ANALISA BAHAN TAMBAHAN PANGAN DAN

BAHAN KIMIA LAIN DALAM PANGAN

ANALISA PANGAN
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan
Universitas Sebelas Maret (UNS) Surakarta
Dosen :
Danar Praseptiangga, S.TP., M.Sc., Ph.D.

Why do we analyze it ?
Additives or Preservatives
Old-time preservatives
unwanted side
effect
Limit of total intake & ensuring an adequate
control of the concentration of allowed
preservatives
IMPORTANT & STRICT !
List of food preservatives permitted for direct
addition to food for human consumption

has to be informed ! (IMPORTANT)

CHEMICAL PRESERVATIVES
A. Sorbic acid, Benzoic acid, P-Hydroxybenzoic esters
(Parabens), Dehydroacetic acid
B. Sulfur dioxide and sulfites
C. Nitrite and Nitrate
D. Biphenyl (diphenyl) and orthophenylphenol and its
sodium salt
E. Antibiotics
F. Other preservatives
Hexamethylene tetramine (hexa), dimethyl dicarbonate,
boric acid (sodium tetraborate), propinic acid, quartenery
ammonium salts, EDTA, stannous chloride
G. Antioxidants
H. Erythorbic acid

Asam Benzoat
Asam benzoat (2,4-hexadienoic acid) banyak digunakan pada jus
buah, keju, kue dan roti, dan berbagai produk pangan lainnya
sebagai bahan pengawet.
Sifatnya dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme
khususnya jamur, penggunaannya sedikit, aman jika ditambahkan
pada bahan pangan atau makanan, dan mempunyai efek treshold
tinggi.
Persyaratan yang ada untuk kecap dan minuman ringan
maksimum 600 mg/kg, acar ketimun dalam botol, margarin,
pekatan sari nanas (jam, jelly), saus tomat, dan makanan lainnya
1 g/kg.

Preparasi sample

Cara I (FAO, 1986)

Umum
1) bahan berbentuk padatan atau semi padatan digiling sampai lembut
dan homogen
2) ambil sampel (150 ml atau 150 g), pindahkan ke dalam labu takar
500 ml
3) tambahkan sedikit garam NaCl
4) tambahkan pula sedikit larutan 10% NaOH
5) tambahkan larutan NaCl jenuh sampai volume total mendekati 500
ml
6) campur dengan baik, diamkan pada suhu kamar selama kurang
lebih dua jam
7) aduk kemudian saring dengan kertas saring Whatman, kumpulkan
filtratnya
8) tambahkan beberapa milliliter larutan 10% NaOH
9) ekstraksi dengan eter, kumpulkan fase organiknya
10)uapkan pelarut eter dengan rotary evaporator, kumpulkan
residunya.

Bahan mengandung garam

1)

bahan berbentuk padatan atau semi padatan digiling sampai

lembut dan homogen
2) ambil sampel (150ml atau 150g), pindahkan ke dalam labu takar
500 ml
3) tambahkan air, tambahkan pula sedikit larutan 10% NaOH
4) tambahkan larutan NaCl jenuh sampai volume total mendekati
500ml
5) campur dengan baik, diamkan pada suhu kamar selama kurang
lebih dua jam
6) aduk kemudian saring dengan kertas saring Whatman,
kumpulkan filtratnya
7) netralkan dengan larutan 0,01 N HCl
8) tambahkan 5 ml HCl yang sama
9) ekstraksi dengan kloroform (70 ml / 100 ml filtrat), pisahkan fase
kloroform, jika terjadi emulsi lakukan pengadukan dengan gelas
pengaduk
10) uapkan kloroform dengan rotary evaporator dan kumpulkan
residunya.

Bahan mengandung alkohol

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)

sampel bahan (250 ml atau 250 g) ditambah sedikit larutan 10%

NaOH sampai bersifat alkali (cek dengan kertas lakmus)
panaskan pada penangas uap sampai volumenya tinggal 100 ml
pindahkan ke labu takar 250 ml, tambahkan kristal garam,
campur dengan baik sampai jenuh
encerkan dengan larutan NaCl jenuh sampai 250 ml
biarkan pada suhu kamar selama kurang lebih dua jam
gojog kemudian saring dengan kertas saring Whatman,
kumpulkan filtratnya
ekstraksi dengan pelarut organik seperti pada preparasi sampel
(i) atau (ii), kumpulkan residunya

Prosedur analisis
larutkan sampel berbentuk residu dari penguapan pada
prosedur preparasi sampel dalam dietileter secukupnya
periksa pada spektrofotometer pada panjang gelombang 272
nm
cocokan hasilnya dengan kurva standar asam benzoat murni
dengan konsentrasi bervariasi.

