampel dan standar dengan berbagai
konsentrasi tersebut kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi dan
dicampurkan dengan 1 mL larutan DPPH. Setelah dicampurkan, larutan
tersebut diinkubasi dalam penangas air 37 oC selama 30 menit. Serapan
larutan diukur pada panjang gelombang serapan maksimum 515 nm
menggunakan

spektrofotometer

cahaya

tampak.

Persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut :

Hambatan (inhibisi) = Serapan blanko Serapan sampel X 100%
Serapan blanko
Nilai

IC50

(Inhibition

Concentration

50)

adalah

konsentrasi

antioksidan (g/mL) yang mampu menghambat 50 % radikal bebas. Nilai

IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara 50% daya hambat dengan
sumbu konsentrasi, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan :

Y = a+bX
Berdasarkan literatur Y bernilai 50,

sehingga

nilai X yang

menunjukkan besarnya IC50 dapat diketahui. Ekstrak yang dinyatakan

aktif dalam menangkal radikal bebas yaitu bila nilai IC 50 kurang dari 100
g/mL.
Nilai IC50 didefinisikan sebagai konsentrasi dari senyawa antioksidan
yang dapat menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH dan pada
umumnya dinyatakan dalam satuan ppm. Semakin kecil nilai IC 50 maka
aktivitas antioksidan dari sampel tersebut semakin baik. Data yang
diperoleh dinyatakan dalam tabel 8.
Tabel 8. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan pada Ekstrak Astasantin dengan DPPH

Nama
Sampel

C
(ppm)

A1

A2

A
Blank

Inhibis
i
(%)

IC50
(ppm)

Sampel
Vitamin
C
Keterangan : C (ppm)

=konsentrasi (ppm)

A1= absorbansi simplo

= absorbansi rata-rata

A2= absorbansi duplo

IC50 = Inhibisi konsentrasi 50

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui waktu dan rasio pelarut
aseton yang tepat untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak Astasantin
yang besar dari tepung kulit udang. Mengetahui konsentrasi ekstrak
Astasantin dari tepung kulit udang yang diukur dengan menggunakan
KCKT dan menguji aktivitas antioksidan ekstrak Astasantin tepung kulit
udang dengan menggunakan metode DPPH. Hasil penelitian diuraikan
menjadi beberapa bagian sebagai berikut :
4.1. Preparasi Sampel,
4.2. Pemurnian Sampel,

4.3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum,

4.4. Hasil Pengaruh Waktu Maserasi,
4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan Pelarut Aseton,
4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIR,
4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKT, dan
4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH.
4.1. Preparasi Sampel
Limbah kulit udang yang telah dibersihkan, dikukus, dan
dikeringkan kemudian digiling. Hasil proses preparasi sampel
ditunjukkan pada gambar 10.

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 10. Pembuatan tepung kulit udang. (a) Limbah kulit udang yang telah bersih,
(b) Kulit udang setelah dikukus, (c) Kulit udang setelah dikeringkan, dan (d)
Kulit udang digiling hingga menjadi tepung.

Warna kulit udang setelah proses pengukusan menjadi merah

terang, hal ini dikarenakan renggangnya ikatan yang mengikat
karotenoid dengan protein. Protein yang telah terlepas dari
karotenoid tersebut akan terdenaturasi dengan koagulasi dan
mengendap pada air.
4.2. Pemurnian Sampel
Tepung kulit udang dimaserasi menggunakan pelarut aseton
dengan masing-masing perlakuan. Hasil ekstraksi tepung kulit udang
dengan pelarut aseton dapat dilihat pada gambar 11.

(a)

(b)

(c)

Gambar 11. Ekstrak Astasantin hasil maserasi dengan 50 mL aseton terhadap

waktu maserasi. (a) Waktu maserasi 3 hari, (b) Waktu maserasi 5
hari, dan (c) Waktu maserasi 7 hari.

(a)

(b)

Gambar 12. Ekstrak Astasantin terhadap volume pelarut aseton waktu

maserasi 5 hari. (a) Volume aseton 40 mL, (b) Volume aseton
45 mL.

Berdasarkan gambar 11 terlihat bahwa warna ekstrak hasil

maserasi bebeda pada masing-masing waktu maserasi. Pada waktu
maserasi 5 hari terlihat warnanya paling cerah daripada warna
ekstrak lainnya. Sedangkan pada gambar 12 terlihat warna ekstrak
dengan volume aseton 40 mL lebih pekat, daripada warna ekstrak
dengan volume aseton 45 mL.
Ekstrak yang dihasilkan kemudian dimurnikan. Hasil yang
didapatkan setelah pemurnian ekstrak dapat dilihat pada gambar 13.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Gambar 13. Pemurnian ekstrak Astasantin. (a) Waktu maserasi 3 hari, (b) Waktu
maserasi 5 hari, (c) Waktu maserasi 7 hari, (d) Volume aseton 40
mL, dan (e) Volume aseton 45 mL.

Gambar 13 menunjukkan perbedaan warna masing-masing

ekstrak setelah dimurnikan. Pada ekstraksi dengan pengaruh waktu,
terlihat bahwa warna ekstrak hasil maserasi selama 5 hari lebih
pekat daripada ekstrak lainnya. Untuk warna yang dimunculkan pada
ekstraksi pengaruh rasio terlihat sama antara ekstrak dengan volume
aseton 40 mL maupun 45 mL.
Warna ekstrak setelah proses maserasi terlihat lebih pekat
daripada sebelum ekstraksi. Hal tersebut dapat dikarenakan ekstrak
sudah bebas dari pelarut. Berkurangnya volume ekstrak setelah
dimurnikan juga menguatkan dugaan bahwa pelarut pada ekstrak
telah menguap.

4.3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Untuk mengetahui hasil ekstrak terbanyak dari masing-masing
perlakuan, dilakukan pengukuran absorbansi dari tiap ekstrak, pada
panjang gelombang maksimum. Pengukuran absorbansi ekstrak
menggunakan

spektrofotometer

UV-Vis.

