RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

Penangkapan Siklus Sel pada Sel Kanker Payudara dengan

Pengobatan Metformin yang melibatkan Aktivasi AMPK,
Downregulation cyclin D1, dan Kebutuhan p27Kip1 atau p21Cip1

Yongxian Zhuang1,2 and W Keith Miskimins*1,2

Pendahuluan
Metformin HCl merupakan obat antihiperglikemic oral yang biasa
digunakan dalam pengelolaan diabetes mellitus tipe 2. Bukti terbaru
mengindikasikan

bahwa

metformin

memiliki

efek

signifikan

terhadap

tumorgenesis dan pertumbuhan sel kanker. Dilaporkan bahwa pasien dengan

diabetes tipe 2 yang diresepkan metformin memiliki risiko lebih rendah terkena
kanker dibandingkan dengan pasien yang tidak diberikan metformin. Dalam
kultur, metformin telah terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel-sel yang
berasal dari kanker payudara, kanker usus, kanker prostat, dan glioma. Salah satu
target intraseluler metformin adalah aktivasi adenosin 5'-monofosfat-activated
kinase (AMPK) yang terdiri dari tiga subunit, , dan yang masing-masing
subunit memiliki dua isoform. Aktivasi AMPK melibatkan ikatan AMP dengan
regulasi pada subunit yang menyebabkan allosteric mengubah konformasi
reseptor yang mengaktifkan enzim dan menghambat defosforilasi Treonin172
yang dibantu subunit . Aktivasi AMPK dengan pengobatan metformin telah
dilaporkan memberikan efek downstream pada kompleks mitokondria rantai
transpor electron.
Dalam jurnal ini, metformin sensitif terhadap penangkapan sel-sel kanker
payudara pada G0/G1 karena diaktivasi oleh AMPK, cyclin D1 menjadi
downregulasi, dan meningkatkan ikatan CDK2 oleh p27Kip1 dan p21Cip1. Aktivasi
AMPK dan downregulasi cyclin D1 pada metformin menjadi resisten terhadap
pertumbuhan

sel kanker payudara. Namun, kultur sel ini menjadi sensitif

terhadap metformin ketika p27Kip1 dan p21Cip1 mengalami overekspresi. Jadi,

inhibitor CDK berperan dalam penangkapan siklus sel (cell cycle arrest)

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

sebagai respon terhadap metformin. Hal ini penting karena p27Kip1 sering
menurunkan regulasi (downregulasi) pada sel-sel kanker.
Review Hasil dan Pembahasan
Pengobatan metformin tergantung kultur sel pada sel kanker payudara
Dalam mengatur ekspresi p27Kip1, metformin bekerja sebagai aktivator AMPK dan
menghambat proliferasi sel MCF7 yang tergantung pada dosis yang diberikan.
Metformin dengan dosis 8 mM menunjukan adanya proliferasi sel kanker. 5 dari
6 kultur sel kanker payudara yaitu MCF7, BT20, T47D, MDA-MB-453, dan
MDA-MB-474 tidak mengalami pertumbuhan sel setelah pemberian metformin.
Namun, kultur sel MDA-MB-231 menunjukan resistensi terhadap metformin
selama 4 hari sehingga tidak terjadi pembelahan sel (proliferasi). Hal ini
menunjukan metformin memberikan efek yang berbeda pada proliferasi sel dalam
sel kanker payudara tergantung pemberian pada sel kultur. Tidak terdapat korelasi
antara sensitivitas metformin dengan status ekspresi Reseptor Estrogen (ER),
mutasi p53, atau amplifikasi HER-2.
Efek metformin pada regulasi protein siklus sel di sel MCF7
Pengobatan

metformin

pada

sel

MCF7

menyebabkan

sensitivitas

dan

menghambat proliferasi sel. Pada penelitian ini, sel MCF7 yang diobati dengan
metformin 8 mM selama 36 jam dan diwarnai dengan propidium iodide kemudian
diamati pada Flow sitometri untuk memperkirakan jumlah sel dalam setiap fase
dari siklus sel. Sel yang diobati dengan metformin, meningkatkan jumlah sel pada
fase G0/G1 yaitu dari 61,4% sampai 71,7% dan berkurang pada fase S dari 32,2%
sampai 20,6%. Data tersebut menunjukan bahwa metformin menghambat
perkembangan siklus sel dari fase G0/G1 ke S (Gambar A). Untuk menguji efek
metformin pada variasi protein siklus sel termasuk cyclin E, cyclin D1, cyclin D2,
cyclin A, CDK2, CDK4 dan inhibitor CDK p27