Cara II (FAO, 1986)










sampel bahan (30-300 ml atau 30-300 g) dimasukkan

dalam labu destilasi
tambahkan aquades secukupnya, NaCl 40 g / 100ml
sampel, dan sedikit asam fosfat
segera lakukan destilasi uap, tampung destilatnya
pada penampung yang berisi 10 ml 0,1 N NaOH
hentikan destilasi jika telah memperoleh 25-50 ml
destilat
cuci kondenser dengan 25 ml 0,1N NaOH,
campurkan cucian ini pada destilat
uapkan destilatnya pada penangas uap sampai
volumenya tinggal 20 ml
tambahkan larutan 5% kalium permanganat sampai
warnanya pink
tambahkan natrium sulfit sampai warna pink hilang

 tambahkan larutan encer asam sulfat untuk melarutkan

endapan permanganat oksida dan membuat larutan menjadi
asam
 tambahkan garam NaCl sampai larut menjadi jenuh
 ekstraksi dengan 4 x 15 ml eter atau petroleum eter,
kumpulkan fase pelarut organiknya
 uapkan pelarut organiknya dengan rotary evaporator,
kumpulkan residunya
 larutkan lagi dalam dietil eter
 periksa pada spektrofotometer pada panjang gelombang 272
nm
 cocokan hasilnya dengan kurva standar asam benzoat murni
dengan konsentrasi bervariasi.

p - Hidroksi benzoate
p-Hidroksi benzoat (sering disebut paraben) fungsinya dapat
menggantikan asam benzoat.
Persyaratan untuk acar ketimun dalam botol 250 mg/kg, ekstrak
kopi cair 450 mg/kg, dan pasta tomat 1 g/kg

Prosedur analisis
timbang 10 g sampel bahan, dan giling sampai lembut
tambahkan 5 ml 10% asam sulfat dan kristal garam natrium sulfat
(Na2SO4) secukupnya
campurkan dengan sampel sampai benar-benar homogen dan kering
tambahkan kristal natrium sulfat secukupnya
giling lagi sampai homogen
tambahkan eter, aduk dengan baik
saring dengan kertas saing, kumpulkan fltratnya
uapkan eternya pada suhu kamar, larutkan residunya pada 0,5 ml
etanol
ambil 20 l dengan syringe, spotkan pada pelat lapis tipis gel silika G,
spotkan juga standar larutan 2% etil-, metil-, dan propil-para-hidroksi
benzoat dalam etanol
kembangkan pada pelarut campuran toluen, metanol, asam asetat
kering anginkan, periksa di bawah sinar ultra violet, jika terdapat parahidroksi benzoat ditandai warna hitam
periksa dengan TLC scanner untuk menentukan Rf dan jumlah
(konsentrasi) nya.

Garam benzoate
Dalam praktek, penggunaan garam benzoat (natrium benzoat,
kalium benzoat) lebih banyak daripada penggunaan asam
benzoat atau p-hidroksi benzoat.
Garam benzoat juga banyak dipakai untuk mengawetkan jus
buah sebagai anti yeast dan anti jamur.

Prosedur analisis
(Bennet and Petrus, 1977)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)

Sampel ditimbang secukupnya, dihomogenisasi menggunakan

blender dengan ditambah aquades kurang lebih 100 ml
Sentrifugasi, buang padatannya
Supernatan disaring dengan kertas Whatman no. 1, filtratnya
dikumpulkan pada labu takar 100 ml
Encerkan dengan larutan 0,225 M KH2PO4 menjadi 100 ml
Pindahkan 10 ml dengan pipet ke dalam gelas Erlenmeyer,
tambah 10 ml larutan 1 N HCl
Ekstrak dengan campuran metilsikloheksana dengan pentana
dengan perbandingan 10:4
Pisahkan fase organiknya
Periksa menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
226 nm
Cocokkan dengan kurva standar larutan natrium benzoat dalam
0,225 M KH2PO4 konsentrasi 0-0,1% w/v

Nitrat
Garam nitrat banyak digunakan pada pengolahan daging untuk
beberapa tujuan, yaitu memberikan warna merah pink pada
produk,
meningkatkan
treshold,
dan
menghambat
pertumbuhan bakteri khususnya Clostridium botulinum serta
produksi toksinnya yaitu botulinin.
Pemakaiannya sering bersama-sama dengan garam nitrit.
Sebagai bahan pengawet penggunaannya dibatasi, untuk keju
maksimum 50 mg/kg, daging 500 mg/kg.

