Curcumin (diferulomethane) adalah senyawa yang diperoleh dari rimpang dari

tanaman Curcuma longa, yang merupakan rempah-rempah kunyit. Kurkumin banyak

digunakan sebagai pewarna dan penyedap, dan telah banyak diteliti untuk sifat anti-kanker.
Curcumin juga menunjukkan aktivitas anti-inflamasi, karena kemampuannya untuk
menghambat faktor transkripsi NF-B dan gen yang mengkode sitokin pro-inflamasi seperti
interleukin (IL) -12, interferon-, dan faktor- nekrosis tumor. Beberapa penelitian telah
menunjukkan curcumin berguna dalam pengobatan inflamasi.
Limfosit T penting untuk inisiasi dan patogenesis inflamasi, serta penolakan
transplantasi organ. Curcumin adalah inhibitor poten aktivasi, proliferasi, dan sintesis sitokin
limfosit T murin dan manusia. Efek penghambatan kurkumin pada limfosit T telah dikaitkan
dengan penurunan ekspresi sitokin dan molekul kostimulari oleh antigen-presenting sel
(APC) seperti makrofag dan sel dendritik yang diberi perlakuan dengan kurkumin.
IL-2 adalah sitokin yang sangat penting peranannya dalam proliferasi limfosit T.
Transduksi sinyal IL-2 melalui IL-2R melibatkan JAK1, JAK3, dan STAT5. STAT5 ada dua
isoform yaitu STAT5A dan STAT5B, yang keduanya diaktifkan oleh signaling IL-2R dan
memiliki beberapa fungsi yang sama di T-limfosit. Dalam rangka untuk menjelaskan efek
langsung dari kurkumin pada sinyal IL-2 di sel T, peneliti menggunakan antibodi monoklonal
(mAb) anti-CD3 dan antiCD28 sel T expander beads untuk mengaktifkan limfosit T CD4+
murni murin dalam tidak ada atau adanya kurkumin, dan dilakukan penilaian terhadap
proliferasi sel, ekspresi CD25, sintesis IL-2, serta transduksi sinyal IL-2R. IL-2 dependent sel
CTLL-2 digunakan untuk mengetahui pengaruh kurkumin pada signaling IL-2R. Peneliti juga
meneliti efek kurkumin pada sel T CD4+ dan CD8+ regulator sebagai fungsi penekan sel-T.
Metodologi
2.1 Tikus
Digunakan 6 tikus dengan usia 6-8 minggu
2.2 isolasi dan kultur sel T limfosit
Isolasi sel T dari limpa tikus menggunakan MACS mouse regulatory T-cell isolation kit.
Kemudian sel T dikultur pada suhu 37oC/5% CO2/ kelembapan 95% pada media RPMI 1640
yang ditambah 5% serum janin anak sapi yang diinaktivasi, 100 U/mL penisilin, 100g/mL
streptomisin, 2mM L-glutamine, dan 100mM HEPES. Sel CTLL-2 diperlakukan dengan 10%
FCS yang dilemahkan dan 50 U/mL IL-2 rekombinan.
2.3 proliferasi sel T
Sel T dirangsang dengan 10 ng/ml phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) dan ionomisin
2.5 viabilitas sel T (kemampuan hidup dari sel T)
Viabilitas sel T yang dipapar selama 18 jam dengan kurkumin ditentukan dengan pewarnaan
tripan blue. Pewarnaan sel dengan menggunakan larutan trypan blue bertujuan untuk
membedakan sel yang hidup dan yang mati. Sel yang mati akan terlihat berwarna biru, karena