Rentang

panjang

gelombang yang digunakan pada pengukuran adalah 700nm

300nm.
Berdasarkan

pengukuran

absorbansi

ekstrak

didapatkan

panjang gelombang maksimum pada 468 nm. Panjang gelombang

tersebut sesuai dengan panjang gelombang maksimum untuk
pengukuran Astasantin dengan pelarut petroleum eter (Rodriguez-

Amaya, 2001). Hal ini dikarenakan pada proses pemurnian ekstrak,

pelarut aseton telah habis terekstrak oleh petroleum eter.
Tabel 9. Panjang Gelombang Maksimum Pelarut untuk Ekstraksi Astasantin
(Rodriguez, 2001).

Pelarut
Aseton
Benzena, Kloroform
Etanol
Petroleum Eter

Panjang Gelombang
Maksimum (nm)
480
485
478
468

4.4. Hasil Pengaruh Waktu Maserasi

Parameter yang diuji pada penelitian ini adalah nilai absorbansi
dari ekstrak Astasantin tepung kulit udang. Pengukuran absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang makasimum, yaitu pada panjang
gelombang 468 nm. Data hasil pengaruh waktu terhadap nilai
absorbansi disajikan pada Tabel 10 dan Gambar 14.

Tabel 10. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Waktu Maserasi

Waktu Maserasi

Absorbansi

3 hari
5 hari
7 hari

0,819
0,919
0,438

Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin

1
0.92

0.9
0.8 0.82
0.7
0.6

0.5Maserasi terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin

Grafik Waktu
Absorbansi
0.44
0.4
0.3
0.2
0.1
0
3 Hari

5 Hari

7 Hari

Waktu Maserasi
Gambar 14. Grafik Waktu Maserasi terhadap Nilai Absorbansi
Ekstrak Astasantin. Sumbu X merupakan waktu maserasi tepung
kulit udang. Sumbu Y merupakan nilai absorbansi dalam satuan nm.

Hasil dari grafik waktu maserasi terhadap nilai absorbansi

ekstrak Astasantin dapat diketahui, bahwa terjadi penaikan nilai
absorbansi

pada

hari

ke-5.

Hal

ini

dikarenakan

selama

berlangsungnya maserasi terjadi pemecahan membran sel bahan

akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga
senyawa yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut
organik. Semakin lama waktu maserasi terhadap bahan, maka
semakin banyak pula membran sel yang pecah sehingga semakin
banyak Astasantin dalam bentuk yang tersedia maupun bebas yang
terbentuk.
Pada proses maserasi selama 7 hari terjadi penurunan nilai
absorbansi. Hal ini disebabkan karena pelarut aseton yang
higroskopis sehingga mempengaruhi kejenuhan pelarut terhadap
sampel. Aseton merupakan pelarut yang mudah menguap dimana

titik didihnya

mencapai

56,2 oC

(Science

Lab.com).

Hal

ini

menunjukkan bahwa waktu optimal untuk melakukan maserasi

Astasantin dari tepung kulit udang pada suhu ruang adalah selama 5
hari, hasil serupa ditunjukkan pula pada penelitian Mezzomo (2011).
4.5. Hasil Pengaruh Rasio Tepung Kulit Udang dengan Pelarut
Aseton
Setelah didapatkan waktu optimum maserasi, kemudian proses
optimasi dilanjutkan untuk mengetahui rasio tepung kulit udang
dengan pelarut. Pada penelitian ini proses maserasi dilakukan
selama waktu optimum yaitu selama 5 hari dan maserasi dilakukan
pada suhu ruang. Selanjutnya untuk pengukuran absorbansi
dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu 468 nm. Hasil
yang didapatkan pada proses optimasi kedua ini disajikan pada
Tabel 11 dan Gambar 15.
Tabel 11. Hasil Absorbansi Ekstrak Astasantin dari Perlakuan Rasio Pelarut

Rasio

Volume

Tepung Kulit Udang :

Pelarut

Absorbansi

Pelarut
1:8
1:9

(mL)
40
45

2,882
2,582

Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak Astasantin

3
2.9

2.88

2.8
2.7 Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak
Grafik Rasio
Absorbansi
Astasantin
2.6

2.58

2.5
2.4
40 mL aseton

45 mL aseton
Volume Pelarut Aseton

Gambar 15. Grafik Rasio Pelarut Aseton terhadap Nilai Absorbansi Ekstrak
Astasantin. Sumbu X merupakan volume pelarut aseton. Sumbu Y
merupakan nilai absorbansi dalam satuan nm.

Nilai absorbansi maksimum dari grafik rasio pelarut ditunjukkan

pada rasio 1:8 dimana, 5 gram tepung kulit udang dimaserasi
dengan 40 mL pelarut aseton. Hal ini sesuai dengan hukum LambertBeer terhadap persamaan molaritas, dimana nilai absobansi akan
berbanding terbalik dengan volume suatu larutan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer dapat diketahui bahwa nilai
absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi dan nilai
konsentrasi pada persamaan molaritas akan berbanding terbalik
dengan volume pelarut yang digunakan. Jika ditarik kesimpulan
maka nilai absorbansi pun akan berbanding terbalik dengan volume
pelarut, sehingga jika volume pelarut semakin kecil nilai absorbansi
akan semakin besar.
Hasil yang didapatkan dari pengaruh waktu maserasi dan rasio
volume aseton terhadap nilai absorbansi ekstrak Astasantin ialah,

nilai panjang gelombang pengukuran absorbansi ekstrak sesuai

dengan panjang gelombang ekstraksi Astasantin dengan pelarut
petroleum eter. Pada penelitian optimasi waktu maserasi, didapatkan
waktu maserasi yang menghasilkan nilai absorbansi tertinggi ialah
selama 5 hari. Selanjutnya pada penelitian optimasi rasio pelarut
untuk ekstraksi Astasantin, didapatkan bahawa rasio 1:8 (5 gram
Astasantin dilarutkan pada 40 mL aseton) merupakan rasio yang
dapat menghasilkan nilai absorbansi tertinggi.