Cara I: metoda gravimetri (Garratt, 1979)

Prosedur ini diadopsi dari pemeriksaan kadar nitrat pada obatobatan
sampel bahan dilembutkan, ditimbang dan dipindahkan ke
Erlenmeyer
tambahkan 100 ml aquades, tutup dan goyang-goyang pada shaker
selama 3 menit
saring, kumpulkan filtratnya pada labu takar 100 ml
jadikan volume filtrat tepat 100 ml dengan menambahkan aquades
ambil 10 ml, tambah 70 ml aquades dan 1 ml asam asetat glasial
panaskan sampai hampir mendidih
tambahkan 7 ml larutan 10% nitron, aduk dengan baik
dinginkan dan tempatkan pada air dari es yang mencair selama 2
jam
saring dengan menggunakan kertas saring Whatman no. 2
cuci endapan yang tertingal dengan 5 ml air es, ulangi sekali lagi
keringkan kertas saring dengan endapan yang tertinggal pada suhu
105oC sampai berat konstan. Residu 1 g setara dengan 0,2693 g
KNO3.

Cara II: metoda spektrofotometri (Garrat, 1979)

Sampel bahan 5 g (atau 5 ml) ditempatkan pada labu
destilasi
tambahkan 15 ml Larutan 85% w/w asam sulfat dan 1 ml
Larutan 5% 2,4-xylenol dalam asam asetat glasial
campur dengan baik pada 35oC dan pertahankan pada
suhu tersebut selama 30 menit
tambahkan 100 ml aquades
lakukan destilasi, tampung destilatnya pada 10 ml larutan
2N NaOH
sebanyak 40ml destilat harus terkumpul dalam waktu tidak
lebih dari 15 menit, lalu hentikan destilasi
periksa pada spektrofotometer dengan menggunakan
panjang gelombang 437 nm
cocokkan dengan kurva standar larutan natrium nitrat yang
dipreparasi dengan cara yang sama.

Nitrit
Garam nitrit banyak digunakan pada pengawetan daging,
fungsinya sama dengan garam nitrat.
Batas maksimum residu nitrit dalam bahan pangan atau makanan
menurut Peraturan Menteri Kesehatan RI 1987 adalah untuk
daging 125 mg/kg dan kornet kaleng 50 mg/kg.

Prosedur analisis
Cara I (Pearson and Tauber, 1984; Garrat, 1979)
sampel daging (20 g) diblender dengan ditambah
sedikit larutan 0,1N NaOH panas
pindahkan ke gelas Erlenmeyer 500 ml yang
mempunyai tutup kaca, cuci blendernya dengan air
panas dan campuran air cucian ini ke gelas
Erlenmeyer tersebut
tambah larutan 0,1 N NaOH sampai volumenya
mendekati 300 ml, tutup
panaskan pada suhu 80oC selama dua jam, sekali-kali
lakukan penggojogan
tambahkan 5 ml larutan merkuri klorida jenuh, campur
dan dinginkan pada suhu kamar

 saring dengan kertas Whatman, tampung filtratnya

dengan labu takar 500 ml, encerkan dengan air dan
gojog sampai homogen
pipet 2 ml, masukkan ke dalam labu takar 50 ml yang
sudah dimasukkan ke dalamnya reagen Griess (1 ml
asam sulfanilat dan 1ml reagen -naftilamin)
encerkan dengan air sampai volumenya 50 ml,
campur dengan baik, kemudian diamkan selama satu
jam
periksa dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 520 nm, dengan blangko larutan reagen
Griess dalam aquades
Cocokan dengan kurva standar yang dibuat seperti
pada analisis garam nitrat dengan menggunakan
garam nitrit

