Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 85 – 90, 2006

Zullies Ikawati

Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour

(cangkring) terhadap penekanan ekspresi
enzim siklooksigenase–2 pada kultur sel raji
Effect of ethanol extract of Erythrina fusca Lour
(cangkring) leaves on suppression of cyclooxygenase-2
expression in raji cell line

Zullies Ikawati, Agung Endro Nugroho dan Winda Werdhinindah

Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Abstrak

Enzim siklooksigenase (COX) terdapat dalam dua bentuk isoform, yaitu

COX-1 dan COX-2. Ekspresi COX-2 terinduksi pada kondisi inflamasi maupun
kanker. Penelitian ini bermaksud menguji efek ekstrak etanol daun Erythrina
fusca Lour (cangkring) terhadap penekanan ekspresi COX-2 pada kultur sel
Raji, yang dilakukan menggunakan metode immunositokimia. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun E. fusca Lour dengan
kadar 250,0; 125,0; dan 62,50 µg/mL mampu memberikan efek penekanan
ekspresi enzim siklooksigenase-2 secara bermakna (p < 0,05) terhadap
kontrol, dengan persen penekanan berturut-turut: 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ±
1,62 %; dan 23,25 ± 2,21 %.
Kata kunci: Ekspresi COX-2, anti inflamasi, antikanker, sel Raji, ekstrak etanol daun
Erythrina fusca Lour, immunositokimia

Abstract

Cyclooxygenase enzyme (COX) exists on two isoforms, COX-1 and

COX-2. COX-2 is expressed highly in inflammation and cancer cells. The
effect of ethanol extract of Erythrina fusca Lour (cangkring) toward
suppression of COX-2 expression in Raji cells was studied using immuno-
cytochemistry method. This research showed that ethanol extract of E. fusca
Lour leaves on concentration of 250,0; 125,0; dan 62,50 µg/mL was able to
suppress the COX-2 expression significantly in comparison to control, with
the inhibition of 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ± 1,62 %; and 23,25 ± 2,21 %.
Key words: COX-2 expression, anti-inflammation, anti cancer, Raji cells, ethanol
extract of E. fusca leaves, immunocytochemistry

Pendahuluan sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh

Enzim siklooksigenase (COX) yang
merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non
Steroid (OAINS) terdapat dalam dua isoform,
yaitu COX-1 dan COX-2. Kedua enzim
tersebut mengkatalisis reaksi dan menghasilkan
produk yang sama, yaitu prostaglandin, tetapi
dengan fungsi biologis yang berbeda. COX-1
diekspresikan pada hampir semua jaringan dan
bertanggungjawab menghasilkan prostaglandin
yang berperan menjaga homeostatis saluran
pencernaan, aliran darah ginjal, dan vaskular;
berbagai stimulan inflamasi atau mitogenik, dan
bertanggungjawab pada biosintesis prostag-
landin yang terlibat pada reaksi inflamasi dan
rasa nyeri. Sebagian besar OAINS yang beredar
saat ini masih bersifat non-selektif COX,
sehingga selain menghambat COX-2 juga
menghambat COX-1. Penghambatan COX-1
inilah yang memunculkan efek samping pada
penggunaan OAINS, utamanya pada saluran
gastrointestinal (Schror and Meyer-Kirchrath,
2000).

Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006 85

 Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour.....................
Selain terinduksi pada proses inflamasi,
overekspresi COX-2 juga ditemukan pada
banyak tipe pre-malignan dan malignan
neoplasma pada manusia dan organisme lain,
seperti pada kanker prostat, payudara, liver,
(Hu et al., 2003), dan kolorektal (Moore and
Simmons, 2000). Prostaglandin hasil aktivitas
COX-2 dinyatakan terlibat dalam karsino-
genesis melalui perangsangan proses proliferasi
sel, angiogenesis, dan penghambatan apoptosis
(Koki and Masferrer, 2002).
Sementara ini dapat disimpulkan bahwa
aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan
peranan penting dalam proses inflamasi
maupun kanker. Penggunaan OAINS selektif
terhadap COX-2 diharapkan akan memberikan
aksi antiinflamasi setara dengan OAINS non
selektif tetapi dengan angka kejadian efek
samping yang lebih kecil dan mempunyai profil
antikanker yang lebih baik. Hal ini memotivasi
pencarian agen yang dapat mempengaruhi
regulasi COX-2, baik melalui penekanan
ekspresi COX-2 dan/atau melalui pengham-
batan COX-2 (Perera et al., 2001).
Indonesia kaya akan bahan alam, yang
salah satu pemanfaatannya adalah sebagai
bahan obat. Salah satu tumbuhan yang telah
banyak diteliti tentang aktivitasnya sebagai
antiinflamasi dan antikanker adalah Erythrina
fusca Lour (cangkring). Penelitian-penelitian
terdahulu membuktikan bahwa ekstrak metanol
daun E. fusca Lour dapat menghambat inflamasi
yang diinduksi karagenin (Baroroh, 2003;
Rukoyah, 2003). Ekstrak etanol daunnya
dilaporkan bersifat antiproliferatif terhadap sel
Raji (Riadi, 2002) dan menghambat angio-
genesis pada membran korio alantois embrio
ayam (CAM) terinduksi bFGF (Nurbayani,
2003).
Ekstrak etanol daun E. fusca Lour
mengandung flavonoid, suatu golongan
senyawa yang telah teridentifikasi sebagai
komponen yang mampu mempengaruhi
regulasi COX-2 (Perera et al., 2001), sehingga
diduga ekstrak etanol daun E. fusca Lour
mampu mempengaruhi regulasi COX-2, namun
belum tersedia bukti ilmiah tentang kemam-
puannya tersebut. Oleh karena itu, pada
penelitian ini diteliti mengenai kemampuan
ekstrak etanol daun cangkring dalam mem-
pengaruhi regulasi COX-2 melalui mekanisme
86
penekanan ekspresi COX-2. Kultur sel Raji
dipilih sebagai media karena memiliki ekspresi
COX-2 yang tinggi.
Metodologi
Bahan
Daun E. fusca Lour., etanol (teknis) 80 %, cell
line Raji, RPMI 1640 (Gibco), FBS 10 % (Gibco),
Fungison 0,5 % (Gibco), penisilin dan streptomisin
1.% (Gibco), DMSO 0,25 %, HEPES (Sigma),
Phospat Buffer Saline (PBS), biru tripan 0,5 %, H2O2,
serum mencit normal, antibodi primer monoklonal
mencit (Novo Castra), antibodi sekunder Biotinylated
Goat Anti-Polyvalent (Lab Vision), enzim Streptavidin
Peroxidase (Lab Vision), kromogen/substrat 3,3’-
diaminobenzidine (DAB) (Lab Vision), dan
hematoksilin (Dako). Semua bahan yang dipakai
berderajat proanalisa kecuali dinyatakan lain.
Alat
Seperangkat alat gelas, seperangkat alat
penyari, mikroskop fluoresensi (Zeiss MC 80),
inverted microscope (Olympus CH-2), sentrifus
(Sigma), inkubator CO2 (Heraceus), Laminar air flow
cabinet (Nuaire), hemocytometer (Nebauer), tabung
conical steril (Nunclone), tissue culture flask
(Nunclone), mikroplate 96 sumuran (Nunclone),
mikroplate 24 sumuran (Nunclone), vorteks
(Genie), gelas obyek (poly-l-lysine slide) (Sigma).
Jalannya penelitian
Uji sitotoksisitas dengan metode penghi-
tungan langsung
Ke dalam 100,0 µL suspensi sel pada setiap
sumuran yang berbeda (kepadatan sel 2 x 104 sel
/sumuran) masing-masing ditambahkan 100,0 µL
sampel dalam media kultur RPMI 1640 hingga
dicapai seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 1000;
750; 500; 250; 125; dan 62,5 µg/mL. Pada kontrol
media, 100,0 µl senyawa uji diganti dengan 100,0 µl
media kultur, sedang pada kontrol pelarut, diganti
dengan 5,0 µl DMSO 0,25 % dan 95,0 µl media
kultur. Selanjutnya plate diinkubasikan dalam
inkubator 5.% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C,
lalu ditambahkan 50,0 µL larutan biru triptan 0,5 %
dalam akuades. Setelah itu larutan dalam tiap
sumuran diresuspensi kuat dan diambil 10,0 µL
untuk penghitungan sitotoksistas menggunakan
metoda penghitungan langsung dengan bantuan biru
tripan.
Uji immunositokimia
