Kloning Gen

Kloning - definisi

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting

Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan;
kumpulan replika sebagian atau seluruh
makromolekul (contoh, DNA atau
antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel
somatik induknya serta memiliki
identitas genetik yang sama dengan
induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang
semua identitasnya sama dengan molekul
atau sel penurunnya

Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau
mengidentifikasi dan memperbanyak
suatu potongan DNA tertentu (klon) yang
dikehendaki dari campuran potonganpotongan DNA yang kompleks.

Kloning
Gen

Ketika keseluruhan
DNA dari suatu
organisme
diekstraksi, akan
diperoleh seluruh
gen yang dimiliki
organisme tersebut
Pada kloning gen,
hanya gen (DNA)
tertentu yang
diisolasi,
dimurnikan, dan
diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon
Gen
Menentukan urutan basa nukleotida

penyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi
urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim
yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi
pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan
tertentu, misalnya memproduksi insulin,
ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk

diklon

DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang
disintesis menggunakan mRNA
sebagai cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari
perbanyakan menggunakan PCR

Mensintesis cDNA

Perbanyakan DNA dengan

PCR (Polymerase Chain
Reaction)

Bahan / Alat untuk

Mengklon

Enzim endonuklease restriksi

Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam
sel inang

Memotong DNA

Menggunakan enzim
endonuklease restriksi

Ujung lengket (sticky

ends)
Ujung tumpul (blunt
ends)

Penamaan enzim

EcoRI
E = genus (Escherichia)
co = species (coli)
R = strain
I = # of enzyme

Ujung lengket dan

tumpul
(Blunt & Sticky ends)

Penyambungan (pasting)
DNA
Pembentukan

ikatan-H pada
ujung-ujung yang
komplemen (sticky
ends)

Ligase membentuk
ikatan fosfodiester
untuk merekatkan
benang-benang DNA

Vektor untuk
Mengklon

Diperlukan suatu wahana

(vehicle) untuk
memasukkan suatu
potongan DNA ke dalam sel
agar DNA tersebut dapat
disimpan dan diperbanyak
di dalam sel tersebut

Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal
DNA) yang secara alami dimiliki suatu
jasad
Bentuknya benang ganda (double strands
DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat
dibuat dengan menambahkan potonganpotongan DNA lain

Vektor untuk
Mengklon
Plasmid
dapat dimodifikasi untuk
mampu membawa potongan DNA lain
ke dalam sel bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi
(misalnya gen ketahanan terhadap
antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA
yang memiliki urutan basa nukleotida
yang menjadi sasaran enzim restriksi
tetapi tidak terletak di dalam daerah
replikator atau penanda

Plasmid yang Dimiliki oleh

Escherichia coli

Berasal dari plasmid alam

Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric

Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani,

makhluk dengan tubuh gabungan dari
bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid
menggunakan suatu enzim restriksi,
potongan DNA asing yang memiliki ujung
pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan
DNA asing disambung, akan dihasilkan
"plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi
dalam sel inang yang sesuai

Kloning Terorientasi
Bila
diinginkan
untuk
menginsersikan
potongan
DNA
asing dengan orientasi tertentu
Dilakukan dengan memotong DNA
vektor maupun DNA sumber gen
yang dikehendaki menggunakan
dua enzim restriksi yang berbeda

Vektor untuk
Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial
Chromosome) & YAC (Yeast
Artificial Chromosome)

Vektor berupa
1.
Memiliki origin of replication dari
Plasmid
inang yang dituju, sehingga
memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif:
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan
(multiple cloning sites, MCS)

Multiple Cloning Site

(MCS)

Vektor berupa
Plasmid

Vektor berupa
Plasmid
Keunggulan:

Kecil, mudah pengerjaannya

Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan
DNA ukuran kecil (< 10kbp)

Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon

potongan DNA ukuran besar (>
10kbp)

Bakteriofaga ( phage)

Vektor berupa bakteriofaga

( vectors)
Lengan

kiri:
Protein penyusun
kepala & ekor
Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang
dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian

Vektor berupa bakteriofaga

( vectors)

Vektor berupa
Bakteriofaga

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

Vektor
Gabungan
Cosmidsifat vektor plasmid dan
sifat berguna dari situs cos
(dihilangkan pada vektor )
Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon

potongan DNA berukuran sangat
besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan:

