JOURNAL READING

Oleh:
Nur Prasetyo Nugroho
Rahmanita Fildzah
Agata Vamela
Pembimbing:
Dr. Syahrul Burhan, Sp.BS
Divisi Bedah Saraf
Rumah Sakit Muhammadiyah Lamongan
Universitas Muhammadiyah Malang
2014

Astrocyte-Like Cells
Derived From Human
Oral Mucosa Stem Cells
Provide
Neuroprotection In
Vitro
And
In
Vivo
Javier Ganz, Ina Arie, Tali Benzur, Michal Dadon-nachum,
Sammy Pour, Shareef Araidy,
Sandu Pitaru, Daniel Offen
STEM CELLS TRANSLATIONAL
MEDICINE

ABSTRAK

Abstrak
Human oral mucosa stem cell
(hOMSC) akhir-akhir ini dijelaskan
sebagai sel puncak dari populasi
stem sel
Potensi terapetik HOMSC bisa
didapatkan dari biopsi kecil
Kondisi medium dari induksi sel,
menyelamatkan motor neuron dari
hipoksia atau stres oksidatif in vitro,
yang memacu menjadi efek

Abstrak
Subjek tikus dengan cedera saraf
panggul dan di transplantasi dengan
HOMSC menunjukkan kemajuan
perbaikan pada fungsi motorik
Pada tempat transplantasi,
didapatkan peningkatan level NTF
(neurotrophic factor) dan menjaga
secara signifikan fungsi
neuromuscular junction

Abstrak
HOMSC NS yang dihasilkan dari
mukosa mulut menunjukkan efek
neuroprotektif in vitro dan in vivo
sebagai terapi masa depan pada
gangguan neural

PENDAHULUAN

Pendahuluan
Terapi berbasis stem sel menjanjikan
sebagai pengobatan penyakit
neurodegenerative
Strategi yang digunakan dalam penelitian
ada 2:
Penggantian sel untuk menambahkan sel yang
hilang dengan sel yang baru (Parkinson
disease)
Menggunakan sel sebagai vector yang
memproduksi dan mensekresi neuroprotektif
atau trophic stimuli untuk mempertahankan
neuron.

Pendahuluan
Neurotrophic factor (NTF) menghasilkan
polypeptida alami yang mendukung
perkembangan, kelangsungan hidup, dan
membesarkan neuron.
NTF seperti Brain Derived Neurotrophic
Factor (BDNF) dan Vascular Endhotelial
Growth Factor (VEGF) mempunyai peranan
penting sebagai pertumbuhan,
pemeliharaan dan regenerasi sistem saraf.

Pendahuluan
Populasi HOMSC menunjukkan
sebuah primitive neural crest (NC)
stem cell dibuktikan dengan faktor
transkripsi pluripotent Oct4, Nanog
dan Sox2 dan sesuai ekspresi dari NC
marker.
Embrio NC memberi peningkatan
untuk diferensiasi populasi glial di
sistem saraf perifer.

Pendahuluan
Penulis berhipotesis bahwa sel ini
secara tepat memberi sinyal ke
faktor solubel yang dapat memberi
manfaat stem sel sebagai sumber
terapi sel autolog pd ggn neurologi

BAHAN DAN METODE

Kultur HOMSC
HOMSC didapatkan dari biopsi mucosa
mulut pada pembedahan mulut
HOMSC didapatkan dan dibiakkan di media
yg terdiri dari low glucose Dulbecco
dimodifikasi Eagle dan dilengkapi
100mg/ml streptomycin, 100U/ml penicilin,
1250 U/ml Nystatin (SPN), 2mM glutamine dan
10 % fetal calf serum

Kultur HOMSC
Hasil biopsi disimpan dalam suhu 40
C dalam semalam
Kemudian lapisan epitelial dipisah
dari lamina propia dan diinsisi
menjadi lembaran 0,5mm3
sel dipindah ke piringan cultur yang
dipanen dengan 0,25% trypsin dan
ditanam pada ketebalan 4x104
cell/cm2

Diferensiasi HOMSC
Ada 2 tahapan pada diferensiasi:
1. Sel yang disimpan pada serum murni dengan
ditambah suplement-seplement dengan
konsentrasi akhir 20ng/ml
2. 72 jam kemudian dilakukan tahapan
diferensiasi kedua diaktifkan. Sel disimpan
pada media serum bebas ditambah

1mM dibutyryl cyclic AMP, 0,5 Mm 3-isobutyl1methylxantlon, 50ng neurogulin, 1ng.ml PDGF
selama 72 jam

Immunodetection
Untuk analisis imunofloresin, sel difiksasi
pd posphate buffer saline (PBS) 4% selama
60 menit di dalam blok
Antibodi primer dilemahkan pd blok dan
disimpan semalaman pd suhu 40 C
Antibodi primer dideteksi dgn antibodi
sekunder Alexa 488 dan 568 yang dilabeli
dgn flouresin selama 1 jam pd suhu
ruangan.