Kip1

dan p21Cip1 menggunakan

eksperimen Western Blot. Hasil yang diperoleh, cyclin D1 menjadi hilang

(Gambar B). Pada mRNA, sel MCF7 diberikan perlakuan dengan kontrol (C) dan
metformin 8 mM (M) selama 36 jam dengan metode Multi-probe Ribonuclease
Protection Assay (RPA). Ekspresi cyclin D1 pada mRNA ditekan dengan
pemberian metformin. Ekspresi cyclin D1 yang dinormalkan dengan gen L32

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

pada mRNA antara penggunaan kontrol dan metformin pada sel menunjukan
perbedaan yang signifikan. Data ini menunjukan, metformin

menyebabkan

downregulasi pada cyclin D1 pada mRNA (Gambar C). Salah satu fungsi dari
cyclin D1/CDK adalah pengikatan dan penyerapan p27

Kip1

dan p21Cip1. Hal ini

mencegah protein dari pengikatan dan penghambatan cyclin E/CDK2 yang

menunjukan perkembangan dari G0/G1 ke fase S dari siklus sel. Cyclin D1
mengikat dan memblokir aktivitas CDK2. Pada pengujian Immunopresipitasi,
tingkat ekspresi p27

Kip1

dan p21Cip1 dihubungkan dengan CDK2 dengan

menggunakan kontrol (C) dan metformin (M). Immunopresipitasi dilakukan

dengan menggunakan antibodi anti-CDK2 serta antibodi kontrol yang tidak
berhubungan dari isotipe yang sama. Hasil yang diperoleh pada Western Blot,
menunjukan bahwa metformin memblok sel MCF7 dari proliferasi dengan
mengurangi kadar protein cyclin D1 yang menyebabkan pelepasan p27

Kip1

dan

p21Cip1. Inhibitor CDK digunakan untuk mengikat dan menghambat aktivitas

cyclin E/CDK2, yang mengarah kepada penangkapan sel pada fase G0/G1
(Gambar D).

Downregulation dari cyclin D1 yang melibatkan aktivasi AMPK

Sel MCF7 yang diberikan metformin selama 36 jam dan dilanjutkan dengan
Western Blot untuk menguji bentuk aktif fosforilasi AMPK (phospho-Thr172).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metformin meningkatkan tingkat fosforilasi
AMPK dan berkorelasi dengan downregulation dari cyclin D1 (Gambar A).
Reagen lain yang diujikan untuk mengaktifkan AMPK adalah antimycin A (1 M)
dan AICAR (4 mM). Kedua reagen ini meningkatkan fosforilasi AMPK dan
menurunkan jumlah protein cyclin D1 (Gambar B). Sel MCF7 yang diberikan
senyawa inhibitor spesifik AMPK-C (20 M) atau DMSO

selama 1 hari

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

kemudian diberikan metformin pada 36 jam berikutnya menunjukan senyawa C

memblok pengurangan cyclin D1 (Gambar C). Hal ini terkait dengan hilangnya
fosforilasi ACC. Hasil ini menunjukkan bahwa downregulation dari cyclin D1
oleh metformin tergantung jalur AMPK.

Overekspresi p27
metformin

Kip1

stabil di sel MDA-MB-231 mengarah ke sensitivitas

MDA-MB-231 adalah kultur sel kanker payudara agresif yang tidak

mengekspresikan reseptor estrogen dan bermutasi dalam bentuk p53. Karena pada
data sebelumnya, metformin kurang memberikan pengaruh terhadap proliferasi sel
MDA-MB-231, maka pada penelitian ini dilanjutkan untuk melihat pengaruh
downregulasi cyclin D1 diikuti dengan pengikatan yang ditingkatkan dari cyclin
E/CDK2 oleh p27 Kip1 dan p21Cip1. Pengobatan dengan metformin meningkatkan
phospho-AMPK di sel MDA-MB-231, mirip dengan yang diamati dalam sel
MCF7 (Gambar A). Hal ini menunjukkan bahwa MDA-MB-231 dalam
menanggapi obat yang membuat cyclin D1 menurun pada sel MDA-MB-231. Sel
MDA-MB-231 mengekspresikan protein p27

Kip1

dan p21Cip1 menjadi sangat

berkurang dibandingkan pada sel MCF7 (Gambar B). Hal ini menunjukkan
bahwa resistensi sel MDA-MB-231 karena kurangnya inhibitor CDK. Jadi,
meskipun cyclin D1 menurunkan regulasi dalam respon terhadap pengobatan
metformin, tingkat pelepasan p27

