BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan
hidup. Jasad tersebut dapat hidup hampir di semua tempat di permukaan bumi. Mikroba
mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relative
panas, dari ligkungan yang asam hingga basa. Berdasarkan peranannya, mikroba dapat
dikelompokkan menjadi dua, yaitu mikroba menguntungkan dan mikroba merugikan
(Afriyanto 2005).
Tumbuhan obat merupakan sumber daya alam hayati yang memiliki nilai ekonomi tinggi
dan digunakan secara luas oleh masyarakat khususnya kelompok masyarakat yang belum
memiliki kesempatan untuk mendapatkan pengobatan moderen. Pemanfaatan obat tradisional
pada umumnya lebih diutamakan sebagai preventif untuk menjaga kesehatan, meskipun ada
pula upaya sebagai pengobatan suatu penyakit. Dengan semakin berkembangnya obat tradisional, ditambah dengan imbauan di masyarakat untuk kembali ke alam, telah meningkatkan
popularitas obat tradisional.
Salah satu kelompok obat tradisional adalah jamu. Jamu sudah dikenal di Indonesia,
khususnya di Pulau Jawa sebagai sarana perawatan kesehatan sehari-hari maupun sebagai
sarana pemulihan kesehatan bila telah sembuh dari sakit. Ramuan yang ada di dalam jamu
terdiri dari berbagai bagian tumbuh-tumbuhan yang saling bekerja sama membantu perawatan
dan untuk pencegahan penyakit.
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan
keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel, atau
isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk
memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran
langsung, perhitungan tidak langsung dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006).
Perhitungan langsung (direct count) untuk jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dan
sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik
(electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa
mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh
sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan pada kurva
standar.
Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam
sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme
1

contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah
mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel.
Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa
mikroorganisme diperkirakan dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme
yang relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS),
murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan
mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan
dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006).
B. Perumusan Masalah
1.
2.

Bagaimana cara menghitung koloni mikroba pada sampel obat tradisional dengan
metode Most Probable Number (MPN)
Bagaimana cara menghitung koloni mikroba pada sampel obat tradisional dengan
metode Angka Lempeng Total (ALT)

C. Tujuan dan Manfaat

Tujuan :
o Mengetahui kualitas obat tradisional (jamu) yang di uji
o Melakukan teknik teknik menghitung bakteri untuk menentukan jumlah koloni
bakteri dalam suatu biakan atau sampel
o Melakukan teknik penghitungan bakteri dengan metode Most Probable Number dan
Angka Lempeng Total
o Melakukan pengujian kualitas obat tradisional (jamu) secara mikrobiologi berdasarkan
nilai MPN dan ALT.
o Melakukan seri teknik pengenceran agar lempeng / angka lempeng total untuk
menghitung jumlah mikroba viabel
Manfaat :
Adapun manfaat dari praktikum ini yaitu dapat mengetahui kualitas obat
tradisional yang sering dikonsumsi dan mengetahui jumlah koloni yang terdapat pada
beberapa sampel obat tradisional yang di uji serta mengetahui perkembangan jumlah
koloni dalam media tertentu.

BAB II
2

TINJAUAN PUSTAKA

TEORI DASAR
Obat bahan alam merupakan obat yang menggunakan bahan baku berasal dari alam
(tumbuhan dan hewan). Obat bahan alam dapat dikelompokkan menjadi 3 jenis yaitu jamu, obat
herbal terstandar, dan fitofarmaka. Jamu (Empirical based herbal medicine) adalah obat bahan
alam yang disediakan secara tradisional, misalnya dalam bentuk serbuk seduhan, pil, dan cairan
yang berisi seluruh bahan tanaman yang menjadi penyusun jamu tersebut dan digunakan secara
tradisional.
Bentuk jamu tidak memerlukan pembuktian ilmiah sampai dengan klinis, tetapi cukup
dengan bukti empiris saja. Obat herbal terstandar (Scientific based herbal medicine) yaitu obat
bahan alam yang disajikan dari ekstrak atau penyaringan bahan alam yang dapat berupa tanaman
obat, binatang, maupun mineral. Proses ini membutuhkan peralatan yang lebih kompleks dan
mahal, serta ditunjang dengan pembuktian ilmiah berupa penelitian-penelitian pre-klinik.
Fitofarmaka (Clinical based herbal medicine) merupakan bentuk obat bahan alam dari
bahan alam yang dapat disejajarkan dengan obat modern karena proses pembuatannya telah
terstandar serta ditunjang oleh bukti ilmiah sampai dengan uji klinik pada manusiaketiga jenis
obat bahan alam tersebut sering disebut juga sebagai jamu. Namun ketiga jenis obat bahan alam
tersebut sering disebut juga sebagai jamu.
Sementara menurut keterangan BPPOM jamu adalah bahan atau ramuan bahan yang
berasal dari bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik) atau
campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan
berdasarkan pengalaman. Pengolahan jamu antara lain adalah direbus atau digodok, dikeringkan
atau dikonsumsi langsung. (Maheshwari, 2002).
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut
medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme
yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat
sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti
gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu
berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya.(Volk, dan
Wheeler,1993).
Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan
substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi
dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus memenuhi kebutuhan
dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh. (Mila Ermila,
2005)
Adapun macam-macam media Pertumbuhan antara lain :
3