mengalami lisis sehingga protein dalam plasmanya akan berikatan dengan trypan blue
sehingga sel menjadi berwarna biru. Selain itu, sel yang mati akan terlihat berwarna lebih
gelap dan bentuknya tidak bulat lagi atau menyusut karena isi sel (sitoplasmanya) keluar. Hal
ini tidak terjadi pada sel yang hidup karena tidak mengalami kerusakan pada membran
selnya, sehingga sel yang hidup masih terlihat berbentuk bulat, lebih terang dan jernih
(Djajanegara, 2009).
2.6 IL-2 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik
immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi atau mengetahui kuantitas atau kadar dari
suatu zat berdasarkan reaksi imunologis. Supernatan kultur sel diambil setelah 24 jam dan IL2 dihitung dengan metode ELISA
2.6. Western blotting
2.7 Analisis statistic
Dianalisis dengan metode statistika ANOVA satu jalur (perbandingan rata-rata populasi)
HASIL DAN DISKUSI
3.1 penghambatan IL-2 atau IL-2R pada sel T limfosit dengan kurkumin
Untuk mengetahui efek kurkumin pada aktivasi proliferasi sel T limfosit CD4+ tanpa
pengganggu dari fungsi APC, peneliti menstimulasi sel T limfosit CD4+ dengan T-cell
expander beads yang dilapisi dengan antibody monoklonal anti-CD3 dan anti CD-28
(pengaktivasi sel T) dan sintesis DNA yang menggunakan [3 H] thymidine untuk menghitung
proliferasi sel. Pada gambar 1 dosis kurkumin dan gambar 2 variabel waktu secara langsung
dapat menghambat efek sintesis DNA oleh sel T limfosit CD4+, sehingga proliferasi sel
berkurang pada konsentrasi 20M kurkumin. Pewarnaan trypan blue menunjukkan kurkumin
dengan konsentrasi tertinggi pada penelitian ini, tidak menyebabkan efek samping viabilitas
sel T (perlakuan dengan pembawa, viabilitasnya 89 8% ; dengan 20M kurkumin,
viabilitasnya 90 9%). Selanjutnya, sintesis IL-2 (Gambar 1C) dan ekspresi CD25 (Gambar
1D) keduanya menurun dengan sel T yang diberi kurkumin. Data kami menunjukkan bahwa
kurkumin menekan proliferasi sel T CD4+ pada respon TCR dan stimulasi CD28 dengan
menghambat sintesis IL-2 dan ekspresi IL-2R yang mempunyai afinitas tinggi.
3.2. Curcumin menghambat transduksi sinyal limfosit T CD4+
Reseptor sel T menghasilkan peristiwa fosforilasi yang mengakibatkan peningkatan Ca2 +
intraseluler dan aktivasi PKC. Stimulasi limfosit T dengan Ca2 + ionofor seperti ionomycin
dan PKC aktivator seperti PMA sering digunakan untuk meniru reseptor sinyal sel T sinyal.
Gambar 2A menunjukkan bahwa curcumin secara signifikan menghambat sintesis DNA oleh
limfosit T CD4+ yang dirangsang dengan PMA dan ionomycin, menunjukkan kurkumin
bekerja pada tirosin kinase protein yang memulai peristiwa paling awal di reseptor sinyal sel
T. Sebuah studi sebelumnya menunjukkan bahwa kurkumin menghambat aktivasi NF-B dan

translokasi nuclear subsequent di sel limpa yang dirangsang dengan mitogen sel T
Concanavalin A. Ketika aktivasi NF-B diperlukan, maka terjadi fosforilasi IBa dan
degradasi oleh IB kinase (IKK), kami menggunakan western blotting untuk menguji
pengaruh dari kurkumin pada fosforilasi IBa di limfosit T CD4+ yang dirangsang dengan T
cell expander beads. Gambar 2B menunjukkan bahwa paparan 10 M curcumin secara drastis
meurunkan fosforilasi IBa setelah rangsangan 15 menit pada T-limfosit. Oleh karena itu
kurkumin menghambat aktivasi NF-B di limfosit T CD4+ dengan mengganggu fosforilasi
IBa fosforilasi.
3.3 kurkumin menghambat signaling penggabungan IL-2R JAK3-JAK5 pada limfosit T
Untuk menentukan apakah curcumin juga mempengaruhi jalur sinyal IL-2R dalam limfosit T,
peneliti mengkultur IL-2-dependent CTLL-2 Tcells dengan tidak adanya atau kehadiran
kurkumin dan diukur sintesis DNA yang diinduksi IL-2 oleh [3H] TdR. Gambar 3
menunjukkan bahwa kurkumin menghambat sintesis DNA oleh sel CTLL-2 pada dosis
tertentu (gambar 3A) dan variable waktu tertentu (gambar 3B). Namun, kurkumin tidak
substansial mempengaruhi CTLL-2 ekspresi CD25 (Gambar. 3C), menunjukkan bahwa sel
CTLL-2 yang dipajan kurkumin dapat mempertahankan kapasitas untuk mengikat IL-2
melalui IL-2R yang afinitasnya tinggi. Peneliti berhipotesis bahwa kurkumin mungkin
mengganggu tranduksi sinyal IL-2R, yang terdiri dari aktivasi JAK1 dan JAK3 tirosin kinase,
diikuti oleh fosforilasi, dimerisasi, dan translokasi STAT5A / B ke nucleus.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3D, pajanan dengan kurkumin pada sel CTLL-2 dapat
menghambat fosforilasi IL-2 diinduksi dari STAT5A dan JAK3, tapi bukan JAK1. Aktivasi
JAK1 tidak penting untuk transduksi sinyal IL-2R. Selain itu, dalam penelitian ini
menunjukkan bahwa kurkumin menghambat aktivitas tyrosine kinase daripada mendorong
dan / atau mengaktifkan satu atau lebih protein tirosin fosfatase.