4.6. Karakterisasi Ekstrak dengan FTIR

Karakterisasi
menggunakan

ekstrak

Astasantin

spektrofotometer

infra

dilakukan

merah,

dengan

sehingga

dapat

diketahui gugus fungsi yang terdapat pada ekstrak. Hasil yang

didapat dari pengukuran panjang gelombang maksimum pada
spektrofotometri UV-Vis didukung dengan spektra FTIR yang
ditunjukkan pada Lampiran 10. Interpretasi gugus fungsi yang
tedapat pada ekstrak disajikan pada Tabel 12.
Tabel 12. Interpretasi Spektra FTIR

Bilangan
No

Gelomban
g (cm-1)

Range

Intensitas

(cm-1)

Referensi

Vibrasi Referensi

Uluran O-H dari

1

3369,64

3750-3000

Sedang-kuat

ikatan hidrogen
intermolekuler
Uluran C-H asimetris

2924,09

2955-2935

Sedang-kuat

dari alifatik jenuh

dan rantai samping
aromatik

1712,79

1900-1650

Lemah

Uluran C=O

1620,21

1665-1630

Lemah-

Uluran C=C dari

sedang
5

1463,97

1377,17

alkena
Lentur C-H

1475-1300

Sedang

1220,94

1300-1200

Lemah

1170,79

1115-1090

Sedang-kuat

1049,28

1060-1020

Kuat

10

960,55

11

916,19

1000-650

Lemah

12

840,96

Lentur C-H
Tekuk C-H
Goyangan C=C dari
alkena
Uluran C-O dari
alkohol
Tekukan CH kibasan
dari CH=CH2

Hasil analisis pola serapan FTIR yang didapatkan dari

penelitian ini menunjukkan adanya uluran O-H dari ikatan hidrogen
intermolekuler pada daerah panjang gelombang 3369,64 cm -1.
Vibrasi ulur C-H asimetris dari aromatik CH 3 memberikan serapan
pada

bilangan

gelombang

2924,09

cm -1.

Vibrasi

ulur

C=O

ditunjukkan dengan adanya serapan pada 1712,79 cm -1 dan vibrasi

ulur C=C dari alkena ditunjukkan oleh serapan pada daerah 1620,21
cm-1.
Adanya serapan sedang pada bilangan gelombang 1463,97
dan 1377,17 cm-1 akibat dari vibrasi lentur C-H dan serapan lemah
pada bilangan gelombang 1220,94 cm -1 merupakan akibat dari
vibrasi tekuk

C-H. Sedangkan serapan sedang-kuat pada bilangan

gelombang 1170,79 cm-1 merupakan akibat dari vibrasi uluran C=C

dari alkena. Serapan kuat pada bilangan gelombang 1049,28 cm -1
merupakan akibat dari vibrasi uluran C-O dari alkohol dan serapan
lemah ditunjukkan pada bilangan gelombang 960,55; 916,19; dan
840,96 merupakan vibrasi tekukan CH kibasan dari CH=CH 2 .

Berdasarkan hasil pengamatan spektra FTIR dapat diketahui

bahwa gugus fungsi yang terdapat pada ekstrak adalah gugus O-H
dari ikatan hidrogen intermolekuler, C-H dari alifatik CH 3, CH simetris
dari CH2, C=C dari alkena, CH2, C-O dari alkohol. Hasil yang
didapatkan ini sesuai dengan komponen penyusun Astasantin dan
dengan spektrum infra merah Astasantin yang dipaparkan oleh
Widmer et al. (1981).
4.7. Penentuan Konsentrasi Ekstrak dengan KCKT
Tahap penelitian selanjutnya ialah pengujian konsentrasi
ekstrak Astasantin yang telah didapat dengan menggunakan
instrumen kromatografi cair kinerja tinggi. Pengujian konsentrasi
ekstrak

Astasantin

dengan

instrumen

KCKT

dilakukan

di

Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan Badan

Penelitian

Pengembangan

Kelautan

dan

Perikanan,

Kementerian Kelautan dan Perikanan.

Hasil yang didapatkan di lampirkan pada Lampiran 12 dan
Lampiran 13. Berdasarkan grafik didapatkan puncak standar dan
puncak sampel yang muncul pada panjang gelombang 460 nm.
Panjang gelombang yang dihasilkan sesuai dengan kisaran panjang
gelombang ekstrak Astasantin dengan pelarut petroleum eter.
Berdasarkan hasil yang didapat, puncak standar muncul pada
menit ke 13,624, dengan luas area sebesar 29,080. Sedangkan
puncak sampel muncul pada menit ke 13,280 dengan luas area
sebesar 29,080.
Berdasarkan perhitungan konsentrasi ekstrak Astasantin yang
terlampir pada Lampiran 14, diketahui bahwa besar konsentrasi
sampel (ekstrak Astasantin) yaitu sebesar 7,466 0,05 ppm. Hal ini
disebabkan nilai luas area puncak standar standar lebih besar
daripada luas area puncak sampel.

4.8. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH

Terhadap ekstrak Astasantin yang telah didapat, selanjutnya
dilakukan uji antioksidan menggunakan metode penangkapan radikal
DPPH. Pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian
Bioteknologi-LIPI. Nilai Inhibisi terhadap konsentrasi pada uji
antioksidan dapat dilihat pada Tabel 13.
Tabel 13. Nilai Inhibisi terhadap Konsentrasi pada Uji Antioksidan

Nama
Sampel

0,798

Inhibisi
(%)
0,125

10

0,786

1,690

25

0,779

2,503

50

0,770

3,630

C
(ppm)

Sampel

100
3
6
Vitamin C
9
14
15
Keterangan : C (ppm)

0,677
15,332
0,480
39,987
0,264
66,959
0,042
94,806
0,035
95,620
0,029
96,370
= konsentrasi (ppm)
= absorbansi rata-rata