1. Medium berdasarkan sifat fisik :

Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media
menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga
menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan
tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak
mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada
media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau
kebiruan dibawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan
mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen,
misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan
metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient
Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi :
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti,
misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak
kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang
komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya
Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan:
Media untuk isolasi : Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan
mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat : Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu
zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani
medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan
menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4%
untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment) : Media diperkaya adalah media yang mengandung
komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti
darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu.
Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana
untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood
Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

Media untuk peremajaan kultur : Media umum atau spesifik yang digunakan untuk
peremajaan kultur.
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik : Media ini digunakan unutk
mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers
Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat
sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri : Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan
spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan
adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial : Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,
misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling
koloni.

Meskipun telah dijabarkan berbagai macam jenis dari medium, perlu diiingat bahwa tidak
ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi untuk semua bakteri di
laboratorium. Bakteri amat beragam, baik dari persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa
berapa bakteri memiliki persyaratan nutrient yang sederhana, sedang yang lain memiliki
persyaratan yang rumit. Karena alsan ini kondisi harus disesuaikan sedemikian rupa sehingga
bisa menguntungkan bagi kelompok bakteri yang sedang ditelaah.(Pelczar, 1986)
Metoda APM adalah metoda untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan
medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5
seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statisitik.
Tabung positif ditunjukkan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas. Nilai APM ini diperoleh
dengan anggapan sebagai berikut :
Bakteri dalam contoh menyebar secara random.
Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah;
Organisme yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium selama inkubasi;
Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi.
Di dalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan
didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika
pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji
positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga
lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri).
Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh
harus diencerkan sampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM
maksimum yang dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah adalah dengan
melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran.
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam
penelaahan mikrobiologis. Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah
mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara
5

tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan
membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan
penggunaan ruang hitung (counting chamber).
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya,
ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan
melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter
(cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo,1991).
Perhitungan Bakteri secara langsung
Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat
preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan
ruang hitung (counting chamber) (Sutedjo, 1991).
Enumerasi mikroba dapat dilakukan secara langsung yaitu dengan menghitung jumlahnya
tanpa ditumbuhkan terlebih dahulu dalam suatu medium, dalam teknik ini semua sel mikroba
baik yang idup maupun yang mati akan terhitung. Untuk melakukan enumerasi mikroba dalam
suatu bahan seringkali diperlukan pengenceran bertingkat (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A.
Suprihadi, 2008).
Penghitungan mikroba secara langsung antara lain:
Plate Count (hitungan cawan) : Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap
sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan
dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang
tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam
suspensi tersebut.
Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan.
Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:
Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu
keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada
di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu
(misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat
membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel
mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna
tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup
minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini biasanya diatasi dengan cara
mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal
untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati
harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam
perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti
bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif
celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih
mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan selsel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80
sebanyak 0,1 %.
Perhitungan Bakteri Secara Tidak Langsung
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya,
ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan
melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter
(cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo,1991).
Berdasarkan kekeruhan
Mikroba dalam suatu bahan cair dapat dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan
sel bakteri didalam suatu medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan
mempengaruhi jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I., A.T.
Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count).Cara ini adalah cara yang paling umum
digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan jumlah koloni yang
tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampel secara seri, dengan kelipatan 1 : 10.
Masing-masing suspensi pengenceran ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar
(spread plate).
Bakteri akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24 jam
inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat digunakan alat colony
counter yang biasanya dilengkapi dengan pencatat elektronik (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A.
Suprihadi, 200)