GAMBAR

Gambar 1 Kurkumin menekan proliferasi limfosit T CD4+ dan menghambat

ekspresi IL-2 dan CD25. Limfosit T CD4+ dirangsang dengan anti-CD3 dan anti
CD28 sel T expander beads dan dikultur (A) selama 72 jam dalam pelarut atau
pembawa DMSO saja atau penambahan kurkumin dengan konsentrasi tertentu
atau (B) selama waktu tertentu dalam pembawa saja atau penambahan 10 m
kurkumin. (C) supernatant kultur sel dikumpulkan setelah sel limfosit T CD4+
yang distimulasi oleh Tcell expander beads selama 24 jam dan IL-2 sintesis
ditentukan jumlahnya dengan ELISA. Data ditampilkan sebagai rata-rata pg / ml
SD. (D) limfosit T dikultur selama 24 jam dalam ketiadaan atau adanya T cell
expander beads tanpa atau dengan kurkumin. Sel lisat (hasil lisis) disiapkan dan
ekspresi CD25 ditentukan oleh Western blotting.

Gambar 2. Curcumin menghambat fosforilasi IBa. (A) CD4 + T-limfosit dirangsang dengan
PMA dan ionomycin (10 ng / ml) dan dikultur selama 48 jam dalam pembawa DMSO saja
atau dengan penambahan kurkumin. Data ditampilkan sebagai rata-rata cpm SD. (B)
limfosit T CD4+ dirangsang dengan mAb anti-CD3 dan anti-CD28 T cell expander beads
selama 15 atau 60 menit dalam pembawa DMSO saja atau penambahan 10 m kurkumin. Sel
lisat disiapkan dan fosforilasi IBa ditentukan oleh Western blotting.

Gambar 3 kurkumin memblok sinyal IL-2R pada sel CTLL-2 melalui penghambatan
fosforilasi STAT5A dan JAK3. Sel CTLL-2 dirangsang dengan IL-2 rekombinan tikus (50 U /

ml) dan dikultur (A) selama 96 jam dalam media saja, pembawa DMSO saja atau
penambahan kurkumin pada kosentrasi tertentu atau (B) selama waktu tertentu dalam
pembawa DMSO saja atau 10 m kurkumin. (C) sel CTLL-2 yang diperlakukan tersebut
ditunjukkan selama 24 jam dengan IL-2 rekombinan (50 U / ml) sebelum lisis. Jumlah
protein dikumpulkan dan jumlah yang sama dari protein dielektroforesis dan ditransfer ke
membran nitroselulosa. Membran diperiksa dengan mAb anti-CD25. (D) sel CTLL-2 h,
kendaraan (DMSO) saja, atau konsentrasi yang ditunjukkan kurkumin selama 30 menit. Selsel kemudian dirangsang dengan mouse rekombinan IL-2 (50 U / ml) selama 15 menit,
setelah itu lisat sel disiapkan. Fosforilasi STAT5A, JAK1, dan JAK3 ditentukan oleh blotting
barat. Blot itu kemudian ditelanjangi dan kembali diperiksa-total STAT5A dan ekspresi aktin
mengkonfirmasi sama protein pemuatan. Semua data adalah wakil dari setidaknya tiga
percobaan independen.