Immunodetection
Foto diambil dgn floresin Olympus
IX70-S8F2 dengan sumber cahaya
flouresin.

Western Blot Analysis

Untuk Western Blot Analysis , sel yang
dilarutkan dlm buffer yg mengandung PBS
1% SDS dan complete protease inhibitor
ditambahkan 12 % SDS-Polyacrylamide gel
elektrophoresis.
3 kultur independent digunakan sebagai
replikasi biologi
Membran dianalisis dan dikumpulkan,
diukur dengan Odyssey IR imaging
system.

Real Time Polymerase Chain

Reaction
Total RNA diisolasi oleh TRI reagent
Jumlah dan kualitas RNA ditentukan
dengan ND-1000 spectrophometer
Real time semiquantitative
polymerase chain reaction (PCR) dari
gen berperan pada ABI Prism 7700
rangkaian sistem deteksi.

Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay Berdasar Pengukuran
Sekresi NTF

Konsentrasi human VEGF dan BDNF dalam

kultur sel supernatant diukur
menggunakan prosedur ELISA
Sampel yang diinkubasi semalaman pada
piring berlapis, diikuti paparan antibodi
sekunder dan streptavidin-horseradish
H2O2
Hasilnya dikalkulasi sebagai sekresi
protein oleh 1 juta sel/mm dri media

Pengujian Kemampuan
Hidup Sel
Peneliti telah menguji kemampuan
undiferensisasi dan diferensiasi
HOMSC pd media preparat untuk
melindungi motor neuron-like hybird
cell line (NSC-34) dari hipoksia dan
stres oksidatif

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Percobaan dgn kerusakan saraf
panggul digunakan pada tikus
Sprague-Dawley laki-laki usia 8
minggu dgn berat 230-250gr
HOMSC didapatkan dari donor yang
berbeda dan digunakan pd
eksperimen yg independent
Hasil dari 2 eksperimen disatukan
dan dipresentasikan sbg rata-rata +
SEM/binatang

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Tikus dibius dgn chloral hydrate pada
cedera saraf panggul dan sel
transplantasi, maintenance dgn
cyclosporine
Saraf panggul kanan dikeluarkan dan
di klem 10mm diatas cabang
pertama saraf selama 30 detik

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
20 jam setelah cedera, diferensiasi HOMSC
dan naif sel dipanen, dilabeli dgn
seperparamagnetic iron oxide,
disentrifugal dan diresuspensi pd
konsentrasi 1x106 sel/100L
dimaintenence dgn es sampai
transplantasi dilakukan
HOMSC diinjeksi melalui m. gastrocnemius
menuju saraf dan diatas cabang pertama
saraf panggul

Cedera Saraf Panggul dan

Transplantasi Sel
Semua hewan coba dikorbankan 10
hari setelah transplantasi untuk
dilakukan pengamatan histologi.

Pengukuran fungsi motorik

tikus
Aktivitas motorik tikus diukur dengan
peralatan tes San Diego antara hari
pertama dan ke-10 setelah
transplantasi sel
Dalam tes ini diukur waktu yang
diperlukan tikus untuk berakselerasi
pada kecepatan (0-25 rpm)
Setelah terjadi cedera saraf panggul,
kemampuan tikus untuk
menyeimbangkan diri telah terancam

Pengukuran fungsi motorik

tikus
Rata-rata waktu yang diukur dalam
tiga putaran berturut-turut untuk
masing-masing tikus telah dicatat
dan dibandingkan antar grup
Data dipresentasikan sebagai nilai
persentil individu yang berhubungan
dengan waktu awal yang dibutuhkan
tikus untuk menyeberangi tangkai
sebelum cedera

Penilaian penanaman,
migrasi, dan fenotipe dari
sel

Untuk menilai ketahanan sel selama

transplantasi, hOMSC telah
diinfeksikan dengan partikel lentiviral
dan resisten dengan puromycin
selama 2 minggu.
Diferensisasi dari protein fluoresen
hijau (GFP) sel yang
ditransplantasikan kemudian
dicederai saraf panggulnya pada 12
binatang, yang satu kelompok terdiri

Penilaian penanaman,
migrasi, dan fenotipe dari
sel

Tiga ekor dari tiap grup dikorbankan

4 jam setelah transplantasi. Sisanya
yang 6 ekor diobati dengan sel GFP
dan tikus di uji motoriknya dan
dikorbankan pada hari ke-10 dengan
CO2
Otot kaki belakang telah dihilangkan
dan dibekukan dalam nitrogen cair.
Otot telah dipotong perpendikuler
sampai axis panjang dari otot