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
7

A. Alat dan bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan percobaan menghitung mikroorganisme
dengan teknik angka lempeng total yaitu sampel obat tradisional (jamu gendong). Selain itu
digunakan pula larutan dapar fosfat (LDF) pH 7,2 sebagai pengencer, Nutrien Agar (NA),
selain itu menggunakan alkohol untuk mensterilkan jarum Ose.
Sedangkan alat yang digunakan untuk menghitung mikroorganisme dengan teknik angka
lempeng total yaitu tabung - tabung reaksi steril 6 buah, 6 buah cawan-cawan petri steril,
mikro pipet, rak tabung reaksi, kasa, dan alat untuk menghomogenkan larutan, lampu spiritus,
korek api, dan pulpen OHP.
Bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan percobaan menghitung mikroorganisme
dengan teknik most probable number / angka paling mungkin yaitu perbenihan TSB
(Trypticase Soy Broth ), larutan sampel obat tradisional (jamu gendong) dan alkohol.
Sedangkan alat yang digunakan untuk menghitung mikroorganisme dengan teknik
most probable number / angka paling mungkin yaitu mikro pipet, tabung tabung reaksi
steril, rak tabung reaksi, alat untuk menghomogenkan larutan (vortex), lampu spiritus, korek
api, dan pulpen OHP.
Bahan bahan yang digunakan untuk melakukan uji jenis mikroba adalah sampel obat
tradisional (jamu gendong), Lactose Broth (LB), TSB (Trypticase Soy Broth ), Mc Conkey
Agar, Selenite Cystine Broth, Tethrationate Broth, Vogel Johnson Agar (VJA), Cetrimide Agar
(CetA).

B. Cara Kerja
Persiapan dan homogenisasi sampel
Buka kemasan sampel secara aseptik
Secara aseptik, timbang 10 g atau pipet 10 mL sampel dan masukkan segera ke dalam
labu erlenmeyer berisi 90 mL LDF steril. Dari proses ini diperoleh suspensi larutan
sampel dengan konsentrasi 10-1.
Lanjutkan pengujian ke uji jumlah mikroba dengan teknik ALT dan MPN.

Angka Lempeng Total (Total Plate Count)

Bekerjalah secara aseptik di sekitar nyala api
Dari hasil persiapan dan homogenisasi sampel (konsentrasi 10-1), buatlah beberapa seri
pengenceran misal 10-2 10-6 (Pada saat praktikum, tabung diberi tanda pengenceran10 -3
8

10-5 dan masing-masing dilakukan secara duplo). Dari pengenceran 10 -1 ambil 1 mL

masukkan kedalam tabung berisi 9 mL LDF steril, sehingga diperoleh pengenceran 10 -2.
Dari pengenceran 10-2 ambil 1 mL masukkan ke dalam tabung berisi 9 mL LDF steril ,
homogenkan sehingga didapat pengenceran 10-3. Dan seterusnya sampai pengenceran
10-6.
Untuk penentuan ALT pindahkan 1 ml pengenceran 10-3 masing masing dituangkan
kedalam cawan petri steril (lakukan secara duplo) yang kosong kemudian dituangi
dengan NA cair bersuhu 45C sebanyak 15-20 ml kedalam setiap cawan petri. Goyang
goyangkan cawan petri dengan membentuk angka delapan untuk menghomogenkan,
biarkan memadat disuhu ruang
Lakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4 10-5 (lakukan secara duplo)
Inkubasikan semua cawan petri dalam inkubator bersuhu 37 C selama 24-48 jam
dengan posisi terbalik
Amati pertumbuhan pertumbuhan koloni dan hitung jumlah koloni yang tumbuh
dimasing masing perbenihan agar lempeng.

Most Probable Number (angka paling mungkin)