Kip1

dan p21Cip1 berkurang dan menghambat

aktivitas cyclin E/CDK2. Hal ini didukung oleh temuan bahwa fosforilasi Rb pada
serin 795, tempat yang ditargetkan oleh CDK2, menurun dalam sel MCF7 tetapi
tidak pada sel MDA-MB-231 setelah pengobatan metformin. Pada kultur sel yang
stabil MDA-MB-231-WTp27 yang overekspresi p27

Kip1

, pengobatan dengan

metformin sangat mengahambat proliferasi dibandingkan pada sel MDA-MB-231

(Gambar D). Downregulation dari cyclin D1, tidak cukup untuk menangkap sel
sebagai respon terhadap metformin. Inhibitor CDK p27Kip1 atau p21Cip1 harus

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

diekspresikan pada tingkat yang cukup sehingga pembebasan protein tersebut dan
penghambatan berikutnya dari cyclin E/CDK2 mengarah ke penangkapan siklus
sel.

Pembahasan
Metformin yang dindikasikan sebagai obat diabetes mellitus tipe 2, ternyata dapat
dimanfaatkan sebagai obat anti kanker. Seperti yang dibahas pada jurnal ini 1)
metformin menghambat proliferasi sel kanker payudara dan tidak berhubungan
dengan status ER, Her-2, atau ekspresi p53; 2) tingkat ekspresi cyclin D1 yang
tajam menurunkan regulasi dalam menanggapi metformin tetapi tidak cukup
untuk cell cycle arrest; dan 3) cell cycle arrest memerlukan inhibitor CDK yang
cukup (p27 Kip1 dan p21Cip1) untuk mengikat dan menghambat CDK2.
Proliferasi sel normal berlangsung melalui suatu siklus sel yang terdiri dari 4 fase
yang ditentukan oleh waktu sintesis DNA, yaitu fase G1, fase S, fase G2 dan fase
M. Setelah mitosis, sel memasuki fase G1, yaitu fase sel sangat aktif tetapi tidak
mensintesis DNA, atau memasuki fase G0 untuk istirahat. Pada fase G0/G1
kandungan DNA sel adalah diploid (2N). Siklus sel kemudian berlanjut ke fase S
saat terjadi sintesis DNA dan kandungan DNA berubah menjadi 4N. Fase
selanjutnya adalah fase G2 sebelum memasuki fase M di mana sel membelah diri
menjadi 2 sel diploid. Waktu yang diperlukan untuk satu siklus bergantung pada
jenis sel dan perbedaan waktu itu terutama di fase G1, bila perlu siklus sel
berhenti pada fase ini (G1 arrest) atau pada interfase G1/S.
Cyclin D1 memudahkan proliferasi sel kanker payudara. Kerja cyclin D1 secara
spesifik adalah menonaktifkan protein retinoblastoma (Rb protein) yang fungsinya

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

mencegah pembelahan sel. Kehadiran cyclin D1 berkorelasi dengan buruknya

prognosis kanker payudara.
Dari beberapa penelitian yang dilakukan pada jurnal ini, metformin memiliki efek
yang menguntungkan pada pencegahan atau pengobatan kanker. Pada gambar
berikut, metformin menghentikan proliferasi sel dengan mengaktifkan AMPK.
Dengan aktifnya AMPK menyebabkan downregulasi cyclin D1 pada mRNA dan
protein. Downregulasi cyclin D1 menyebabkan pelepasan inhibitor CDK, p27 Kip1
dan p21Cip1. Yang kemudian mengikat dan menghambat cyclin E/CDK2. Hal ini
mencegah perkembangan sel dari fase G1 ke S dan memblok proliferasi sel.
Reseistensi metformin terhadap cell cycle arrest diamati ketika ekspresi p27 Kip1
dan p21Cip1 rendah. Rendahnya ekspresi p27

Kip1

diamati pada berbagai jenis

kanker.

Kesimpulan
Metformin mampu meningkakan aktivitas AMPK, menekan ekspresi cyclin D1
serta memicu ekspresi p27 Kip1 dan p21Cip1.

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN

RESUME JURNAL BIOLOGI MOLEKULER

Penangkapan Siklus Sel pada Sel Kanker Payudara dengan

Pengobatan Metformin yang melibatkan Aktivasi AMPK,
Downregulation cyclin D1, dan Kebutuhan p27Kip1 atau p21Cip1

TUGAS UJIAN TAKE HOME

BIOLOGI MOLEKULER
DOSEN : Dr. PUJI ASTUTI, M.Sc., Apt.

Disusun oleh:

NAM A
NIM

: LA ODE MUH. FITRAWAN

: 15/387430/PFA/01519

PROGRAM PASCASARJANA
PROGRAM STUDI ILMU FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
2015

LA ODE MUHAMMAD FITRAWAN