ENZIM KLOROFILASE

(Chlorophyllase)

Mata Kuliah Teknologi Enzim

(Revisi)

Oleh :
Siti Nur Avida

(101810301010)

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2015

I.

PENDAHULUAN
1.1 Enzim Klorofilase
Enzim merupakan suatu protein yang berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia.
Enzim memegang peranan dalam berbagai kehidupan baik dibidang laboratorium
atau bidang industri. Perkembangan enzim sebanding dengan adanya perkembangan
teknologi enzim. Mata kuliah teknologi enzim mempelari tentang enzim dan
pengaplikasiannya sebagai dasar pengembangan pemanfaatan enzim.
Enzim berfungsi sebagai katalisator yang mampu mengkatalisis suatu reaksi,
sehingga proses reaksi berlangsung lebih cepat. Hal ini karena setiap enzim memiliki
daya katalitik yang tinggi yang digambarkan melalui aktivitasnya dan dapat
menurunkan energi aktivasi selama proses reaksi. Aktifitas enzim dipengaruhi
beberapa faktor antara lain, pH, suhu, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, dan
inhibitor (Lehninger, 1982).
Salah satu enzim yang memiliki manfaat penting dalam kehidupan adalah
enzim klorofilase. Enzim klorofilase berperan dalam metabolisme daun yaitu proses
fotosintesis. Selain itu, enzim klorofilase digunakan pada industri minyak yaitu
sebagai agen bleaching pada minyak sayur dengan cara menghilangkan senyawa
klorofilnya (Khamessan, dkk., 1976).
Enzim Klorofilase ditemukan pertama kali oleh Wilstater dan Stoll pada tahun
1910. Klorofilase merupakan salah satu enzim yang berperan penting dalam
metabolisme dalam daun. Klorofilase dapat ditemukan dalam membrane tilakoid
kloroplas dan etioplas pada tanaman tinggi, lumut, dan ganggang. Peran klorofilase
dalam mendegradasi klorofil dapat dilihat saat terjadi perubahan warna hijau menjadi
warna kuning atau coklat, hal ini terjadi pada perubahan warna buah, bunga, daun.
Hal ini terjadi karena enzim klorofilase dapat hidrolisis klorofil menghasilkan
klorofilade dan fitol. Selain itu juga berperan dalam reaksi hidrolisis karboksilat ester.
Enzim klorofilasi bekerja pada kondisi optimal yaitu pH 8,5 dan suhu 50 C. Paper ini

menjelaskan tentang klasifikasi, struktur, mekanisme, isolasi, purifikasi dan

karakterisasi, dan bioinformatika enzim klorofilase.
II. PEMBAHASAN
2.1 Tata Nama
Enzim klorofilase memiliki nomor pengklafisian secara internasional yaitu EC
Number 3.1.1.14 dengan nama Chlorophyllase, selain itu disebut Chlase, Chlorophyll
chlorophyllido-hydrolyase,

dan

Chlorophyll-chlorophyllidohydrolase.

Secara

klasifikasi, enzim klorofilase memiliki nomer EC 3.1.1.14 . EC 3. artinya masuk

dalam klas hidrolase. EC 3.1. artinya memotong ikatan ester. EC 3.1.1 artinya mampu
menghidrolisis ikatan karboksilat ester. EC 3.1.1.14 artinya spesifik enzim
klorofilase. Enzim ini temasuk dalam kelas hidrolase yaitu enzim yang menkatalisis
reaksi enzimatis dengan melibatkan H2O.

Gambar 1. Klasifikasi enzim klorofilase

2.2 Sruktur dan Mekanisme Reaksi
Struktur 3D enzim klorofilase masih belum teridentifikasi, hal ini dijelaskan
dalam beberapa jurnal dan PDB sum juga belum menampilkan struktur enzim
tersebut. Namun, menurut secara struktur 2D diidentifikasi bahwa struktur enzim
klorofilase memiliki tiga residu katalitik yaitu serin 145, histidin 262, dan aspartame
172. Nomer pada residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya

.
Gambar 2. Struktur 2D enzim klorofilase
Enzim klorofilase memiliki substrat yang spesifik yaitu klorofil. Klorofil ada
dua macam yaitu klorofil a dan klorofil b. Namun pada pepar ini hanya fokus pada
klorofil a saja. Perbedaan antara klorofil a dan b hanya pada rantai pengikatnya
klorofil a mengikat CH3 sedangkan klorofil b mengikat CHO. Reaksi kimia yang
terjadi adalah sebagai berikut:

Gambar 3.Reaksi enzim klorofilase

Enzim klorofilase menghidrolisis klorofil menghasilkan klorofilade dan fitol
dengan bantuan H2O. Enzim klorofilase memiliki tiga residu katalitik serin, histidin

dan aspartam. Serin memiliki gugus OH berfungsi sebagai nukleofil, namun serin
tersebut distabilkan oleh histidin. Karena histitin memiliki dua electron bebas pada N,
sehingga dapat mengikat H pada serin. Serin menyerang gugus ester pada rantai C,
sehingga ikatan O karbonil putus dan O memiliki elektron berlebih. Terbentuk
kompleks enzim-substrat dan filol lepas dan terbentuk O ikatan rangkap kembali.
Produk fitol telah terbentuk, sehingga stuktur enzim klorofilase menjadi berubah.
H2O memiliki nukleofil yaitu HO- akan menyrang C karbonil sehingga akan terbentuk
gugus alkohol. Resonansi terjadi untuk membentuk kestabilan sehingga gugus serin
terlepas dan terbentuk klorofilade. Enzim klorofilase terbentuk kembali sehingga
dapat mengikat substrat yang lain hingga dihasilkan produk dan seterusnya.
Mekanisme reaksi katalitik terjadi secara asam basa. Berikut mekanisme reaksi
katalitik enzimatik yang terjadi:

Gambar 4. Mekanisme katalisis klorofilase

2.3 Isolasi dan Pemurnian enzim klorofilase
Enzim klorofilase dapat diisolasi dari beberapa organisme seperti tumbuhan
tingkat tinggi, lumut dan ganggang. Beberapa penelitian telah berhasil mengisolasi
enzim klorofilase dari berbagai organisme antara lain: Triticum aestivum (wheat),
Phaseolus vulgaris, Phaeodactylum tricornutum, Capsicum annuum, Olea europaea,
Chenopodium album, dan Arabidopsis thaliana. Paper ini dibahas tentang enzim

klorofilase yang diisolasi dari daun tanaman ceri dengan bebepapa spesies, yaitu:
Bird cherry (Prunus padusL.), European plum (Prunus domesticaL.) dan Sour cherry
(Prunus cerasusL.).
Proses isolasi melalui beberapa tahap yaitu ekstrasi enzim, pemurnian enzim
(homogenasi, fraksinasi ammonium sulfat, dialisis dan filtrasi gel), dan karakterisasi .
-

Ekstrasi enzim
Sebanyak 30 gram daun dalam 400 ml aseton dingin (80%) dihomogenkan

pada suhu 4

C selama 5 menit. Campuran disaring dan disentrifugasi

dengan kecepatan 5000 g selama 10 menit. Supernatan digunakan sebagai klorofilase

a. Pelat dilarutkan dalam buffer kalium fosfat 5 mM pH 7 (50 mM KCl dan 0,24 %
Triton X-100). Campuran disentrufugasi dengan kecepatan 12000 g selama 10 menit.
Sepernatan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim klorofilase.
-

Fraksinasi Amonium sulfat

Sebanyak 35,4 g amonium sulfat ditambahkan dalam 100 ml crude enzim

(kejenuhan 30%) disentrifugasi dengan kecepatan 10000 g selama 20 menit,

supernatan dibuang dan pelatnya dilarutkan dengan buffer dan ditambahkan amonium
sulfat hingga fraksi 60%.
-

Dialisis
Pelat hasil fraksinasi dilarutkan dalam buffer dan di dialisis selama 24 jam pada

suhu 4 C
- Filrasi gel
Sebanyak 10 ml destilat dimasukkan dalam kolom glass (2 x 40 cm) dengan
Sephadex G-200 dan disetimbangkan dengan buffer pH 7. Enzim di elusi bersama
buffer dengan kecepatan 0,3 ml/menit. Kadar protein diukur dengan spektrometri
pada panjang gelombang 280 dan 260 nm. Massa molekul ditentukan berdasarkan
kurva standar Kav vs. Log Mr dibandingkan dengan protein standar sitokrom c (12.3
kDa), tripsin (23.8 kDa), ovalbumin (45.0 kDa), bovine serum albumin (66.0
kDa), and miosin (205.0 kDa) (Sytykiewicz et al., 2008).