Preparasi kurva standar unuk analisis nitrit

Larutkan 0,493 g NaNO3 dalam 1000 ml aquades, larutan ini
mengandung 0,01 NO2-N/ml
Siapkan 5 gelas Erlenmeyer, isi masing-masing dengan 0 ml, 1 ml,
2 ml, 3 ml, 4 ml, dan 5 ml larutan garam nitrat
Tambahkan aquades sampai masing-masing volumenya 20ml,
tambahkan sedikit larutan 0,1N NaOH panas
Selanjutnya perlakukan seperti prosedur untuk sampel, no. 2 dan
seterusnya
Plot data absorban versus konsentrasi nitrit, pada sumbu X
sebagai konsentrasi nitrit dan sumbu Y sebagai absorban

Cara II (Garrat, 1979)

Sampel daging diblender dengan ditambah air secukupnya
Saring dengan kertas saring, kumpulkan filtratnya
Panaskan campuran 50 ml larutan 0,1N kalium permanganat
dan 5ml larutan asam sulfat pekat, dan 100 ml aquades,
kemudian titrasi dengan filtrat daging sampai warna
permanganat hilang, cocokkan dengan standar
Lakukan titrasi sekali lagi dengan mengganti filtrat daging
dengan larutan 0,1 N NaNO3 untuk standar,
1 ml 0,1 N larutan nitrit = 0,003450 g NaNO3.

Asam Sorbat
Asam sorbat (2,4-hexadionic acid) banyak digunakan sebagai
pngawet pada pengolah jus buah, keju, bakeri, dan berbagai
produk pangan lainnya.
Asam sorbat mempunyai sifat anti mikroorganisme khususnya
jamur, aman sebagai bahan tambahan makanan (BTM),
penggunaannya sedikit (efektif), dan mempunyai efek treshold
tinggi.
Ambang batas menurut Paturan Menteri Kesehatan RI Tahun
1987 adalah 3 g/kg untuk keju, 500 mg/kg aprikot kering dan
marmalade, dan 1 g/kg untuk jenis makanan lainnya.

Prosedur analisis
(Vidyasagr and Arya, 1983)
Jus buah ditimbang secukupnya, untuk sampel keju cukup
2 g, diperkirakan mengandung 1-2 mg asam sorbat,
pindahkan ke dalam labu destilasi
Tambah 50 ml larutan 0,1N H2SO4 dan 50 g MgSO4
Lakukan destilasi uap, kumpulkan 350 ml destilat
Atur pH nya menjadi 5,0 dengan larutan NaOH atau HCl
Encerkan menjadi 500 ml
Periksa absorbansinya menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang 258 nm
Cocokkan dengan kurva standar

Formaldehida
Formaldehida sering dinamakan formalin adalah senyawa
golongan aldehida sering digunakan pada pengolahan pangan
sebagai bahan pengawet karena daya pembunuhnya terhadap
bakteri dan mikroorganisme lainnya sangat tinggi.
Formaldehida dengan protein akan bereaksi membentuk suatu
senyawa baru yang bersifat lentur, dan oleh karenanya dalam
beberapa hal formaldehida digunakan untuk memperbaiki sifat
fisik bahan pangan seperti pada pengolahan mi atau tahu dan
beberapa produk makanan lainnya.
Meski pun demikian penggunaan formaldehida yang berlebihan
akan sangat membahayakan kesehatan. Senyawa ini dapat
menimbulkan kematian.
Berdasarkan
Peraturan
Menteri
Kesehatan
RI
No.
722/MEN.KES/PER/IX/88 tanggal 20 September 1988, formalin
dilarang untuk digunakan sebagai bahan pengawet makanan.

Prosedur analisis
(FAO, 1980)

Sampel ditimbang kurang lebih 10-20 g, kemudian dimasukkan

dalam labu destilasi
Tambahkan 200 ml aquades
Tambahkan 5 ml larutan 10% asam ortofosfat (H3PO4). Jika
kondisinya belum asam, tambahkan sedikit lagi larutan asam
ortofosfatnya.
Pasang pada unit destilasi, masukkan ujung kondensernya pada
air yang diisikan pada penampung.
Mulailah melakukan destilasi secara perlahan-lahan sampai
memperoleh destilat kurang lebih 90 ml
Encerkan destilat menjadi 100 ml tepat
Pindahkan 1 ml destilat ke dalam tabung reaksi bertutup,
tambahkan 5 ml larutan asam kromotropat. Campur dengan baik,
kemudian tutup tabung reaksinya.