Penilaian penanaman,
migrasi, dan fenotipe dari
sel

Untuk menilai penanaman, migrasi,

dan fenotipe dari sel jumlah
DAPI/GFP yang positif berkisar 1280
pada 4 jam dan 10 hari post
transplantasi

Penilaian inervasi dari

jembatan neuromuskular
Otot kaki belakang telah dipotong
dan disimpan dalam nitrogen cair.
Otot dipotong-potong 30 mikro meter
menggunakan cryostat dan
ditempatkan dapa kaca untuk
pewarnaan
Saraf tepi dinilai inervasi nya jika ada
sesuatu yang melampaui terminal
akson atau denervasi jika saraf tepi
tidak terhubung dengan axon

HASIL

Diferensiasi hOMSC menunjukkan

fenotipe mirip astrosit
Mengikuti dua aturan langkah
diferensiasi. Seluruh sel kultur
berdiferensiasi substansial morfologi
menjadi bentuk dari sel saraf
astrosit.

Kondisi medium dari pemisahan saraf

motorik hOMSC dari hipoksia dan stres
oksidatif yang menginduksi kematian sel in
vitro

Untuk mengevaluasi pemisahan

saraf motorik hOMSC dari hipoksia
dan stres oksidatif yang menginduksi
kematian sel in vitro, dipakai garis
saraf motorik tikus.

Kondisi medium dari pemisahan saraf

motorik hOMSC dari hipoksia dan stres
oksidatif yang menginduksi kematian sel in
vitro

Setelah 72 jam hipoksia, kemampuan

sel antara yang diberi kultur NSC-34
dan tidak diberi kultur NSC-34
hOMSC menurun 11,85% dan 15,23%
dibawah sel yang dikultur NSC-34
dalam kondisi normoksia

Kondisi medium dari pemisahan saraf

motorik hOMSC dari hipoksia dan stres
oksidatif yang menginduksi kematian
sel in vitro
Sedangkan tingkat ketahanan kultur
NSC-34 yang diberikan stress
oksidatif selama 48 jam dan diobati
dengan hOMSC sama dengan sel
kultur yang tidak terpapar stress
oksidatif

Transplantasi hOMSC-NS meningkatkan

performa motorik setalah cedera saraf
panggul pada tikus
Cedera saraf panggul telah dipakai
untuk mengukur kapasitas hOMSCNS untuk menyokong pemulihan
saraf perifer
Peningkatan ini signifikan secara
statistik (p<0.5) antara hari pertama
dan ketujuh setelah transplantasi

hOMSC-NS yang ditanam

merumat fenotipe secara
vivo
Untuk menguji nasib dari sel yang
ditransplantasi, otot gastrocnemius
diuji secara histokimia dan
pewarnaan immunofluoresen

hOMSC-NS yang
ditransplantasikan
meningkatkan jembatan
neuromuskular setelah cedera
Sepuluh hari setelah cedera saraf
panggul, Jembatan neuromuskular
dievaluasi dan diukur dengan area
yang rusak pada otot gastrocnemius
dan otot tibialis di tiga grup tikus

ditransplantasikan
meningkatkan jembatan
neuromuskular setelah
cedera

Statistik menunjukkan perbedaan

signifikan antara grup hOMSC-NS
denga dua grup lainnya yang tak
berbeda satu sama lain (ANOVA dan
Tukey, p<0.05)

DISKUSI

 Terapi sterm sel sangat menjanjikan

untuk terapi degeneratif maupun
trauma sistem saraf pusat dan
sistem saraf tepi.
Terapi sterm sel ini menggunakan
sumsum tulang dewasa. Pada hewan
coba terapi Sterm sel ini
menunjukkan adanya perbaikan pada
sistem saraf pusat dan perifer

 Human oral mucosa stem cell

(hOMSC) akhir-akhir ini dijelaskan
sebagai sel puncak dari populasi
stem sel HOMSC NS yang dihasilkan
dari mukosa mulut. Populasi HOMSC
menunjukkan sebuah primitive
neural crest (NC) stem cell

 NC sel mempengaruhi berbagai sel

seperti glia sel, melanosit, tulang
craniofasial, kartilago, fibroblas, otot
polos dan sel endokrin.
Embrio NC memberi peningkatan
untuk diferensiasi populasi glial di
sistem saraf perifer.

 Penelitian ini juga menjelaskan

neuregulin disebut juga heregulin
terlibat dalam proliferasi dan migrasi
sel glia dalam perkembangan otak
dan berperan dalam maturalisasi dan
viabilitas sel astrosit

 Kami bisa mendeteksi jumlah GFAP,

VEGP, dan BDNF yang lebih banyak
dalam otot yang ditransplantasikan
hOMSC yang dibandingkan dalamc 2
grup. Penelitian ini ada korelasi
positif dengan motor dan NMJ