Berdasarkan data yang diperoleh pada Tabel 13 terlihat jika

konsentrasi meningkat maka nilai absorbansi akan semakin rendah.
Absorbansi yang rendah dari campuran reaksi mengindikasikan
penangkapan aktivitas radikal yang tinggi (Gulcin, 2003). Penurunan
nilai absorbansi terjadi karena adanya donasi atom hidrogen dari
sampel ke DPPH (reduksi DPPH). Donasi proton ini membuat DPPH
yang bersifat radikal tereduksi menjadi 1,1difenil-2-pikrilhidrazin yang
bersifat non radikal. Sedangkan sampel yang bereaksi dengan

radikal DPPH diubah menjadi suatu senyawa baru yang bersifat

stabil.
Terlihat pula pada Tabel 13 hubungan antara konsentrasi
dengan nilai inhibisi ialah berbanding lurus. Semakin besar
konsentrasi sampel yang ditambahkan maka semakin besar nilai
inhibisinya pula. Pada Tabel 13, terlihat bahwa larutan kontrol positif
asam askorbat memiliki nilai inhibisi (aktivitas antioksidan) yang
tinggi, sedangkan pada sampel yang diujikan, ekstrak Astasantin
memiliki aktivitas antioksidan yang kurang baik. Aktivitas antioksidan
merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak, untuk
menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen
penghambatan.
Parameter

yang

dipakai

untuk

menunjukkan

aktivitas

antioksidan adalah dengan menentukan harga IC50. Harga IC50 telah

ditentukan

dari

merupakan

penelitian

konsentrasi

ini.

IC 50

(Inhibition

suatu

zat

antioksidan

Concentration)
yang

dapat

menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikalnya. Zat yang

mempunyai aktivitas antioksidan tinggi, akan mempunyai harga IC 50
yang rendah (Brand-Williams et al., 1995). Nilai IC50 dapat digunakan
untuk menyimpulkan seberapa besar sampel berpotensi sebagai
antioksidan. Range terkait kuat atau lemahnya potensi antioksidan
berdasarkan nilai IC50 terangkum pada tabel kisaran kekuatan
potensi antioksidan berikut :
Tabel 14. Kisaran Kekuatan Potensi Antioksidan (Brand-Williams et al., 1995)

Kisaran nilai IC50

Kekuatan potensi antioksidan

< 50

Sangat Kuat Berpotensi

50 100

Kuat

100 150

Sedang

150 200

Lemah

>200

Tidak Berpotensi

Penentuan harga IC50 dapat dilakukan dengan mencari

persamaan

regresi

hubungan

persentase

inhibisi

dengan

konsentrasi. Persamaan regresi sampel dan kontrol dapat dilihat

pada Gambar 16 berikut ini :

Grafik Hubungan Inhibisi dengan Ko

18.000
16.000
14.000 Inhibisi dengan Konsentrasi pada Me
Grafik Hubungan
f(x) = 0.15x - 1.08
12.000
R = 0.92
10.000
Inhibisi (%)
8.000
6.000
4.000
3.630
Linear (Grafik Hubungan Inhibisi dengan
2.503 Konsentrasi p
2.000
1.690
0.125
0.000
0
10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (ppm)

52

(a)
(b)
Gambar 16. Grafik Hubungan Inhibisi dengan Konsentrasi pada Metode DPPH. (a)
Kontrol Positif (Vitamin C), (b) Ekstrak Astasantin; Sumbu X merupakan
konsentrasi ekstrak Astasantin dalam satuan ppm. Sumbu Y merupakan
nilai inhibisi dalam satuan %.

Berdasarkan persamaan regresi dari Gambar 16 dapat

diketahui nilai IC50 dari larutan kontrol dan ekstrak Astasantin. Nilai
IC50 ini diketahui dengan cara menetapkan nilai 50 pada Y, sehingga
x (nilai IC50) akan didapatkan. Adapun data untuk mendapatkan nilai
IC50 dan perhitungan nilai IC 50 telah disajikan pada Lampiran 15,
Lampiran 16 dan Lampiran 17.
Pada larutan kontrol asam askorbat nilai IC 50 yang didapat yaitu
sebesar 2,797 ppm. Hal ini membuktikan bahwa larutan asam
askorbat memiliki potensi yang sangat kuat sebagai antioksidan.
Dilihat dari nilai IC50 yang didapat < 50 yaitu 2,797 dengan kata lain,
asam askorbat dikatakan sangat aktif sebagai antioksidan karena
hanya memerlukan konsentrasi sebesar 2,797 ppm untuk mampu
meredam 50% radikal bebas (Darmanto, 2005). Vitamin C memiliki
aktivitas antioksidan yang cukup tinggi karena vitamin C memiliki 4
gugus hidroksil. Menurut May (1999) vitamin C sebagai antioksidan
dapat memberikan satu atau dua elektronnya untuk menstabilkan
radikal bebas.
Selanjutnya dari grafik hubungan persentase inhibisi dengan
konsentrasi pada ekstrak Astasantin, didapatkan nilai IC 50 sebesar
338,500 ppm. Nilai IC50 pada senyawa Astasantin menunjukkan
bahwa Astasantin tidak berpotensi sebagai antioksidan jika ditinjau
dari pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Hal ini
dapat dikarenakan ikatan ganda terkonjugasi Astasantin yang tidak
mampu mempengaruhi kation radikal dari senyawa DPPH, sehingga
tidak terjadi interaksi penyumbangan proton atau elektron kepada
radikal DPPH atau dengan kata lain tidak terjadi reduksi radikal

DPPH menjadi DPPH-H. Menurut Sowmya dan Sachindra (2012)

Astasantin dapat menangkap radikal bebas dengan baik jika
pengujian antioksidan dilakukan dengan metode ABTS radicalscavenging assay. Uji aktivitas antioksidan Astasantin juga baik
dilakukan dengan menggunakan metode bleaching terhadap karoten, dimana pada metode tersebut -karoten akan mengalami
destruksi oleh produk degradasi asam linoleat (Saleha, 2009).
Namun nilai IC50 yang didapatkan pada pengujian antioksidan
dengan metode Astasantin ini lebih baik dari penelitian Hartono
(2011), dimana nilai IC50 terbaik yang didapatkannya mencapai 2.963
ppm. Hal tersebut dikarenakan pemilihan pelarut yang tepat juga
sangat penting. Pada penelitian Hartono (2011) digunakan pelarut
untuk maserasi adalah n-heksana, isopropanol, dan campuran
keduanya, sedangkan pada penelitian ini digunakan pelarut aseton.
Pemilihan pelarut aseton dikarenakan hasil ekstrak yang didapat
merupakan

Astasantin

dalam

bentuk

bebas.

