Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di

inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi DNA, peninjauan
pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa gen, dan amplifikasi
DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi
DNA ini, yaitupreparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel),
purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan
protease) dan RNA (dengan RNAse). Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam
membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut
ditentukan oleh hal-hal berikut yaitu kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan
dipotong oleh sembarang enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi
berlangsung. Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan
untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.
Isolasi DNA adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam
mempelajari teknik biologi sel. Teknik ini diawali dengan perusakan dinding sel
(tumbuhan) dan lisis membran sel yang merupakan upaya pemecahan sel, serta
presipitasi DNA yang akan dipisahkan (purifikasi DNA). Perusakan dinding
sel biasanya menggunakan nitrogen cair yang memiliki suhu -169C. Penggunakan
nitrogen cair ini dimaksudkan untuk membekukan sel, setelah sel beku lalu sel dirusak
(digerus) sampai benar benar halus dengan mortar agar dinding sel rusak. Lisis
membran sel yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Teknik ini
umumnya dilakukan menggunakan larutan deterjen kationik yaitu CTAB. Hal ini
dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif lebih
mudah. Bufer CTAB merupakan detergen kationik yang dapat melisis membran sel dan
mampu mengendapkan polisakarida serta senyawa-senyawa fenolik.Penggunakan
CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan, mengurangi browning dan untuk
menjaga DNA agar tidak rusak. Komponen-komponen yang terkandung dalam bufer
CTAB adalah Tris-Cl, EDTA, NaCl, CTAB, PVP, dan merkaptoetanol. Tris-Cl berfungsi
untuk mendenaturasi protein. NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat
DNA. EDTA berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium
yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan.
Larutan CTAB, PVP, dan merkaptoetanol berfungsi untuk mendegradasi senyawasenyawa metabolit sekunder sekaligus mengurangi browning akibat oksidasi.
Pemurnian (purifikasi)
DNA
bertujuan
untuk menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol),
polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA
dilakukan menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim
RNAse. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendenaturasi
protein sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut.

Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol dingin yang

bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya dari
garam-garam mineral sisa CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol ini dibersihkan
menggunakan alkohol 70 %. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting dalam
Isolasi DNA. Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA yang
dilakukan diangap gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas DNA hasil isolasi
dan mengakibatkan data yang didapat tidak valid.
Reagent-reagent yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA yaitu Nitogen Cair,
Polyvinyl Pyrrolidone (PVP), Bufer CTAB, Mercaptoethanol, CHISAM, isopropanol
dingin, bufer Tris-EDTA (TE), RNAse, dan ethanol 70%. Sedangkan alat-alatnya adalah
sebagai berikut, yaitu Mortar dan Pestle, Tabung Nitrogen, Tube Eppendorf 1,5 ml atau
2 ml, mikropipet, oven, freezer, mesin elektrofotometer, mesin spektrofotometer, mesin
sentrifuse, pipet tip 1000 l dan 20 l.

Ada 5 (lima) komponen utama PCR yaitu oligonukleotida primer, buffer amplifikasi,

deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP), sekuen target (templatee DNA) dan Taq DNA
polimerase.

Primer

adalah rantai DNA pendek yang terdiri atas beberapa nukleotida. Primer yang
umum digunakan terdiri atas 10 atau lebih nukleotida (oligonukleotida). Primer berfungsi
sebagai pemula dalam proses sintesis DNA dengan PCR. Contoh primer yang
digunakan misalnya TGAGCGGACA. Konsentrasi primer PCR berkisar 0,1-0,5M.
Konsentrasi primer yang tinggi (0,5M) dapat meningkatkan kesalahan penempelan
primer pada DNA cetakan , sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak
spesifik dan akan mengganggu analisis.
Namun penggunaan konsentrasi yang terlalu rendah akan memberikan hasil
amplifikasi yang tidak jelas. Primer yang biasa digunakan adalah primer yang spesifik
dan primer acak (tersusun atas nukleotida sembarang yang belum diketahui dengan
jelas susunan nukleotidanya). Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari
primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas
fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi
(- OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui
ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa
didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang
dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil
analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui
mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. Dalam melakukan perancangan
primer harus dipenuhi kriteria-kriteria sebagai berikut:
a. Panjang primer
Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih.
Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa. Primer dengan panjang kurang
dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer rendah. Untuk ukuran primer yang
pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang
tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari
primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses
PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan
spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan menyebabkan lebih mahal.
b. Komposisi primer
Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetan nukleotida
yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat
memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G
dan C) sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab

primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi

untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian
akan menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada ujung 3
sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap mismatch dari pada G
atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan spesifisitas primer.
c. Melting temperature (Tm)
Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah.
Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer akan berpengaruh sekali
di dalam pemilihan suhu annealing proses PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer
dan panjang primer. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan
rumus [2(A+T) + 4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 65 oC.
d. Interaksi primer-primer
Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari.
Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah lain yang tidak dikehendaki,
ini semua dapat menyebabkan spesifisitas primer menjadi rendah dan di samping itu
konsentr

Plasmid

adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai

ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen
esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang
disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme
prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat
rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :
a. berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)
b. dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c. terdapat di luar kromosom
d. secara genetik dapat ditransfer secara stabil
Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :
1. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR 322
2. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid Ti
Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim yang
digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut sebagai gunting
biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid
harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara
plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:
1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim pemotong ini
mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut
2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom, artinya
bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama akan
memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya
3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end)
dan ujung rata (blunt end).