Siapkan 11 tabung masing-masing berisi 9 mL
Masukkan 9 mL perbenihan TSB kedalam masing masing 11 tabung . bagi tabung
dalam 3 kelompok, kelompok pertama dan kedua masing masing terdiri dari 4 tabung,
kelompok ketiga terdiri dari 3 tabung
Pipet 1 mL larutan atau timbang masing-masing 1g zat yang diperiksa kedalam masing
masing tabung kelompok pertama sehingga diperoleh pengenceran sampel 10-1 (0,1).
Sisihkan 1 tabung
Pipet 1 mL larutan dari tabung yang disisihkan kedalam masing masing tabung
kelompok kedua sehingga diperoleh konsentrasi sampel 0,01 (pengenceran sampel 10-2)
Sisihkan 1 tabung.
Pipet 1 mL larutan dari tabung yang disisihkan kedalam masing masing tabung
kelompok kedua sehingga diperoleh konsentrasi sampel 0,001(pengenceran sampel 10-3)
Inkubasikan seluruh tabung pada inkubator bersuhu 35 - 37C selama 24 48 jam
Amati adanya pertumbuhan pada masing masing tabung.
Dengan menggunakan tabel MPN dapat dihitung jumlah bilangan duga terdekat jasad
renik tiap gram atau tiap mL sediaan yang diperiksa.
Analisis Cemaran Mikroba Patogen Escherichia coli
Buka kemasan sampel secara aseptik
Homogenisasi sampel dan pengkayaan (enrichment) : Secara aseptik,timbang 10g
sampel dan masukkan segera kedalam labu erlenmeyer berisi 100mL media Lactose
Broth (LB) steril, kemudian tutup rapat-rapat, homogenkan dengan vortex inkubasi
pada suhu 35C selama 24 jam
Menanam ke media agar selektif : inokulasi 1 ose dengan cara gores kuadran ke media
agar Mc Conkey (MCA). Inkubasi pada suhu 35C selama 24 - 48 jam Jika terdapat
koloni spesifik pada media MCA dengan deskripsi seperti pada tabel 9.1 inokulasikan
9

koloni tersebut dengan teknik gores kuadran ke media agar selektif Eosin Methylene
Blue Agar (EMBA). Inkubasi pada suhu 35C selama 24 - 48 jam. Amati ada tidaknya
pertumbuhan koloni spesifik seperti deskripsi yang tertera pada tabel 9.1 pertumbuhan
spesifik Escherichia coli pada media agar selektif ditandai dengan adanya koloni seperti
dijelaskan pada tabel 9.1
Media
Mc Conkey Agar (MCA)
Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)

Deskripsi koloni
Merah bata, dapat dikelilingi daerah yang
terdiri dari endapan empedu
Kilap Logam

Uji lanjutan terhadap koloni yang di duga Escherichia coli. Jika terdapat koloni spesifik
dengan warna kilap logam pada media EMBA, lakukan uji lanjutan terhadap koloni
tersebut. Inokulasikan koloni kedalam tabung berisi media LB steril dengan tabung
durham terbalik dan kedalm media agar miring NA. Inkubasi pada suhu 35C selama 24
- 48 jam. Dari hasil inkubasi, lakukan pewarnaan gram dan uji IMVIC.
Tabel 5.2 hasil uji lanjutan untuk Escherichia coli
Pada Media LB dengan tabung Durham

Deskripsi Koloni

Hasil pewarnaan gram

Basil pendek, gram negatif

Hasil Uji IMVIC

Indol (+) MR(+) VP(-) SC (-)

Analisis Cemaran Mikroba Patogen Salmonella sp.

Buka kemasan sampel secara aseptik
Homogenisasi sampel dan pengkayaan (enrichment) : Secara aseptik,timbang 10g
sampel dan masukkan segera kedalam labu erlenmeyer berisi 100mL media Lactose
Broth (LB) steril, kemudian tutup rapat-rapat, homogenkan dengan vortex inkubasi
pada suhu 35C selama 24 jam
Pengkayaan selektif : inokulasi 1 ose ke tabung reaksi berisi 10 mL media Selenite
Cystine Broth dan 1 ose ke tabung reaksi berisi 10mL media Tetrathionate Broth.
Inkubasi pada suhu 35C selama 24 jam.
Menanam ke media agar selektif : Jika pada media Selenite Cystine Broth dan
Tetrathionate Broth keruh, inokulasikan 1 ose koloni tersebut dengan teknik gores
kuadran ke media agar Brilliant Green Agar (BGA). Inkubasi pada suhu 35C selama
24 - 48 jam. Selain BGA, dapat pula digunakan media XLDA dan BSA sebagai media
selektif. Amati ada tidaknya pertumbuhan koloni spesifik seperti deskripsi yang tertera
pada tabel 9.3 pertumbuhan spesifik Salmonella sp. pada media agar selektif ditandai
dengan adanya koloni seperti dijelaskan pada tabel 9.3
10

Media

Deskripsi Koloni

Brilliant Green Agar (BGA)

Xylosa-Lysine-Desoxycholate Agar (XLDA)
Bismuth Sulfite Agar (BSA)

Kecil, transparan,tidak berwarna atau merah

muda hingga putih buram (sering dikelilingi
zona berwarna merah muda hingga merah)
Merah dengan atau tanpa pusat berwarna hitam
Coklat, abu-abu atau hitam kadang disertai
dengan kilap metalik. Media sekitar mulanya
berwarna coklat, seiring dengan waktu inkubasi
berubah menjadi hitam.