Ketidakstabilan

Astasantin bebas terhadap cahaya, oksigen, kadar asam, dan suhu

tinggi membuat Astasantin bebas ini mudah teroksidasi, degradasi,
dan isomerisasi, sehingga kemampuan Astasantin bebas sebagai
antioksidan dalam menangkap radikal bebas semakin meningkat
(Storebakken, 2004).

BAB V
KESIMPULAN dan SARAN
5.1. Kesimpulan
Pada

penelitian

ini

telah

dilakukan

ekstraksi,

pemurnian,

karakterisasi, pengujian konsentrasi dan uji antioksidan ekstrak Astasantin

dari tepung kulit udang. Pada proses ekstraksi ditentukan waktu maserasi
dan rasio perbandingan tepung kulit udang dengan pelarut yang tepat,

perlakuan tersebut supaya didapatkan ekstrak dalam jumlah banyak.

Berdasarkan hasil penelitian, untuk mendapatkan ekstrak Astasantin
terbanyak proses maserasi dilakukan selama 5 hari, dengan rasio
perbandingan tepung kulit udang dan pelarut aseton sebanyak 1:8, yaitu 5
gram tepung kulit udang dimaserasi dengan 40 mL aseton. Parameter
banyak atau sedikitnya ekstrak yang didapatkan berdasarkan pengukuran
absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang
maksimum yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebesar 468 nm.
Panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelombang untuk
ekstrak Astasantin dengan pelarut petroleum eter. Ekstrak yang
didapatkan kemudian dikarakterisasi dengan spektrofotometer infra
merah. Bilangan gelombang yang didapatkan dari spektra infra merah
diantaranya 3369,64 cm-1, 2924,09 cm-1, 1712,79 cm-1, dan 1620,21 cm-1.
Bilangan gelombang tersebut menunjukkan bahwa gugus fungsi yang
terdapat pada ekstrak merupakan gugus fungsi senyawa Astasantin.
Selanjutnya konsentrasi ekstrak Astasantin diukur menggunakan KCKT
dan didapatkan konsentrasi ekstrak sebesar 7,466 0,05 ppm. Ekstrak
Astasantin kemudian diuji aktivitas antioksidannya menggunakan metode
DPPH dan didapatkan nilai IC50 sebesar 338,500 ppm. Nilai IC50 ini
menunjukkan bahwa Astasantin kurang efektif dalam mengikat radikal bebas
56
berupa DPPH, karena tidak terjadi reduksi radikal DPPH menjadi DPPH-H.
5.2. Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengujian aktivitas
antioksidan ekstrak Astasantin dari tepung kulit udang menggunakan
pelarut aseton. Adapun pengujian aktivitas antioksidan yang disarankan
antara lain dengan menggunakan metode ABTS radical scavenging
assay, Singlet oxygen quenching, dan Reducing activity.
DAFTAR PUSTAKA

Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisa Bahan Makanan.

Yogyakarta : Andi.
Anonim.
2013.

Soxhlet

extractor.

http://en.wikipedia.org/wiki/Soxhlet_extractor. (Diakses pada tanggal

23 November 2013, pukul 13.12 WIB).
Anonim.
2004.
UV
Visible
Absorption

Spectroscopy.

http://faculty.sdmiramar.edu/fgarces/LabMatters/Instruments/UV_Vis/
Cary50.htm. (Diakses pada tanggal 14 Desember 2013, pukul 02.19
WIB).
Arab, L., S. Steck-Scott and P. Bowen. 2001. Partisipation of Lycopen and
Betacarotene in Carcinogenesis: Defenders, Aggresors, or Passive
Bystanders. Epidemiologic Reviews, Vol 23. No 2, p.221-229
Arifin, Z., Adiwijaya, D., Komaruddin, U., dan Susanto, A. 2007.
Penerapan Best Management Practises (BMP) pada Budidaya
Udang Windu. Jepara : Departemen Kelautan dan Perikanan
Direktorat Jendral Perikanan Budidaya Balai Besar Pengembang
Budidaya Air Payau.
Astawan, M., Kasih, L.A. 2008. Khasiat Warna-Warni Makanan.
Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama.
Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., Berset C. 1995. Use of Free Radical
Method

to

Evaluate

Antioxidant

Activity,

cit.

Journal

of

Pharmacheutical 3: 96-105.
Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H. 1995. Carotenoids Volume IA:
Isolation and Analysis. Birkhauser Verlag. Berlin p: 211.
Britton, G, Jensen, S.L., and Pfander, H. 1995. Carotenoids Volume
IB:Spectroscopy. Birkhauser Verlag. Berlin p: 211.
Darmanto, W. 2005. Pemanfaatan Polysaccharide Krestine (PSK) dalam
Menurunkan Radikal Bebas pada Darah Mencit Akibat Induksi 2Methoxyethanol. Jurnal ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 96-102.
Day, R. A. dan A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi
Keenam. Jakarta: Erlangga.

DeMan,

John.

1997.

Kimia

Makanan

Edisi

Kedua.

Penerjemah

Padmawinata, K. Bandung : ITB Press.

Departemen Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia. 2006. Industri
Kitin: Dari Limbah Menjadi Bernilai Tambah, Jakarta.
Dinda. 2008. Ekstraksi. http://www.medicafarma.com/ekstraksi (Diakses
pada tanggal 5 November 2013, pukul 21:05 WIB).
E. Efstathiou, C. 2000. Countercurrent Extraction - Craig Apparatus.
http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletCraig/Appl_Craig2.html.
(Diakses pada tanggal 9 Desember 2013, pukul 23:00 WIB).
Erdawati. 2011. Bahan Ajar Kimia Analitik. Jakarta : UNJ.
Giwangkara,

E.G.