Panaskan pada penangas air selama 15 menit

Biarkan 30 menit pada suhu kamar supaya menjadi dingin
Periksa pada spektrofotometer pada panjang gelombang 565
nm dan catat absorbansinya
Buat kurva standar dengan menggunakan larutan formaldehida
0-15 g/ml
Hitung kadar formaldehida dalam 1 ml destilat dengan
mencocokkan absorbasinya dengan kurva standar
Hitung kadar formaldehida dalam bahan sebagai berikut

( g / ml ) * 100
Formaldehi da =
g / g
w
di mana w adalah berat bahan (sampel) yang diuji dalam gram

Preparasi larutan standar formaldehida :

Timbang 1 g formaldehida
Larutkan dengan aquades sehingga volumenya tepat 1000 ml
Ambil 100 ml pengenceran, tambahkan 25 ml 0,1M NaOH dan
10 ml larutan 3% H2O2 netral
Tutup wadahnya dan panaskan pada penangas uap selama 5
menit. Sekali-kali diaduk
Dinginkan pada suhu kamar, kemudian titrasi dengan larutan
asam klorida
Kadar formaldehida dalam larutan standar adalah :

1000
25 A
Formaldehi da =
x 30 ,0264 g / l
x 0,1x
100
1000
di mana A adalah jumlah larutan asam yang digunakan untuk titrasi.

Cemaran Logam Berat

Penentuan merkuri pada ikan (Bache et al., 1971)
Siapkan kertas Whatman 41, potong-potong menjadi ukuran
1,5 inci2
Tempatkan tumpang tindih pada gelas arloji
Timbang 1 g daging ikan yang sudah dilembutkan pada gelas
arloji yang ada potongan kertas saringnya tersebut
Ratakan daging ikan di atas kertas saring
Biarkan selama 3 jam
Masukkan dalam desikator yang berisi H2SO4 pekat.
Hampakan desikator dengan menyedot udaranya sehingga
tekanan di dalamnya tinggal 2 cmHg
Ambil gelas arloji berisi contoh
Ambil kertas saring yang paling bawah, letakkan di atas contoh
Secara hati-hati, lipat kertas saring tersebut bersama contoh
sehingga terbentuk gulungan kecil atau persegi
Masukkan ke dalam suatu wadah
Tambahkan 100 ml 0,2 N HCl dan 10 ml 0,02 M KMnO4

 Panaskan sambil diaduk

Saring dengan kertas Whatman 41. Tampung filtratnya pada
corong pemisah
Cuci bekasnya dengan 50ml 0,2N HCl. Campurkan air cuciannya
pada filtrat
Tambahkan 5ml 20% hidroksiamin-HCl, campur baik-baik selama
1 menit
Biarkan 10 menit
Tambahkan 10ml larutan dithizone (4mg/l CHCl3), campur baikbaik selama 10 menit
Diamkan sampai terjadi dua fase yang memisah
Ambil fase CHCl3 nya
Periksa pada spektrofotometer pada panjang gelombang 490nm.
Buat kurva standar dengan prosedur yang sama. Gunakan
larutan dithiozon sebagai standarnya
Hitung kadar merkuri dalam bahan dengan mencocokkan dengan
kurva standar

Penentuan logam arsen (Fries and Getrost, 1977)

Encerkan sampel sampai 40ml ke dalam generator arsen
Tambahkan 10ml larutan asam staniumklorida (0,33g
SnCl2.2H2O dalam 100ml 32% HCl)
Tambahkan 5ml larutan 15% potasium iodida
Diamkan selama 15 menit
Tambahkan 1ml larutan 20% tembaga sulfat dan 8g granula
seng (Zn)
Segera tutup alat dengan tabung absorber yang berisi 3000ml
larutan reagen (1000 perak dietilditiokarbamat dicampur
dengan piridin sampai volumenya tepat 200ml)
Hentikan reaksi setelah satu jam, dan periksa pada
sektrofotometer pada panjang gelombang 540nm dan catat
absorbansinya

