Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan
yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang
dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat
berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai
radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan
sehari-hari adalah cahaya matahari.
Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama yaitu di
dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Namun
pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena
ditunjukan pada interaksi antara materi dengan cahaya (baik yang dilihat maupun
tidak terlihat). Sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya
maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik.
Radiasi elektromagnetik memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat
dualistik cahaya yaitu:
1) Sebagai gelombang
2) Sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton.
Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya
panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Panjang gelombang (l)
didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak.

Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang

dikenal dengan persamaan Planck. Hubungan antara panjang gelombang frekuensi
dirumuskan sebagai

c = . v atau = c/v atau v = c/

Persamaan Planck: hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi

E=h.v
E = h . c/

dimana

E = energi tiap foton

h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).

Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton
akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang
dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya.

Misalnya: energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi
yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang
() yang lebih pendek (100400 nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki
sinar tampak (400800 nm).
Berbagai satuan energi beserta faktor konversinya dapat dilihat pada tabel:

Erg

Joule

Kalori

l.atm

E.volt

1 erg = 1

10-7

2,390110-8

9,86871010

6,24181011

J joule = 107

2,390110-1

9,868710-3

6,24181018

1 kalori 4,1849107

4,1840

4,129110-2

2,61161019

1 atm = 1,0133109

1,0133102 24,218

16,62481020

1 E.volt = 1,602110-12

1,6021x-19

3,829110-20 1,561110-20

Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan

cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri
disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip
kerja yang sama yaitu adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang
memiliki panjang gelombang tertentu. Perbedaannya terletak pada panjang
gelombang yang digunakan.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri
dari :
sumber cahaya monokromator sel sampel detektor read out (pembaca).

Fungsi masing-masing bagian:

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan
berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer

UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.

Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu

mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya
monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan
gratting atau lensa prisma dan filter optik.
Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya.
Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan
sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam
satu alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.
Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya
pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang
mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar.

Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel

- UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet
biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari
silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca
dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada
spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang
dengan lebar 1 cm.
- IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada
dua lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke
dalam sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali

larutan yang dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya
mahal.

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan

mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

Kepekaan yang tinggi

Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.

Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

Detektor foto (Photo detector)

Photocell, misalnya CdS.

Phototube

Hantaran foto

Dioda foto

Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik
yang berasal dari detektor.

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya
polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang
tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan

penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu
materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah
(eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan
elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron
ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya
inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu
molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron
terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi
suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel
disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya
mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian
lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang
mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang
dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya
setelah melewati materi (sampel)). Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat
digambarkan sebagai berikut:

Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat
bahwa zat sebelum melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding
cahaya setelah melewati sel sampel

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang
hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambertbeer atau Hukum Beer, berbunyi:

jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang

diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi
eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk

menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas

cahaya setelah melewati sampel.
Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A= a . b . c atau A = . b . c

dimana:
A = absorbansi

b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga

umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur
= tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan

yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
1. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan

dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).

2. Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak

dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal

kuvet) yang sama.

4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya

larutan yang diukur harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan
cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di dalam larutan.
5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan

menggangu kelinearan grafik absorbansi versus konsntrasi.

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan

spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:
1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan

blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis
termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa,

namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.

3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat

rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan
konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan
(melalui pengenceran atau pemekatan).

Spektrum UV, VIS, UV-VIS dan IR

Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi atau
transmitansi yang langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS,
UV-VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum jika telah
dihubungkan dengan komputer.
Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS berupa pita yang
lebar sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak
tajam.
Pita melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki selain
menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam
molekul. Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi elektron maka spektrum yang
dihasilkan berupa garis atau puncak tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis
dapat terjadi pula pada spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.
Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda antara satu
dengan yang lainnya. Para kimiawan spektrum UV, VIS maupun IR dapat
dibedakan dengan mudah. Spektrum yang dihasilkan oleh UV, VIS dan UV-VIS
tidak berbeda jauh namun sangat sangat berbeda bila dibanding spektrum IR.
Untuk membedakannya dapat dilihat pada gambar:

Gambar spektrum UV. Namun spektrum dari spektrofotometer VIS dan UV-VIS
menyerupai spektrum UV

Gambar spektrum IR. Pita tertinggi mengarah ke bawah sedangkan pada UV pita
yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan spektrofotometer IR ditulis
dalam bentung bilangan gelombang