Aktivitas klorofilase dan penentuan konsentrasi substrat

Sebanyak 0,35 ml ekstrak enzim ditambah 0,15 ml substrat dalam aseton dan 1

ml buffer natrium fosfat 5 mM pH 7. Diinkubasi dalan ruang gelap selama 30 menit

dengan suhu 30 C. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 ml aseton
dingin dan 2 ml n heksana. Campuran di vortek dan disentrifugasi 2 menit dengan
kecepatan 12000 g. Aktifitas diukur pada panjang gelombang 644, 662, dan 750 nm
(spektrometer UV-Vis Hewlett-Packrd model 8453). Lapisan atas mengandung
klorofil a dan ditentukan konsentrasinya menggunakan rumus berikut :

Berdasarkan proses pemurnian enzim klorofilase dengan beberapa tahapan,

diperoleh hasil pemurnian sebagai berikut:

Tiga macam tamanan ceri diatas menunjukkan tingkat kemurnian yang berbeda.
Dilihat dari proses pemurniannya, tahap homogenasi memiliki nilai kadar protein
yang besar dibandingkan tahap selanjutnya. Hal ini terjadi karena pada tahap
homogenasi masih banyak pengotor enzim klorofilase dan enzim yang terekstrak
masih sedikit. Aktifitas dari ekstrak tersebut memiliki aktivitas yang lebih kecil, hal
ini menunjukkan bahwa enzim tersebut masih belum murni dan memiliki tingkat
kemurnian 1 kali. Tingkat kemurnian enzim klorofilase sebanding dengan semakin
banyak proses pemurniannya. Aktivitas enzim didefinisikan kemampuan enzim dalam
1 nanomol enzim menghidrolisis substrat klorofil a per menit per mg protein.
Proses pemurnian menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan
sephadex C-200. Fraksi yang dihasilkan ada 7-8 fraksi protein. Namun yang
terindentifilasi sebagai enzim klorofilase hanya dua fraksi di simbolkan dengan F1
dan F2. Grafik yang dihasilkan adalah berikut:

Ketiga jenis tanaman ini menunjukkan hasil filtrasi yang berbeda berupa
konsentrasi protein dan aktivitas spesifiknya. Tanaman Bird cherry memiliki fraksi F1
lebih besar dari pada F2. Tanaman European plum dan Sour cherry memiliki fraksi F1
lebih besar dari pada F2. Perbedaan fraksi ini menunjukkan perbedaan massa molekul

enzim klorofilase yang diisolasi. Hasil massa molekul enzim klorofilase yang
dihasilkan adalah berikut:

Penentuan massa molekul enzim klorofilase sebagai hasil pengeplotan grafik

antara Kav (koefisien partisi pada kromatografi filtrasi gel) terhadap log massa
molekul. Perbedaan dapat dilihat hari hasil massa molekul tiap fraksi dalam satuan
kDa. Fraksi 1 memiliki ukuran molekul lebih besar dari pada fraksi 2. F1 akan
terelusi bersama fase gerak terlebih dahulu dibandingkan F2.
Selanjutnya penentuan pH optimum enzim klorofilase dilakukan dengan
memvariasikan kondisi pH buffer yang digunakan selama proses hidrolisis. pH
divariasi 3; 4; 5; 6; 7; 7,2; 7,4; 7,6; 7,8; 8; 8,2; 8,4; 8,6; 8,8; 9, 10, 11, dan 12.
Sebanyak 0,35 ml ekstrak enzim, 0,15 ml klorofil a dalam aseton 0,1 mM dan 1 ml
buffer kemudian diukur aktivitasnya. Hasil optimasi pH enzim klorofilase adalah:
Fraksi 1 (F1)
- Bird cherry pH 8
- Sour cherry pH 7
- European plum pH 7,8
Fraksi 2 (F2)
- European plum pH 7
- Bird cherry pH 7.8
- Sour cherry pH 8