Analisis Senyawa Tannin

Ditimbang 5 gr sampel halus dan ditambah 400 ml aquades

didihkan selama 30 mnt
dinginkan
encerkan sampai
tepat 500ml
disaring
filtrat(-1)
Dipipet 10ml filtrat(-1) ditambah 25ml lart indigo-karmin (6gr
Na-indigotin-disulfonat + aquades
500ml
panaskan

dinginkan + 50ml as.sulfat + aquadest sampai 1Lt
disaring)
dan 750ml aquades. Kmd dititrasi dng lart 0.1N KmnO4 sampai
warna kuning emas
misal A ml
Diambil 100ml filtrat-1 ditambah 50ml lart gelatin (25gr gelatin +
500ml NaCl jenuh)
panaskan sampai larut
tambah 1000ml
NaCl jenuh) kmd di + 100ml lart garam-asam + 10gr kaolin
bubuk
gojog kuat-kuat bbrp menit
disaring
filtrat(-2)

 Dipipet 25ml filtrat (-2)
ditambah 25ml lart

indigokarmin dan 750ml aquades, kmd dititrasi dng lart
0.1N KmnO4
misal = B ml
Standardisasi Lart KMnO4 dng Na-oxalat

1 ml KMnO 0.1 N ~ 0.00416 g tannin
(50A 50B) x N/0.1 x 0.00416
Kadar tannin =

x 100%
5
[ N = normalitas KMnO4 ]

Analisis Kafein
Kafein, memiliki rumus C8H10N4O2 dgn BM= 194.19 ;
tdpt dlm bahan alami daun teh, biji kakao, biji kopi,
dan biji kola.
Kafein menstimulir syaraf dan jantung ttp memiliki
efek samping rasa gelisah, sulit tidur (insomnia), dan
denyut jantung tak beraturan (berdebar).
Satu gram kafein akan larut dlm : 1,5 ml air 100oC; 5.5
ml air 60oC; 46 ml air 25oC; 5,5 ml khloroform; 22 ml
alkohol 60oC; 66 ml alkohol 25oC; 50 ml aseton; 100
ml benzen; 530 ml eter.

ANALISIS KAFEIN - Cara Bailey-Andrew

Ditimbang 5g sampel halus (30 mesh) ke dlm erlen-meyer

+ 5g MgO + 200 ml aquades
Pasang pendingin balik
didihkan pelan-pelan 2 jam

dinginkan kmd encerkan shg tepat 500ml
disaring
Dipindahkan filtrat 300ml ke labu godog + 10ml As.sulfat
(1:9)
didihkan sampai volume tinggal 100ml
Cairan dimasukkan corong pemisah
labu godog dibilas
as.sulfat (1:9) dan digojog berkali-kali dng khloroform
berturutan menggunakan 25, 20, 15, 10, 10, dan 10ml .
Semua cairan dimasukkan ke corong pemisah, kmd
ditambah 5ml KOH 1%
digojog dan dibiarkan sampai
cairan terpisah jelas
cairan bag bawah dikeluarkan ke
dlm erlenmeyer (=1)

 Corong pemisah ditambah lagi 10ml khloroform

digojog
dibiarkan sampai terpisah jelas
cairan
bawah dikeluarkan dicampur dgn (=1). Pencucian
diulang 1x lagi
Larutan dlm khloroform (=1) diuapkan solven-nya
pd water-bath shg tinggal residunya
dikeringkan
dlm oven 100oC sampai bobot konstan (~ bobot
kafein kasar)
Kadar kafein murni ditentukan dng analisis kadar N
secara mikro Kjeldahl atau cara-cara lain
Perhitungan :
Kafein dlm bahan = gr N x 3.464 x (500/300)

EVALUASI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

Metode-Metode Pengujian
1. Conjugated Diena (Diena Terkonjugasi)
Prinsip :
Hidroperoksida dan produk-produk degradasi lipida lain
menunjukkan karakteristik absorpsi UV pada 232234nm karena adanya conjugated diena. Karena lipida
awal tidak memiliki absorpsi pada panjang gelombang
tsb., maka tingkat absorbansi itu dapat mencerminkan
tingkat peroksidasi lipida yang diuji.

 Cara: asam linoleat atau minyak ditambahkan sample

antioksidan (dan kontrol) diinkubasi pada suhu tertentu.
Setelah itu diambil sedikit, dilarutkan dalam cyclohexane,
setelah di-vortex langsung ditera absorbansinya pada
232-234nm. Makin tinggi absorbansi dianggap makin
tinggi tingkat kerusakan oksidatif minyak tersebut.
Kelebihan: pengukuran absorpsi UV amat sederhana dan
mudah.
Kekurangan/ kelemahan: banyak zat/bahan-bahan
biologis termasuk antioksidan menunjukkan absorpsi yang
kuat juga pada panjang gelombang tsb.