2007.

Spektrofotometri

http://persembahanku.

Infra

Merah.

Word

press

.com/2007/06/26/spektrofotometri-infra-merah/.

(Diakses

pada

tanggal 5 Juni 2014, pukul 23:00 WIB).

Gordon, M.H. 1990. The Mechanism of Antioxidants Action In Vitro. Di
dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidants. Elsivier Applied
Science, London.
Gross,

Jeana.

1991.

Pigments

In

Vegetables

(Chlorophylls

and

Carotenoids). Van Nostrand Reinhold. New York. 7: 75.

Gulcin, I. 2003. Antioxidant and Analgesic Activities of Turpentine of Pinus
nigra

arn.

Subsp.

Pallsiana

(Lamb.)

Holmboe.

Journal

of

Ethnopharmacology 86: 51-58.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Edisi kedua. Bandung: ITB.
Hartono,

Gary.

2011.

Karakterisasi

Aktivitas

Antioksidan

Ekstrak

Karotenoid dari Cangkang Udang Windu (Peneaus monodon Fab.).

Karawaci : Universitas Pelita Harapan.
Hayati, E.K. 2007. Buku Ajar Dasar-Dasar Analisis Spektroskopi. Malang :
Universitas Negeri Malang. Hal:39.
Hendry, G.A.F., Houghton, J.D. 1996. Natural Food Colorants 2nd Edition.
London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras
Blackie Academic & Professional.

Houghton, PJ dan Raman, A. 1998. Laboratory Handbook for The

Fractination of Natural Extract : Methods of Extraction and Sample
Clean-up. London : Chapman and Hall Ltd.
Hbshmann, Joachim. 2009. Handbook of GC/MS. WILEY-VCH Verlag
GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Hugh, M. A. dan V. J. Krukonis. 1986. Supercritical Fluid Extraction :
Principles and Practisce. Buster Worth Publischers, Stochom. USA.
Khanafari,

A.,

Saberi,

A.,

Azar,

M.,

Vosooghi,

Gh.

Jamili,Sh.,

Sabbaghzadeh. 2007. Extraction of Astaxanthin Esters From Shrimp

Waste By Chemical and microbial Methods. Iranian Journal of
Environment, Health, and Science Engineering. 4 (2) : 93-98.
Kochar, S.P. and B. Rossell. 1990. Detection Estimation and Evaluation of
Antioxidants in Food System. di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food
Antioxidants. Elvisier Applied Science. London.
Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida dan Alkaloida.
Sumut: USU Respository.
http://librarv.usu.ac.id/downloadfimipa/06003488.pdf

senyawa.

(Diakses pada tanggal akses 5 November 2013, pukul 20.30 WIB).

Manjang, Y. 1993. Analisa Ekstrak Berbagai Jenis Kulit Udang Terhadap
Mutu Khitosan. Jurnal Penelitian Andalas. 12 (V) :138-143.
Meija, E.A., E. Hudson, E. Gonzalez., D. Meijia., dan F. Vazque. 1988.
Carotenoid Contents and Vitamin A Activity of Some Common
Cultivars of Mexican Peppers as Determined by HPLC. Journal of
Food Science. 53 : 1448-1451.
Molyneux, P. 2004. The Use of Stable Free Radicals Diphenylpirylhydrazyl
(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin Journal of
Science Technology. 26 : 211-219.
Mulja, M.H., 1995. Analisis Instrumental. Surabaya : Airlangga University
Press.

Naguib, M. A., 2000. Antioxidant Activities of Astaxanthin and Related

Carotenoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 : 11501154.
May, J. M. 1999. In Ascorbic Acid An Antioxidant For The Plasma
Membrane. Faseb Journal. Vol. 13. Hal. 995-1006.
Mezzomo, N., J. Martnez, S.R.S. Ferreira, J. 2009. Supercritical Fluids 51
(1) 10.
Mezzomo, Natlia., Maestri, Bianca., Dos, Santos, R.L. 2011. Pink shrimp
(P. brasiliensis and P. paulensis) residue: Influence of extraction
method on carotenoid concentration. Science Direct Journal of
Talanta. 85 :1383-1391.
Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A
and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga
University Press, Surabaya.
No, H.K., Meyers, S.P.,Lee, K.S. 1989. Crawfish Chitosan as Coagulant in
Recovery of Organic Compounds from Seafood Processing Streams,
Jounal of Agricultural and Food Chemistry. 37 : 575-579
Nur, M. A. dan Adijuwana, H. A. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis
Biologi. Bogor : Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat IPB.
Palmer, MV and Ting, SS. 1995. Application for Supercritical Fluid
Technology in Food Processing. Food Chemistry. 52 : 345-352.
Palozza P, Krinsky NI. 1992. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and
in vitro: An overview. Meth Enzymol. 213 : 403-420.
Perdigo N.B., F.C. Vasconcelos, I.H.A. Cintra, M. Ogawa. 1995. Boletim
Tcnico Cientfico da CEPENE. 3 (1) 234.
Pratt, D.E. 1992. Natural Antioxidants from Plant Material. di dalam : M.T.
Huang, C.T. Ho, clan C.Y. Lee, editor. Phenolic Compounds in Food
and Their Effects on Health H. American Society, Washington DC.
Pu, J. 2008. Development of Stable Microencapsulated Astaxanthin
Powders Using Extracted Astaxanthin from Crawfish and Shrimp By