Uji lanjutan terhadap koloni yang diduga Salmonella sp : dengan menggunakan jarum
ose, ambil koloni yang diduga Salmonella sp dari media agar selektif, inokulasikan
dengan cara gores dan tusuk pada media agar miring TSIA. Lakukan hal yang sama ke
media agar miring LIA. Inkubasi pada suhu 35C selama 24 - 48 jam
Tabel 5.4 hasil reaksi yang umum untuk Salmonella sp pada media TSIA dan LIA
TSIA

LIA

Lereng (slant)

Basa (merah)

Basa (ungu)

Tusukan / dasar (butt)

Asam (kuning)

Basa (ungu)

Produksi H2S (endapan hitam didaerah

tusukan)

+ atau -

BAB IV

11

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

DATA PENGAMATAN
ANGKA LEMPENG TOTAL
Pengenceran
10-3
10-3
10-4
10-4
10-5
10-5

Hasil
41
26
2
5
4
0

Perhitungan : N = 41/ (1x1) x 10-3 = 41000 cfu/mL

MOST PROBABLE NUMBER
PENGENCERAN
10-1
10-2
10-3

I
+
+
+

II
+
+
+

KESIMPULAN

III
+
+
+

JUMLAH
3
3
3

>1100 MPN/g

UJI JENIS MIKROBA

MEDIA
LB

HARI - 1
(+) keruh

KETERANGAN
Dilanjutkan ke MCA

UJI CEMARAN Escherichia coli

MEDIA
MCA

HARI - 1
(-)

KETERANGAN
Tidak dilanjutkan ke EMBA

UJI CEMARAN Salmonella typhi

MEDIA

HARI - 1

KETERANGAN
12

Selenite

(+) keruh kuning

Dilanjutkan ke BGA

Tetrationate

(+) keruh kehijauan

(+) koloni bening atau putih
dikelilingi merah

Dilanjutkan ke BGA

BGA

Dilanjutkan ke TSIA dan LIA

TSIA
LERENG

LIA
TUSUKAN

ASAM

BASA

ASAM

BASA

GAS

H2S

ASAM

BASA

GAS

H2S

B. GAMBAR HASIL PENGAMATAN

Tabung

tabung

MPN
sebelum di
inkubasi

dan cawan

Tabungpetri sebelum
diinkubasi

tabung

13

Media LB dan TSB sebelum diinkubasi

Cawan petri setelah diinkubasi

Cawan petri

setelah diinkubasi

adanya

menunjukkan

pertumbuhan mikroba

14

Tabung tabung MPN setelah diinkubasi menunjukkan hasil seluruh tabung (+) keruh

Media uji jenis LB setelah diinkubasi menunjukkan hasil yang keruh dan harus dilanjutkan ke
media MCA (inokulasi gores), Selenite dan Tetrationate (inokulasi langsung).

Media MCA, selenite,tetrationate setelah diinkubasi. MCA menunjukkan hasil yang (-) sehingga
tidak dilanjutkan ke media EMBA. Sedangkan selenite dan tetrationate menunjukkan hasil yang
keruh (+) sehingga dilanjutkan ke media BGA.

15

Setelah diinokulasikan ke media BGA, menunjukkan hasil

sehingga dilanjutkan ke TSIA dan LIA

(+) pada selenite da tetrationate

Media TSIA dan LIA sebelum di inkubasi

TSIA dan LIA setelah di inkubasi menunjukkan hasil TSIA lereng bersifat asam (+) warna
kuning, Tusukan bersifat asam (+) warna kuning. LIA menunjukkan hasil (+) basa berwarna ungu
C. PEMBAHASAN