2. Konsumsi Oksigen
(Oxygen consumption, Oxygen up take)

Prinsip: pada waktu lipida mengalami oksidasi, molekul oksigen

tertambahkan pada lipida. Minimal ada 2 metode untuk
mengestimasi konsumsi oksigen:
1. Pengukuran konsentrasi O2 yang menurun dlm larutan atau
atmosfer dlm sistem tertutup dengan alat, mis., elektroda
oksigen untuk mengukur konsentrasi O2 dlm larutan aqueous,
atau alat pengukur tekanan untuk mengukur tekanan O2
atmosfer campuran reaksi.
Kelebihan: mudah dan adaptable. Sensitivitas tinggi (jika
pengendalian ketat)
2. Pengukuran berat total lipid dalam sistem terbuka (Weight
gain method)
Kelebihan : amat sangat simple dan mudah.
Kelemahannya: perlu waktu relatif lama.

3. Angka Peroksida (Peroxide Value, POV)

Prinsip:
Hidroperoksida menunjukkan sifat oksidatif, sehingga reaksi redoks
dapat digunakan untuk menkuantifikasi hidroperoksida yang ada.
Misalnya, LOOH mengoksidasi I- dan Fe2+ menjadi I2 dan Fe3+.
ROOH + 2KI
ROH + K2O
ROOH + Fe2+
ROH + Fe3+
Jumlah I2 dapat dikuantifikasi misalnya dengan titrasi menggunakan
Natrium tiosulfat
I2 + I-
I3I2 + 2Na2S2O3
N2S4O6 + 2NaI
Jumlah Fe3+ dapat diukur dengan absorbansi Fe(SCN)3 pada 500nm
(disebut Thiocyanate method)
Fe3+ + 3NH4SCN
Fe(SCN)3 + 3NH4+
Kelebihan: jumlah tepat hidroperoksida dapat ditentukan.

Metode TBA (paling populer)

Prinsip: malonaldehida (MDA) terbentuk terutama pada
pemanasan hidroperoksida dan produk degradasi sekunder pada
pH rendah. TBA bereaksi dengan MDA menghasilkan senyawa
kompleks berwarna merah dengan absorbansi pada 535nm.
Kelebihan: simple dan relatif tinggi sensitivitasnya (shg sering
digunakan dalam pengujian dengan sistem biologis)
Kelemahan: Angka TBA tidak secara langsung menunjukkan
jumlah MDA atau lipid hidroperoksida yang terbentuk selama
oksidasi. Karena kemungkinan ada senyawa-senyawa dalam
campuran tersebut yang dengan TBA menghasilkan warna merah.
Oleh karena itu angka TBA sering disebut angka TBARS
(thiobarbituric acid reactive substances).

BAGAIMANA CARANYA?
Pengujian pada sistem Liposome
Target aplikasi antioksidan sekarang ini bergeser dari
sebagai food ingredient ke tujuan-tujuan kesehatan.
Karena diketahui bahwa banyak penyakit-penyakit
degeneratif termasuk kanker, penuaan, dan katarak
berhubungan dengan oksidasi komponen-komponen
seluler.
Untuk tujuan kesehatan, antioksidan diperlukan dapat
bekerja dalam biomembrane, mis: membran plasma,
membran mitokondria dll.
Karena LIPOSOME merupakan suatu fosfolipid bilayer
sederhana maka dapat digunakan sebagai biomembran
model untuk suatu pengujian aktivitas antioksidan

1. METODE
Preparasi Liposome
Gunakan lecithine (biochemical grade) dari telur.
100mg lecithine larutkan dalam 1ml kloroform.
Larutan dalam labu (ber-dasar bulat) dievaporasi dengan gas
N2, kemudian dengan pompa vakum sehingga menghasilkan
suatu lapisan tipis fosfolipid pada permukaan bagian dalam
labu.
Tuangkan 10mL 10mM Natrium fosfat buffer (pH 7,4) ke dalam
labu, kemudian disonikasi dalam sonicator ultrasonic sehingga
terbentuk MLV (Multi Lamelar Vesicle).
MLV dipindah ke botol ukuran 20 mL digelembungi dengan gas
N2 selama 30 detik, dan disonikasi pada 100 watt selama 10
minute (kondisi sonikasi mungkin berbeda kalau alat berbeda).
Sample harus disonikasi sampai larutan MLV yang seperti susu
menjadi suatu larutan SUV (small unilamellar vesicle) yang
transparen.