Products. Jiangnan : A Thesis From Departement of Food Science

Jiangnan University.
Pu, Jing. 2011. Optimization of Purification Conditions of Radish
(Raphanus Sativus L.) Anthocyanin-Rich Extracts Using Chitosan.
Science Direct Journal of LWT - Food Science and Technology. 44 :
2097-2103.
Rodriguez-Amaya DB & Kimura M. 2004. HarvestPlus Handbook for
Carotenoid Analysis. International Food Policy Research Institute,
Washington DC.
Saleha, S. dan Murniana. 2009. Aktivitas Antioksidan Astaxanthin dari
Limbah Kulit Udang. Aceh : Universitas Syiah Kuala.
Sachindra, N. M., Bhaskar, N., Mahendrakar, N. S. 2006. Recovery of
Carotenoid from Shrimp Waste in Organic Solvents. Science-Direct
Journal of Waste Management. 26 : 1092-1098.
Schwartz, S.J. 1994. Pigment Analysis. Introduction to the Chemical
Analysis of Foods. Boston : Jones and Bartlet.
Sitorus, Marham. 2010. Kimia Organik Umum. Yogyakarta : Graha Ilmu.
Sowmya, R. dan Sachindra, N. M. 2012. Evaluation of antioxidant activity
of carotenoid extract from shrimp processing byproduct by in vitro
assays and in membrane model system. Science Direct Journal of
Food Chemistry. 134 : 308-314.
Stahl, W., Sies, H. 2003. Antioxidant Activity of Carotenoids. Molecular
Asfects of Medicine. 24 : 345-351.
T. Storebakken, M. Sorensen, B. Bjerkeng, J. Harris, P. Monahan, H.
Stephen. 2004. Aquaculture. 231489
Widmer, E. Widmer,E., Zell,R., Lukc,T., Casadei,M.,S chnholzer,P., dan
Broger,E.A.

1981.

Technische

Verfahren

zur

Synthese

von

Carotinoiden und verwandten Verbindungen aus Oxo-isophoron. I.

Modifizierung der Kienzle-Mayer-Synthese von (3S,3'S)-Astaxanthin.
Jurnal Helv. Chim. Acta. 64 :2405-2418

Winarno F.G., Fardiaz S., Fardiaz D. 1973. Ekstraksi, Kromatografi, dan

Elektroforesis. Bogor : Fakultas Mekanisasi dan Teknologi Pertanian.
Yan, X., Chuda, Y., Suzuki, M., Nagata, T. 1999. Fucoxanthin as The
Major Antioxidant in Hijikia fusiformis, a Common Edible Seaweed.
Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 : 605-607.
Zeb, Alam dan Mehmood, Sultan. 2004. Carotenoid Contents from
Various Sources and Their Potential Helth Applications. Pakistan
Journal of Nutrition. 3 (3) : 199-204.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Pembuatan Tepung Kulit Udang

Kulit Kepala dan Kulit udang yang telah dicuci

Dikukus selama 10 menit pada suhu 100C.
Dikeringkan hingga didapat massa yang stabil.
Digiling sampai menjadi tepung.

Tepung Kulit Udang

64

65
Lampiran 2. Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Waktu Optimum)

5 gr tepung kulit udang

Dicampur dengan 50 mL aseton
Dimaserasi selama 3 hari pada suhu ruang
5 gr tepung kulit udang
Ekstrak Astasantin
Dicampurkan dengan 40 mL aseton
Dimaserasi pada waktu optimum
Dimurnikan dengan petroleum eter dalam corong pisah
Ditambahkan dengan NaCl 1 %
Diekstraksi
kembali dan ditampung fasa organik
Ekstrak
Astasantin
Dimurnikan dengan petroleum eter dalam corong pisah
Ditambahkan dengan NaCl 1 %
Diekstraksi kembali dan ditampung fasa organik
Fasa Organik

Ditambahkan Na2SO4 anhidrat

Fasa Organik
Disaring dan filtrat ditampung
Filtrat fasa Organik
Ditambahkan Na2SO4 anhidrat
Disaring dan filtrat ditampung
Dialirkan gas nitrogen selama 5 menit
fasa Organik
Dipekatkan denganFiltrat
menggunakan
rotary evaporator pada suhu 40o C
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum dengan menggunakan spektrofotometer.
Dialirkan
gas nitrogen
selama
5 menit
* Proses ekstraksi
diulangi
dengan
waktu maserasi selama 5 dan 7 hari.
Dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40o C
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum dengan menggunakan spektrofotometer.
* Proses ekstraksi diulangi dengan volume aseton 45 mL

Lampiran 3. Bagan ekstraksi Astasantin (Penentuan Rasio

66
Pelarut Optimum)

Lampiran 4. Bagan Karakterisasi Ekstrak Astasantin

dengan Spektrofotometer Infra Merah

Secuplikan larutan ekstrak Astasantin

Dilihat spektrumnya dengan spektrofotometer infra merah pada bilangan gelombang 750-4000 cm-1

Spektrum Infra Merah Ekstrak Astasantin

67

Lampiran 5. Bagan Pengujian Konsentrasi Ekstrak Astasantin dengan

KCKT

Secuplikan ekstrak Astasantin

Dioven pada suhu 30oC

Diencerkan dengan 1 mL n-heksana.
Dihomogenisasi dengan homogeniser selama 5 menit.

Ekstrak Astasantin yang telah dihomogenisasi

Diambil 5 L ekstrak Astasantin dan diukur kadar Astasantin menggunakan KCKT

68 pada suhu 40C.

Lampiran 6. Bagan Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM Uji

Aktivitas Antioksidan

7,9mgDPPH
Dilarutkandenganmetanolproanalisis hingga 50 mL.
Ditempatkandalambotolgelap.
Untuksetiappengujianlarutandibuatbaru
Larutan DPPH

69

Lampiran 7. Bagan Pembuatan Larutan Blanko Uji Aktivitas

Antioksidan

1mLlarutanDPPH1mM
Dipipetkedalamtabung
reaksi yang telah ditara 5 mL
5 mg ekstrak
Ditambahkanmetanolproanalisishingga tanda batas dan dihomogenkan
Muluttabung
Dilarutkan
ditutupdenganaluminiumfoil
kedalam 5,0 mL metanol proanalisis

70

Larutan Induk
Larutan Blanko

Dipipet
ke dalam Lampiran
5 buah tabung
reaksi Pembuatan
yang telah ditara
5 mL

8. Bagan
Larutan
Ujisebanyak
Aktivitas50,100,250,500 dan 1000
Ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH
Antioksidan
Ditambahkan dengan
metanol pro analisis sampai 5 mL.
Dihomogenkan

5 L/mL

10 L/mL

25 L/mL

50 L/mL

100 L/mL

Mulut tabung ditutup dengan alumunium foil

Diinkubasi dalam penangas air 37oC selama 30 menit

Larutan Uji

Diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum (kisaran 500-530 nm) dengan menggunakan spektrofotome


71

Lampiran 9. Pembuatan Larutan Kontrol Uji Aktivitas Antioksidan

3 mg vitamin C
Dilarutkan kedalam 5,0 mL metanol proanalisis

Larutan Induk

Dipipet ke dalam 5 buah tabung reaksi yang telah ditara 5 mL sebanyak 250,200,150,100 dan 500 L
Ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH
Ditambahkan dengan metanol pro analisis sampai 5 mL.