16

1. Pada Uji Jenis dengan menggunakan media LB, setelah sampel di inkubasi selama 24 jam
pada suhu 35-37C terbentuk kekeruhan dari warna sebelumnya, hal ini menandakan
adanya cemaran mikroba, sehingga sampel perlu di uji lanjutan dengan uji Salmonella
typhii, dan Uji Escherichia coli.
2. Pengujian batas mikroba juga dilakukan dengan cara perhitungan angka lempeng total
(ALT), dan didapat dari hasil dimana jumlah bakteri 41000 cfu/mL, sehingga sampel ini
tidak memenuhi syarat steril berdasarkan KEPMENKES RI No. 661, dimana sediaan
pemberian secara oral yang mengandung bahan alam adalah tidak boleh mengandung
bakteri 104 cfu/ml.
3. Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang
terdapat diantara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan media
Larutan Dapar Fosfat (LDF), maka adanya bakteri yang dapat memfermentasi laktosa
ditunjukkan dengan terbentuknya kekeruhan pada larutan dalam tabung. Cara ini biasa
digunakan untuk menentukan MPN koliform karena bakteri Coliform termasuk bakteri
yang dapat menfermentasi laktosa. Didapat hasil yang positif (+) pada semua seri
pengenceran 10-1 sampai 10-3 , dengan jumlah bakteri >1100 cfu/ml, sehingga sampel ini
tidak memenuhi syarat steril berdasarkan Farmakope Internasional Volume 3 tahun 2003,
dimana sediaan pemberian secara oral yang mengandung bahan alam adalah tidak boleh
mengandung bakteri 104 cfu/ml.
4. Pada Uji Bakteri Salmonella typhii dengan menggunakan media Selenite didapat hasil
yang ( + ) dimana media menjadi berwarna kuning keruh dan media tetrationate menjadi
warna keruh kehijauan, hal ini menunjukkan bahwa terdapat pertumbuhan bakteri
Salmonella typhii, sehingga uji dilanjutkan ke media BGA untuk memastikannya. Pada uji
BGA juga didapat hasil yang positif (+) dimana hasil goresan pada pada media tersebut
memberikan warna pink transparan yang mengartikan bahwa sampel positif (+) terdapat
Salmonella typhii. Uji kemudian dilanjutkan ke media TSIA dan LIA dengan cara gores
maupun tusuk, dan kedua media ini hasil positif (+) adanya pertumbuhan Salmonella
typhii yaitu pada media TSIA terbentuk warna kuning (bersifat asam) pada daerah
penggoresan tabung dan di daerah tusukan. Selain itu, pada media LIA juga terbentuk
warna ungu (+) di daerah goresan dan tusukan. Berdasarkan hal tersebut, maka sampel
yang diuji tidak memenuhi syarat KEPMENKES RI No. 661, yang seharusnya sediaan
pemberian secara oral yang mengandung bahan alam tidak boleh mengandung bakteri
Salmonella typhii . Pencemaran ini dapat disebabkan karena Salmonella typhii dapat
mencemari sampel jamu secara langsung atau tidak langsung melalui air yang tercemari
oleh kotoran dari bahan mentah ataupun dari peralatan yang dipakai.
5. Pada Uji bakteri Escherichia coli dengan menggunaka media Mc. Conkey Agar didapat
hasil yang negatif (-) dimana tidak terbentuk warna merah bata, sehingga dapat dikatakan
sampel yang diuji tidak mengandung bakteri Escherichia coli yang merupakan kuman
oportunis yang banyak ditemukan dalam usus besar manusia sebagai flora normal yang di
dapat menjadi patogen ketika berada di jaringan luar intestinal normal, maka uji tidak
dianjutkan ke media EMBA.
17

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Pada Uji batas jasad renik sampel yang diuji dengan menggunakan metode ALT,
didapat jumlah total jasad renik adalah: 41000 cfu/mL. Pada Uji batas jasad renik sampel
yang diuji dengan menggunakan metode MPN, didapat jumlah total jasad renik adalah
>1100 cfu/mL. Berdasarkan hasil percobaan, semua sampel tidak layak untuk dikonsumsi
sesuai dengan persyaratan batas mikroba untuk obat tradisional.
B. Saran
Metode perhitungan bakteri sebaiknya dengan menggunakan MPN karena pada ALT
terdapat beberapa kelemahan seperti:
Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, sehingga dapat
memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba
yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan
oksigen selama masa inkubasi.
Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan
media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba
lain tersebut tidak terhitung.
Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30
300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan
penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan
menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.

18

DAFTAR PUSTAKA

James G. Capuccino. Natalie Sherman. Microbiology a laboratory manual. 8th edition. State
university of new york Rockland community college
British Pharmacopoeia 2011 volume 5, London : the statonery office
Anonim, 2002, Green Health: Indonesia, Jamu Project,
http://www.unesco.or.id/apgest/pdf/indonesia/bp-gh-ri-pdf. 20 April 2005
Anonim, 1992, Prosedur Operasional baku Pengujian Mikrobiologi. Pusat Pemeriksaan
Obat dan makanan. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan
Departemen Kesehatan RI.
Lay, W. Bibiana. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta

19