Karakterisasi yang terakhir adalah penentuan nilai K m. Km adalah konsentrasi

substrat yang dibutuhan untuk mencapai setengah dari kecepatan reaksi maksimal.
Nilai Km merupakan hasil pengeplotan pada persamaan linier Linevear-Burk. Semakin
kecil Km maka kemampuan enzim menarik substrat semakin besar. Hasil penentuan
Km enzim klorofilase adalah berikut:

Pengaruh inhibitor dapat menurunkan aktivitas kerja enzim klorofilase tersebut.

Sampel di preinkubasi 24 jam pada suhu 4 derajat. Ditambahkan 10 mM ion logam
dan modifikasi gugus fungsi, kemudian diinkubasi kembali dalam tempat gelap
selama 30 menit dengan suhu 30 derajat dan diukur akifitasnya aktivitas diambil nilai
aktivitas yang tertinggi. Aktivitas yang dilihat adalah aktivitas relatif dari enzim
tersebut yang artinya nilai aktivitas enzim di catatan sebagai aktivitas paling tinggi.
Pengaruh inhibitor Mg2+ memiliki aktivitas relatif paling besar, hal ini dimungkinkan
karena dalam substrat enzim klorofilase juga mengikat Mg 2+. Sehingga sisi katalitik
enzim klorofilase sudah mengenali ion tersebut. Hasil yang diperoleh saat pengujian
pengaruh inhibitor adalah berikut :

2.4 Bioinformatika
Bioinformatika enzim klorofilase dibandingkan dari beberapa organisme
penghasil enzim klorofilase. Organisme tersebut antara lain Arabidopsis thaliana 1,
Arabidopsis thaliana 2, Chenopodium album, Citrus sinensis,dan Triticum aestivum.
Gambar berikut merupakan hasil BLAST untuk mendeteksi sequence batas kemiripan
homologi. enzim ini bukan diisolasi dari tanaman ceri tetapi tanaman gandum yang
memiliki presentase homologi kurang dari 20% dan memiliki kemiripan dengan hasil
sequence pada organisme mamalia penghasil hormone sensitive lipase. Sehingga
enzim klorofilase memiliki motif lipase. Selain itu dilaporkan adanya residu katalitik
enzim klorofilase yaitu serin 145, histidin 262, dan aspartame 172. Nomer pada
residu katalitik tersebut sebagai posisi urutan asam aminonya. Presentase homologi
dari beberapa organism Triticum aestivum Arabidopsis thaliana 1, Arabidopsis
thaliana 2, Chenopodium album, dan Citrus sinensis adalah < 20%, 46,3%, 43,4%,
37,6%, dan 40,7%.

Gambar 5. Hasil sequence asam amino enzim klorofilase

2.5 Penutup
2.5.1 Kesimpulan
- Enzim klorofilase termasuk jenis enzim hidrolase
- Enzim klorofilase memiliki substrat klorofil, menghirolisis klorofil menghasilkan
klorofilide dan fitol.
- Enzim klorofilase optimum pada pH 7,8 dan 8
- Enzim klorofilase memiliki residu katalitik serin 145, histidin 262, dan aspartame
172

DAFTAR PUSTAKA

Arkus, A.J., Kiani, dan Jez, M, Joseph., 2006. Development of High- Troughput
purification method and a continous assay system for Chlorophyllase. USA,
DonaldDanforth Plant Sciences, Elsivier: Analytical Biochemistry, 353, 9398
Khamessan, A., Kermasha, S., dan Mollimard, L., 1995. Optimization of
Chlorophllase-Catalyzed Hydrolytic Activity in a Micellar Ternary System,
Biotechnol, Appl. Biochem, 22, 327-343
Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasar Biokimia, Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Sytykiewicz, Hubert dkk. 2013. Biochemical characterisation of chlorophyllase from
leaves of selected Prunusspecies A comparative study. Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Siedlce University of Natural Sciences
and Humanities, Siedlce, Poland. Vol 60, 457-465