HPLC

1. A B U A B D I L L A H

(P27838113011)

2. A R N O L D U S Y A N S E N W E G O T A G E

(P27838113014)

3. T I T A H Y E K T I P R A H A S T U T I E S P

(P27838113019)

4. I D A A Y U D W I S A T M I H ( P 2 7 8 3 8 1 1 3 0 2 0 )

PENGERTIAN HPLC
Kromatografi
cair
berperforma
tinggi(high
performance
liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk
zatcair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLCdigunakanuntuk
memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat
tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya
merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk
memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak
tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan
kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu
senyawa.

SKEMA HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya
terdiri atas: wadah fase gerak
(Reservoir)
,
pompa, alat untuk memasukkan
sampel (tempat injeksi), kolom,
detektor,
wadah
penampung buangan fase gerak,
dan
suatu
komputer
atau
integrator
atau
perekam.

BAGIAN BAGIAN HPLC

1. Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat
digunakan sebagai wadah fase gerak. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan
gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai
pembawa komponen komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan
solute. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses
pemisahan.
Persyaratan fase gerak HPLC:
1.

Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.

2.

Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.

3.

Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4.

Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

5.

Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).

6.

Sesuai deng an detector.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase
gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) StopFlow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan
lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor
ini dapat digunakan pada kinerja sampai 6070 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut
pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 1 0 dan
dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat
diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Syarat syarat injektor yang baik :
1. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
2. Mudah digunakan
3. Keberulangan tinggi
4. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (1 0 1 00
l/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spectrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam
prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk
analisis rutin.

Fasa
Diam
Fasa
diam
berupa
adsorben
yang
tidak
boleh
larut
dalam
fasa
gerak. Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10m) dan tekanan sampai 6000
psi. Ukuran yang kecil dari fasa diam menyebakan fasa diam mempunyai luas
permukaan yang besar, keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien
pemisahan dipertinggi. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang
paling
banyak
digunakan
karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun
tinggi.

Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa
dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UVVis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil
c. stabil dalam pengopersiannya
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier)
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

P R I N S I P D A S A R H I G H P E R F O R M A N C E LI Q U ID
C H R O M ATO G RA P H Y ( H P LC)
HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi
(pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom
yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel
dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas
dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi
antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat
interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa
yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama.
Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat
diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR
digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi
puncak untuk analisis kuantitatif.

PERBEDAAN GC DAN HPLC

Kolom GC
Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya
terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral
pada GC.
Ada 3 jenis kolom padaGC yaitu kolom kemas (packing column) dan kolom
kapiler (capillary column); dan kolom preparative (preparative column).
Perbandingan kolom kemas dan kolom kapiler dtunjukkan oleh gambar
berikut :

Kolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari
tembaga dan aluminium. Panjang kolom jenis ini adalah 15 meter dengan
diameter dalam 1-4 mm. Kolom kapiler sangat banyak dipakai karena kolom
kapiler memberikanefisiensi yang tinggi (harga jumlah pelat teori yang
sangat besar > 300.000 pelat). Kolom preparatif digunakan untuk
menyiapkan sampel yang murni dari adanya senyawa tertentu dalam matriks
yang kompleks.

Kolom HPLC
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (1 0 1 00
l/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spectrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam
prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk
analisis rutin.

SISTEM INJEKSI SAMPEL HPLC

SISTEM INJEKSI SAMPEL PADA GC

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin
menggunakan semprit kecil. Jarum semprit menembus lempengan karet tebal
(Lempengan karet ini disebut septum) yang mana akan mengubah bentuknya
kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari lempengan karet
tersebut.
Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol. Oven
tersebut cukup panas sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke
kolom oleh gas pembawa misalnya helium atau gas lainnya

HPLC

GC

FASA DIAM

Fasa diam berupa adsorben yang

tidak boleh larut dalam fasa gerak.
Ukuran yang lebih kecil (5 s/d
10mm) dan tekanan sampai 6000
psi. Ukuran yang kecil dari fasa
diam
menyebakan
fasa
diam
mempunyai luas permukaan yang
besar, keseimbangan antar fasa
menjadi lebih baik dan efisien
pemisahan dipertinggi.

Fasa diam berupa suatu cairan

bertitik didih tinggi dan proses
serapannya lebih banyak
berupa partisi yang berupa
padatan dan adsopsi
memainkan peranan utama.

Fasa gerak

fase gerak adalah gas seperti

Fasa gerak merupakan suatu helium, hidrogen, atau
cairan.
nitrogen.
Sampel cuplikan harus
Sample harus mudah menguap
dimasukkan ke dalam kolom
dan memiliki kstabilan termal
sebagai lapisan setipis
pada suhu pengoperasian.
mungkin. Ukuran sampel
Sampel dimasukkan ke dalam
sekitar 1-20mL. Dua cara
aliran gas melalui lubang
untuk melakukan injeksi: cara
injeksi yang terletak pada
injeksi dan katup pemasukan
bagian atas kolom. Suatu
cuplikan mikro (micro-sampling aliran gas yang sinambung
valve)
mengelusi komponen
komponen dari kolom dan

Jumlah sample

REFERENSI
http://www.slideshare.net/BughisBerkata/sample-injection-of-hplc-28966666
http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/highperformanceliquid
chromatography.html
https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/