Tidak terlalu mudah untuk

mengerjakan plasmid dengan ukuran
sangat besar (~ 50 kbp)

Vektor
Cosmid

ZAP

Vektor BAC

Replikasi dimediasi
oriS dan oriE
parA and parB
mengendalikan
agar hanya
terdapat satu
vektor dalam sel
Menggunakan
penanda ketahanan
terhadap
KhloramfenikolR

Vecktor YAC
large
inserts
HIS3
URA3
ARS
telomere
centromere markers
replication
origin

telomere

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000

kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

BACs dan
YACs
BACs
: Bacterial Artificial
Chromosomes
YACs : Yeast Artificial
Keunggulan:
Chromosomes
Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA

dengan ukuran sangat besar (100 - 2,000 kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan
basa nukleotida total genom

Kelemahan:

Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan

ukuran sangat besar

Shuttle Vector

Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam

inang (memiliki origin of replication dari masingmasing inang)

Memilih Vektor

Ukuran DNA yang

disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim
restriksi yang
tersedia
Jumlah salinan
(copy number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk
menapis DNA
sisipan
Rencana penelitian
selanjutnya

Cara Mengklon DNA (1)

Isolasi vektor kloning

(plasmid bacterial) & DNA
sumber gen
Pemotongan DNA sumber
gen & vektor kloning
menggunakan enzim
restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam
vektor kloning yang telah
dipotong menggunakan
enzim restriksi yang sama;
potongan disambung
dengan bantuan enzim
DNA ligase

Cara Mengklon DNA (2)

Vektor kloning yang

telah tersisipi
potongan DNA
dimasukkan ke dalam
sel inang (transformasi
sel inang)
Penapisan sel
pengklon (dan gen
yang dimasukkan)
Identifikasi sel
pengklon pembawa gen
yang dikehendaki

Transformasi Sel Inang

Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah
disisipi gen) ke dalam sel
inang

Transformasi (1)

PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif
kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan
ini memberikan cekaman kepada
bakteri yang mengakibatkan
membran sel dan dinding sel
bakteri tersebut menjadi permeabel
terhadap plasmid donor. Proses ini
mengakibatkan E. coli menjadi
kompeten" untuk menerima
plasmid .

Transformasi (2)

INKUBASI

Plasmid ditambahkan ke dalam

suspensi sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten
lainnya yang tidak ditambah
plasmid digunakan sebagai kontrol.

Transformasi (3)

KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)

Sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun kontrol)
dipaparkan sejenak (90 detik)
kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya
plasmid menembus membran dan
dinding sel.

Transformasi (4)

PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun kontrol)
ditumbuhkan dalam medium kaya
nutrisi untuk memberi kesempatan
penyembuhan setelah mengalami
cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung
satu waktu generasi (untuk E. coli
berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Transformasi (5)

PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah
mengalami penyembuhan ditapis
pada medium padat yang
mengandung senyawa penapis
berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.

Koloni E. coli yang

membawa plasmid dengan
penanda gen pendar fluor
(pGLO)

E. coli yang Membawa

Plasmid pGlo

Penanda selektif
Memudahkan seleksi sel pembawa
plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik

ganda

penapisan biru-putih

Penapisan Klon

Medium pertumbuhan
diberi antibiotik yang
sesuai dengan sifat
ketahanan yang
digunakan sebagai
penanda, misalnya
Kanamisin
Bakteri di paruh cawan
petri sebelah kanan
memiliki plasmid
dengan penanda
ketahanan terhadap
Kanamisin(Kanr), yang
di sebelah kiri tidak
memilikinya

Penapisan warna koloni

Biru/Putih
lacZ
lacZ insert
Enzim berfungsi
X-gal

produ
k

X-gal

Enzim tidak
berfungsi

produk

Penapisan Koloni Bakteri

pembawa Plasmid
Rekombinan

Hibridisasi Koloni

Dapat
dilakukan jika
memiliki DNA
pelacak

Bagian dari gen

yang
dikehendaki
Bagian dari gen
yang mirip dari
jasad lain
Oligonukleotida
sintetik

End

See ya