BAB III

METODE PENELITIAN

A. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Farmasi dan laboratorium Kimia
Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

B. Variabel Penelitian
Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Variabel bebas

: Variasi konsentrasi ekstrak etanol kulit batang manggis

2. Variabel terkendali

: DPPH sebagai senyawa radikal bebas, alat, kualitas bahan

simplisia.

3.Variabel tergantung : Potensi antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis terhadap
radikal bebas DPPH.

C. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini : alat penyerbuk, maserator, beker glass
(Pyrex) dan alat gelas lainnya, spektrofotometer UV

( Shimadzu UV-1201), mikropipet.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini : metanol p.a (Merck), DPPH
(diphenylpicrylhidrazyl) p.a (Sigma), vitamin E (Natur E).
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol kulit batang
manggis.

D. Prosedur Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika, Jurusan
Pendidikan
14
Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

2. Penyiapan Bahan
13

Kulit batang manggis diambil di Desa Rawaheng, Kecamatan Wangon Kabupaten

Banyumas, Jawa Tengah, dengan usia pohon manggis sekitar 10 tahun. Pengeringan kulit
batang manggis dilakukan dengan ditutup kain hitam supaya tidak terkena sinar matahari
langsung. Setelah itu dijemur dibawah sinar matahari sampai kering. Simplisia yang telah
kering (dengan memperhatikan persyaratan kandungan air maksimal dalam simplisia)
diserbuk dan diayak menggunakan ayakan dengan no mesh 40/60, kemudian ditempatkan
dalam botol coklat yang kering.
3. Pembuatan ekstrak etanol kulit batang manggis
Ekstrak dibuat dengan cara pengadukan dan remaserasi dengan menggunakan etanol
70%. Sebanyak 500 gram bagian serbuk kulit batang manggis dimasukkan ke dalam
maserator, ditambah 10 bagian etanol 70%, direndam selama 6 jam sambil diaduk berkalikali (Anonim, 2004). Maserat dipisahkan dan proses diulangi 2 kali dengan jumlah pelarut
yaitu 4 bagian etanol 70% dari bobot simplisia awal. Semua maserat dikumpulkan dan
diuapkan dengan menggunakan bantuan penangas air dan kipas angin, hingga diperoleh
ekstrak kental, ditimbang dan dicatat rendemen yang diperoleh (Anonim,1986).
1. Pembuatan Larutan Stok Ekstrak Etanol Kulit Batang Manggis Konsentrasi 2000
ppm
Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,1 gram ekstrak etanol
kulit batang manggis dilarutkan dalam 50 mL metanol p.a.
2. Pembuatan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Kulit Batang Manggis
Dari larutan stok dengan konsentrasi 2000 ppm dipipet sebanyak 0.5; 1; 2; 4; mL
dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan metanol p.a sampai
dengan tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 100, 200, 400, dan 800 ppm.
15
3. Pembuatan Larutan Stok Vitamin E Konsentrasi 1000 ppm
Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,05 gram Vitamin E
dilarutkan dalam 50 mL metanol p.a.
4. Pembuatan Seri Konsentrasi Vitamin E
Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0.2, 0.4, 0.6,
0.8, 1 mL dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan dengan metanol p.a
sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 ppm.
5. Pembuatan Larutan DPPH 0,004%

Larutan DPPH 0,004 % (40 ppm) dibuat dengan cara menimbang 0,01 gram
DPPH dilarutkan dalam 250 mL metanol (p.a) tepat pada konsentrasi 0,004 % untuk
segera digunakan dan dijaga dalam temperatur rendah dan terlindung dari cahaya.
6. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH
Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0,004 % untuk uji
aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis dilakukan sebagai berikut : 5
mL larutan DPPH 0,004 % diamati serapannya pada rentang panjang gelombang 400-600
nm dengan menggunakan blangko metanol.
7. Uji Aktivitas Antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak etanol kulit batang
manggis dengan seri konsentrasi 800 ppm, 400 ppm, 200 ppm, dan 100 ppm.
Pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit batang manggis dilakukan
dengan menggunakan metode DPPH. Atom hidrogen atau kemampuan mendonorkan
elektron dari ekstrak etanol kulit batang manggis diukur dari hilangnya warna ungu dari
larutan DPPH dalam metanol menjadi warna kuning yang jernih. Pengukuran dilakukan
16
menggunakan spektrofotometri. Reagen yang digunakan adalah senyawa radikal stabil
DPPH (diphenylpicrylhidrazyl) (Gulluce et al, 2006).100 l dari seri konsentrasi ekstrak
etanol kulit batang manggis dilarutkan dalam metanol. Kemudian ditambahkan 0,004%
larutan DPPH dalam metanol hingga 10 mL. Jadi masing-masing seri konsentrasi untuk
ekstrak etanol kulit batang yaitu 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, dan 8 ppm, sedangkan untuk
vitamin Enya masing-masing yaitu 0,2 ppm; 0,4 ppm; 0,6 ppm; 0,8 ppm; dan 1ppm.
Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, absorbansi dibaca pada max
menggunakan blanko. Penghambatan radikal bebas dari DPPH dalam persen (I%)
dihitung menggunakan rumus
I% = (Absorbansi blanko Absorbansi sampel/Absorbansi blanko) x 100,
dimana absorbansi blanko adalah absorbansi dari larutan DPPH 0,004% dan absorbansi
sampel adalah absorbansi dari hasil reaksi antara larutan DPPH 0,004% yang direaksikan
dengan ekstrak yang diuji. Konsentrasi ekstrak yang menunjukkan 50% hambatan (IC50)
dihitung dari kurva hubungan presentase hambatan dengan konsentrasi sampel. Senyawa
antioksidan sintetis yang digunakan sebagai kontrol positif adalah vitamin E (Gulluce et
al, 2006).

8. Identifikasi dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya

Identifikasi golongan senyawa kimia dari profil kromatografi hasil KLT
dilakukan dengan cara memberikan pereaksi penampak bercak untuk masing-masing
golongan senyawa, hasilnya diidentifikasi dengan melihat warna panampak bercak baik
dengan sinar biasa ataupun dengan sinar UV 365 nm.
1. Deteksi flavonoid :
Fase Diam

: selulosa

Fase Gerak

: asam asetat 50%

Deteksi

: uap amoniak dan sitroborat

dan berfluoresensi hijau kuning

dengan sinar UV ( Markham,1988).

2. Deteksi tanin

Fase Diam

: silika gel F 254

Fase Gerak

: metanol : air (1:1)

Deteksi

17 sinar tampak
: FeCl3 1% menghasilkan warna bercak coklat pada
dan UV 254nm dan warna ungu pada sinar UV 366nm
(Harborne,1987).

E. Analisa Data
a. Data yang diperoleh berupa persen penghambatan (I%) dianalisis lebih lanjut untuk
mengetahui harga IC50-nya, yaitu menggunakan persamaan regresi linier pada kurva
hubungan antara persen hambatan dengan konsentrasi (Gulluce et al, 2006).
b. Data yang diperoleh dari pengukuran aktivitas penangkapan radikal bebas berupa IC50
dianalisis dengan SPSS dengan uji t (t test).