2. Inkubasi Liposome
Larutan SUV (10mg/mL) dicampur dengan sample uji,
encerkan dengan 10mM natrium fosfat buffer (pH 7,4) sampai
konsentrasi akhir liposome 1mg/mL.
Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37C selama 2 jam
pada kondisi aerobik.

3. Pengukuran angka TBARS

1 mL campuran reaksi, 0,1mL 1% larutan BHT dalam metanol,
dan 2mL larutan TBA (15% W/V TCA, 0,375% TBA, dan 0,25 N
HCl) dicampur.
Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam water bath
selama 15 menit.
Sentrifugasi pada 1500rpm, 10 menit.
Tera absorbansi pada 535nm.
Nilai TBARS dapat dihitung menggunakan coeff extinction 1.56 X
10-5 M-1Cm-1
Ukur juga absobansi kontrol (liposome yang tak diberi perlakuan).

Metode-metode lain
DPPH
Beta carotene bleaching method (Metode
pemucatan -karoten)
Komposisi asam-asam lemak (Gas chromatography)
Angka iodin
Rancimat
Oven schaal method
AOM (Active Oxygen Method)

Uji Aktivitas Antioksidan Metode DPPH

(2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazyl)
DPPH adalah radikal bebas yang stabil dalam larutan berair
atau larutan metanol serta memiliki serapan yang kuat pada
panjang gelombang 515 nm dalam bentuk teroksidasi.
DPPH mampu menerima elektron atau radikal hidrogen dari
senyawa lain sehingga membentuk molekul yang stabil.

Stuktur kimia DPPH

 Uji aktivitas antioksidan dilakukan pada sampel yang

diduga mempunyai aktifitas sebagai antioksidan.
Terdapat beberapa metode untuk menentukan aktivitas
antioksidan,
diantaranya
DPPH
(2,2-difenil-1pikrilhidrazil), Cupric Ion Reducing Antioxidant
(CUPRAC) dan Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP).
Metode DPPH dipilih karena memiliki beberapa
keunggulan, diantaranya sederhana, cepat, sensitif, dan
hanya membutuhkan sedikit sampel

 Metode DPPH merupakan metode uji aktivitas

antioksidan yang paling banyak dilakukan.
Prinsip metode uji antioksidan DPPH didasarkan
pada reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari
senyawa antioksidan. DPPH berperan sebagai radikal
bebas yang diredam oleh antioksidan dari sampel.
Selanjutnya DPPH akan diubah menjadi DPPH-H
(bentuk tereduksi DPPH) oleh senyawa antioksidan.
DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil
dan dapat disimpan dalam jangka waktu lama dalam
keadaan kering dan kondisi penyimpanan yang baik

 Metode DPPH dapat memberikan informasi mengenai

reaktifitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal yang
stabil.
Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi
berpasangan yang kemudian menyebabkan perubahan
warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang
diambil

 DPPH hanya dapat mengukur senyawa antioksidan yang

terlarut dalam pelarut organik khususnya alkohol.
DPPH secara luas digunakan untuk mengukur dan
membandingkan aktifitas antioksidan senyawa-senyawa
fenolik, dan evaluasi aktivitas antioksidan melalui
perubahan serapan yang terjadi.
DPPH harus secara hati-hati diinterpretasikan setelah
direaksikan dengan senyawa antioksidan karena dapat
didegradasi oleh cahaya, oksigen, pH, dan jenis pelarut.
Metode DPPH dapat digunakan untuk screening
berbagai
sampel
dalam
penentuan
aktivitas
antioksidannya

 Pengukuran absorbansi DPPH dapat dilakukan pada

kisaran panjang gelombang 515-520 nm.
Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel padatan
maupun larutan dan tidak spesifik untuk komponen
antioksidan partikular, tetapi dapat digunakan untuk
kapasitas antioksidan secara keseluruhan pada suatu
sampel