Enzim ligase

adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung

potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan
DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:
1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong
2. penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan kovalen
antara ujung 3OH dari utas satu dengan ujung 5P dari utas yang lain
3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung DNA sehingga
kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.

Plasmid pGEM-T Easy merupakan plasmid sirkular terbuka, memiliki dua

buah origin of replication dan gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini
mengandung multy cloning site. Karena memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung
terbuka plasmid (Toverhang), plasmid ini sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang
selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih
dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk
menyimpan gen insert dalam suatu inang. Selain itu, pGEM-T Easy merupakan vektor yang
berukuran kecil yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa
DNA target cukup banyak dan memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar. Vektor
berukuran kecil lebih mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena
cenderung tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar. Selain itu plasmid dH5alpha adalah plasmid dengan DNA yang resisten terhadap ampisilin (Daudi 2009).

complementary DNA (cDNA)

merupakan DNA yang

disintesis dari template mRNA dalam sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzimreverse transcriptase.
cDNA biasanya digunakan untuk kloning gen eukariot dalam prokariot. Jika seorang ilmuan ingin
mengekspresikan protein tertentu dalam sell yang secara normalnya tidak mengekspresikan protein
tersebut (contohnya ekspresi heterolog), mereka akan mentranfer cDNA yang mengkode protein
tersebut ke dalam sel donor (sel penerima). cDNA juga diproduksi oleh kelompok retrovirus (seperti
HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus, dan lain sebagainya) yang terintegrasi dengan
inangnya untuk membuat sebuah provirus (calon virus).

Penyisipan gen ke dalam tumbuhan dapat dilakukan melaui beberapa cara. Salah satunya, sumber DNA gen
asing terlebih dahulu dimasukkan ke dalam plasmid bakteri Agrobacterium tumefaciens. Bakteri Agrobacterium
rekombinasi tersebut diinfeksikan pada jaringan tumbuhan. Bakteri yang digunakan Agrobacterium tumefaciens
sebab di alam bakteri ini menginfeksi tanaman dan menyebabkan penyakit cro n gall (sejenis tumor).
Dengan dimasukkannya gen asing ke dalam plasmid bakteri, gen asing akan memasuki DNA tumbuhan.
Dengan demikian, tumbuhan akan memiliki sifat yang sesuai dengan gen asing tersebut. Tumbuhan hasil
penyisipan gen disebut juga tanaman transgenik.
Berbagi macam gen telah berhasil disisipkan ke dalam DNA tanaman pertanian. Beberapa di antaranya adalah
gen bagi penghasil vitamin, gen untuk penghasil racun bagi serangga, gen bagi pengikatan nitrogen bebas,
dan gen untuk bahan herbisida. Gen-gen tersebut dapat menyebabkan tanaman transgenik memiliki sifat gen
yang dimasukkan tersebut. Perhatikan Gambar berikut.

Kloning tumbuhan merupakan teknik perbanyakan tanaman melalui

kultur jaringan. Kloning dilakukan dengan menggunakan jaringan somatik
tumbuhan di dalam lingkungan aseptik yang terkontrol.

Tumbuhan memiliki sifat totipotensi . Pada tumbuhan, semua bagian selsel mudanya yang masih aktif misalnya ujung akar, ujung batang dan
meristem sekunder (kambium) merupakan sel yang totipoten.
Pada tahun 1950 Fred Steward melakukan kloning wortel dengan
menggunakan sel-sel yang berdifferensiasi dari jaringan pembuluh tumbuhan.
Sel-sel embrionik dapat tumbuh dan menghasilkan tumbuhan wortel baru.
Tanaman yang dihasilkan dari hasil kloning sama dengan induknya.
Kloning tumbuhan dapat dimanfaatkan untuk industri bibit. Manfaat kloning
tumbuhan antara lain dapat memproduksi bibit yang seragam, jumlahnya
banyak dalam waktu yang singkat. Dapat digunakan untuk perbanyakan
tanaman langka, tanaman jenis unggul dan tanaman bernilai ekonomis.

a. Pengertian Kloning Tumbuhan

Nama lain dari kloning pada tumbuhan adalah kultur jaringan, yaitu suatu teknik untuk
mengisolasi sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi
yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian
tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.
Secara singkat kloning pada sel tumbuhan (baik dari akar, batang, dan daun) bisa
dilakukan dengan cara memotong organ tumbuhan yang diinginkan. Lalu kita mencari eksplan,
mengambil selnya dan memindahkan ke media berisi nutrisi agar cepat tumbuh. Eksplan ini akan
menggumpal menjadi gumpalan yang bernama kalus. Kalus adalah cikal bakal akar, batang, dan
daun. Kalus kemudian ditanam di media tanah dan akan menjadi sebuah tanaman baru.
X-gal adalah molekul yang mirip galaktosa,
vektor biner Agrobacterium untuk transformasi tanaman , dengan hygromycin- dan
kanamisin - resistensi dan gen GUS

ELISA (Enzim Linked Immunosorbent Assay) adalah salah satu metode yang sensitif untuk
mendeteksi antibodi, antigen, hormon maupun bahan-bahan toksik