Dihomogenkan

14 L/mL

15 L/mL

9 L/mL

6 L/mL

3 L/mL

Larutan Kontrol

Diukur absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum (kisaran 500-530
nm)
dengan
menggunakan
spektrofotometer cahaya tampak.

Lampiran 10. Spektra Infra Merah Hasil Ekstrak Astasantin

1712.79

1620.21

1463.97

1377.17

1220.94
1170.79

1049.28

960.55
916.19
840.96

100

2924.09

%T

80

60

40

20

3369.64

73

Lampiran 11. Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi Untuk Standar Astasantin

mAU
445nm
450nm
8.0 455nm
460nm
7.5 465nm
470nm
475nm
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
13.4

13.5

13.6

13.7

13.8

min

mAU
250

13.624/29080

200
150
100
50
0
-50
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

min

Puncak standar pada menit ke-13,624; dengan luas area sebesar

74
29,080 pada panjang gelombang 460 nm.

Lampiran 12. Hasil Analisis Puncak Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi untuk Ekstrak Astasantin
mAU
30
25
20
15
13.280/52582

10
5
0
-5
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

min

Puncak sampel pada menit ke-13,280; dengan luas area sebesar

52,582 pada panjang gelombang 460 nm

mAU
445nm
5.5 450nm
455nm
5.0 460nm
465nm
4.5 470nm
475nm
4.0
3.5
3.0
2.5
13.25

13.50

13.75

14.00

min

Lampiran 13. Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Astasantin

dengan KCKT

Diketahui

Konsentrasi standar Astasantin

: 13,5 ppm

Luas area puncak standar

: 52,582

Luas area puncak sampel (ekstrak Astasantin) : 29,080

Ditanya

Berapa besar konsentrasi sampel (ekstrak Astasantin) yang

didapatkan?

Jawab


Faktor respon

Luas area puncak standar

konsentrasi standar

Faktor respon

52,582
13,5 ppm

Faktor respon

= 3,895 ppm-1

Konsentrasi sampel (ppm) =

Luas area puncak sampel

Faktor respon

Konsentrasi sampel (ppm) =

29,080
3,895 ppm

Konsentrasi sampel (ppm) = 7,466 ppm

76

Lampiran 14. Hasil Uji Antioksidan pada ekstrak Astasantin dengan

DPPH

N
a
m
a
S
a
m
p
el

A1

A2

n
o

0,7

0,7

0,

10

0,7

0,7

0,

I
n
h
i
b
i
s
i
(

0
,
1
2
5

1
,
6

,
9

%)

pe
l

a
k

(p

S
a

A
B

I
C50
(
p
p
m
)

3
3
8
,
5
0
0

9
0

25

50

10

0,7

0,7

0,7

0,7

0,6

0,6

2
,
5
0
3

3
,
6
3
0

0,

0,

0,

3
3

Vi
ta
mi

0,5

0,4

2
3
9

0,

0,2

0,2

7
6
6

0,

9
5

0,0

0,0

0,

9
9
4
,

2
,
7
9
7

8
0

14

0,0

0,0

6
9
5

0,

6
2

15

0,0

0,0

0,

0
9
6
,
3
7
0

Keterangan :

C (ppm)

: konsentrasi (ppm)

A1

: absorbansi simplo

A2

: absorbansi duplo

: absorbansi rata-rata

IC50

: Inhibisi konsentrasi 50

77
7

Lampiran 15. Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada

Metode DPPH untuk Larutan Sampel Ekstrak Astasantin

Konsentrasi 5 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,798)
Inhibisi ( )=0,125
100
Inhibisi()=
0,799
Konsentrasi 10 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko

(0,7990,786)
Inhibisi ( )=1,690
100
0,799
Konsentrasi 25 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,779)
Inhibisi ( )=2,503
100
Inhibisi()=
0,799
Konsentrasi 50 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
( 0,7990,770 )
100
Inhibisi ( )=3,630
Inhibisi ( )=
0,799
Konsentrasi 100 ppm
(Serapan BlankoSerapan S ampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,677)
Inhibisi ( )=15,332
Inhibisi( )=
100
0,799

Inhibisi()=

Lampiran 16. Perhitungan Aktivitas Antioksidan pada

Metode DPPH untuk Larutan Kontrol Asam Askorbat

Konsentrasi 3 ppm
(Ser apan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,480)
100
Inhibisi ( )=39,987
Inhibisi()=
0,799
Konsentrasi 6 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,264)
Inhibisi ( )=66,959
100
Inhibisi()=
0,799
Konsentrasi 9 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,042)
100
Inhibisi ( )=94,806
Inhibisi()=
0,799
Konsentrasi 14 ppm

(Serapan BlankoSerapan Sampel)

100
Serapan blanko
( 0,7990,035 )
100
Inhibisi ( )=95,620
Inhibisi ( )=
0,799
Konsentrasi 15 ppm
(Serapan BlankoSerapan Sampel)
Inhibisi()=
100

Serapan blanko
(0,7990,029)
100
Inhibisi ( )=96,370
Inhibisi()=
0,799

Inhibisi()=

Lampiran 17. Perhitungan Nilai IC50 pada Metode DPPH

a. Ekstrak Astasantin
Persamaan regresi linier pada grafik : Y = 0,150x

50

= 0,150x

IC50

= 338,500

50
0,150

a. Vitamin C
Persamaan regresi linier pada grafik : Y = 4,353x

50

= 4,353x

IC50

= 2,797

50
4,353