Isolasi & pemurnian

enzim
Fida M. Warganegara

1. Isolasi Enzim
Enzim yang merupakan salah satu bentuk protein

fungsional, diproduksi oleh sel untuk menjalankan

metabolisme sel tsb.
Untuk mempelajari kerja suatu enzim, pemurnian
enzim merupakan tahap awal yang penting dilakukan.

Struktur sel hewan

Figure 5-42
Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Figure 5-43
Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Mitokondria
Tempat produksi

ATP melalui
metabolisme
aerob
Terdiri atas:
Membran bagian luar

dan dalam.
Ruang antar membran
matriks

Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Figure 5-45

Sitosol
Bagian dari sel yang

terdapat di dalam
membran plasma, di
luar organel
Terdiri atas:
Sitoskeleton
poliribosom
Berbagai enzim metabolik

Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Figure 5-52

Kloroplas
Tempat berlangsungnya

fotosintesis di tanaman &

gangang hijau
Terdiri atas
Membran bagian luar
Ruang antar membran
Membran bagian dalam
stroma
Membran tilakoid
Lumen tilakoid

Figure 5-46
Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Tahap Isolasi & Pemurnian enzim

Kenali enzim target :
tempat?, golongan?;
sehingga dapat
ditentukan assay yang
akan dipilih, eg:
spektrofotometri
2. Sel harus dipecah
3. Pemisahan organel
4. Pemurnian enzim:
1.

Fraksinasi dengan
Amonium Sulfat
b) Dialisis
a)

Khromatografi:

a)
i.
ii.

iii.

1.

Khromatografi penukar
ion
Khromatografi
Penyaringan molekul
Khromatografi afinitas

Identifikasi enzim:
Elektroforesis:
a)
b)
c)

Native PAGE
SDS PAGE
Elektroforesis 2-D

2. Karakterisasi enzim:
a) Penentuan berat
molekul

Spektrofotometri

Cara penentuan kadar protein

secara spektrofotometri UV
Penyerapan pada panjang gelombang 280 nm atau

205 nm.

Residu-residu asam amino aromatik pada protein

menyerap kuat pada panjang gelombang 280 nm.

Asam nukleat memiliki serapan maksimum pada
panjang gelombang 260 nm. Karena itu penentuan
protein pada = 280 nm harus dikoreksi dengan
serapan pada = 260 nm

Kalau pada cuplikan pengotor asam nukleat terlalu

banyak, maka disarankan menggunakan = 200-210

nm, yang merupakan serapan maksimum akibat
adanya ikatan peptida.

Cara penentuan kadar protein

secara Kolorimetri
Metoda

Jangkauan

Volum

Penggangu utama

Biuret

1 10 mg

5 mL

Garam amonium

Lowry

2 -100 g

1 mL

Asam kuat,
amonium sulfat

Bradford

1-20 g (micro assay)

20- 200 g (macro assay

1 mL
5,5 mL

Bicinchonic acid

0,2-50 g

1 mL

Asam kuat,
amonium sulfat,
lipid

Koloid emas

20-640 ng

1 mL

Basa kuat

Hukum Lambert-Beer berlaku di semua analisis yang digunakan.

Prinsip analisis
Biuret:

Under alkaline conditions substances containing two or more

peptide bonds form a purple complex with copper salts in the

reagent.

Lowry :
Under alkaline conditions the divalent copper ion forms a complex

with peptide bonds in which it is reduced to a monovalent ion.

Monovalent copper ion and the radical groups of tyrosine,
tryptophan, and cysteine react with Folin reagent to produce an
unstable product that becomes reduced to molybdenum/tungsten
blue.

Bradford:
The assay is based on the observation that the absorbance

maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250

shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs.
Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form
of the dye, causing a visible color change. The assay is useful since
the extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is

Cara mekanik, cara enzimatis

PEMECAHAN SEL
1. Cara Mekanik:
-French Press
-Blender
-Homogenizer
(Potter Evehljem)
-Pestle- & mortar
( dgn N2 cair atau
pasir)

French
press

Pemecahan Sel (lanj)

2. Cara Enzimatis:
misal ( Lisozim, maserase, pekttinase), dll)
Lisozim:

Dinding sel

Sentrifugasi

Figure 5-23
Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Figure 5-24

Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

Pengendapan dengan garam, dialisis, khromtografi

2. Pemurnian Enzim
2.1 Fraksinasi dengan Amonium Sulfat:
2.2 Dialisis
2.3 Khromatografi:
2.3.1 Khromatografi penukar ion
2.3.2 Khromatografi penyaringan molekul
2.3.3 Khromatografi afinitas

Target kemurnian
Sangat tinggi (>99%), untuk

terapi
Tinggi (9599%), untuk studi
struktur
Sedang (<95%), untuk produksi
antibodi

Dialisis

Khromatografi

Fraksi-fraksi ditampung untuk dianalisis

Analisis fraksi

Adanya protein di tiap

fraksi yang ditampung

dapat diikuti dengan cara
spektrofotometri
Adanya enzim atau protein
aktif lain dapat diikuti
dengan menentukan
keaktifannya.
Untuk itu sangat penting
dirumuskan diawal
pemurnian, cara identifikasi
keaktifan protein target

Peyetimbangan

Pengisian
sampel

Elusi
gradien

Pencucian

Penyetimbangan
ulang

Daya
hantar

Molekul target

Molekul
terikat
kuat

Molekul
tak terikat
Injeksi
sampel

2cv

10-20cv

4cv

2cv

Volume kolom (cv)

Peyetimbangan

Pengisian
sampel

Elusi

Mr tinggi

Penyetimbangan
ulang

Mr rendah

Mr antara
Injeksi
sampel

1cv

Volume kolom (cv)

Kromatografi
afinitas

Penyetimbangan

Pengisian
sampel

Adsorpsi
sampel

Pencucian
materi tak
terikat

Elusi
protein

Regenerasi
gel

Ganti bufer
pengelusi

Injeksi
sampel

1-2cv

xcv

1-2cv

>1cv

1-2cv

Volume kolom (cv)

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis

Evaluasi kemurnian

Isoelectric-focusing