Ke dalam suspensi sel pada setiap sumuran
yang berbeda (kepadatan sel 5 x 105 sel/ sumuran)
ditambahkan 1000 µL sampel dalam media kultur
RPMI 1640 hingga dicapai seri kadar akhir dalam
Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006
Zullies Ikawati
sumuran yaitu 250; 125; dan 62,5 µg/mL. Pada
kelompok kontrol, 1000 µL sampel diganti dengan
1000 µL media kultur. Selanjutnya plate
diinkubasikan dalam inkubator 5.% CO2 selama 24
jam pada suhu 370C. Sel yang telah diinkubasi
kemudian dipanen dan dibuat apusan pada gelas
obyek (poly-l-lysine slide) untuk diuji secara
imunositokimia menggunakan antibodi (IgG) primer
monoklonal mencit anti COX-2, dan divisualisasikan
dengan reaksi warna. Ekspresi COX-2 diamati
menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang
mengekspresikan protein COX-2 akan memberikan
warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak akan
memberikan warna ungu/ biru. Jumlah sel dihitung
pada luasan tertentu, baik yang berwarna coklat/
gelap maupun yang berwarna biru, kemudian
dianalisis seperti tertera di bawah ini.
Analisis Data
Uji sitotoksisitas
Persentase kematian sel dengan rumus
sebagai berikut:.
Selanjutnya dibuat grafik hubungan antara
kadar sampel terhadap persentase kematian sel dan
dilakukan uji korelasi dengan metode probit untuk
menentukan persamaan garis regresi dan harga
LC50.
Uji immunositokimia
Persen penekanan ekspresi COX-2 dihitung
dengan rumus:
Persen penekanan ekspresi enzim COX-2
dianalisis secara statistik dengan metode ANOVA
satu jalan, dilanjutkan dengan uji LSD dengan taraf
kepercayaan 95.%.
Hasil Dan Pembahasan
Uji sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas ekstrak etanol E. fusca
Lour (selanjutnya disebut ekstrak uji) terhadap
sel Raji dilakukan untuk menentukan harga
LC50, yang kemudian digunakan sebagai
patokan kisaran kadar yang digunakan pada uji
penekanan ekspresi COX-2. Adapun hasilnya
dapat dilihat pada Tabel I. Terlihat bahwa
terdapat hubungan langsung antara perubahan
konsentrasi ekstrak uji dengan tingkat kematian
sel Raji. Pada konsentrasi ekstrak uji tertinggi
Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006
yaitu 1000 µg/mL diperoleh nilai persentase
kematian sebesar 73,43.%, dengan nilai LC50
ekstrak uji terhadap sel Raji adalah
149,85 µg/mL.
Immunositokimia
Pada pengecatan immunositokimia
terdapat lima kelompok perlakuan, yaitu
kelompok kadar 250, 125, dan 62,5 µg/mL,
kontrol (media dengan perlakuan antibodi
primer), dan blanko (media tanpa perlakuan
antibodi primer). Penentuan kisaran kadar
ekstrak uji didasarkan pada hasil LC50, yaitu di
atas dan di bawah LC50. Hasil ekspresi COX-2
pada kelompok perlakuan kemudian dibanding-
kan dengan ekspresi pada kelompok kontrol
sehingga dapat dilihat pengaruh ekstrak etanol
daun E. fusca Lour terhadap ekspresi COX-2.
Hasil pengecatan immunositokimia
diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Ekspresi COX-2 positif apabila sitoplasma sel
berwarna coklat, dan negatif apabila sitoplasma
berwarna biru/gelap (Gambar 1).
Pada kelompok perlakuan terlihat bahwa
ekspresi COX-2 menurun seiring peningkatan
kadar ekstrak etanol daun E. fusca Lour.
Selanjutnya dilakukan perhitungan penekanan
ekspresi COX-2, yang hasilnya dapat dilihat
pada Tabel II. Dari Tabel II terlihat bahwa
perlakuan ekstrak uji terhadap sel Raji
memberikan efek penekanan terhadap ekspresi
COX-2 apabila dibandingkan dengan kelompok
kontrol. Penurunan konsentrasi ekstrak uji
memberikan peningkatan ekspresi COX-2 yang
berbanding terbalik dengan penekanan ekspresi
COX-2.
Untuk melihat apakah antara kelompok
kontrol dan kelompok perlakuan terdapat
perbedaan ekspresi COX-2 yang bermakna,
maka data kemudian dianalisis dengan metode
ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan uji LSD
untuk membandingkan perlakuan satu dengan
yang lain (Hasil analisis data tidak ditampilkan).
Hasil uji statistik menunjukkan bahwa ekstrak
uji mampu menekan ekspresi COX-2 secara
berbeda bermakna terhadap kelompok kontrol.
Senyawa alam yang terdeteksi di dalam
senyawa uji adalah flavonoid, alkaloid, saponin,
dan terpenoid (Riadi, 2002). Efek biologis dari
flavonoid sepertinya terjadi akibat interaksi
dengan protein tirosin kinase dan enzim
87
 Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour.....................

Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol E. fusca Lour. terhadap sel Raji
Jumlah sel hidup % kematian
No. Kelompok
rata-rata (x 103) sel
1. Kontrol media 32 0
2. Kontrol pelarut 0,25 % DMSO 32,33 0
3. Kadar 1000 µg/mL 8,5 73,43
4. Kadar 750 µg/mL 8, 33 73,96
5. Kadar 500 µg/mL 11,67 63,54
6. Kadar 250 µg/mL 13,66 57,29
7. Kadar 125 µg/mL 16,33 48,95
8. Kadar 62,5 µg/mL 19,33 39,58

Tabel II. Hasil perhitungan ekspresi COX-2 pada sel

Raji
Purata % penekanan
Kelompok
ekspresi ± SEM
Kontrol 0,62 ± 0,62
Kadar 62,5 µg/mL 23,25 ± 2,21
Kadar 125 µg/mL 44,69 ± 1,62
Kadar 250 µg/mL 70,19 ± 2,14

Gambar 1. Hasil pengamatan ekspresi COX-2 dengan meng-

gunakan mikroskop cahaya perbesaran 40 x. a.Kontrol
(kontrol media dengan perlakuan antibodi primer); b.
Blangko (kontrol media tanpa perlakuan antibodi
primer); c. Perlakuan dengan kadar 62,5 µg/mL; d.
Kadar 125 µg/mL; dan e. Kadar 250 µg/mL.
siklooksigenase. Walaupun dalam penelitian ini yang diinduksi oleh LPS dengan nilai IC50
belum diteliti lebih jauh jenis flavonoid yang 52 nM (Perera et al, 2001).
terdapat pada daun E. fusca, namun diduga Hasil aktivitas COX adalah prostaglandin
flavonoid lebih banyak berperan dalam efek yang merupakan hasil metabolisme asam
penekanan ekspresi COX-2 ini. Hal ini seperti arakidonat. Prostaglandin berperan banyak
yang dijumpai pada genistein, misalnya, dalam sistem tubuh manusia, tetapi ketika
flavonoid yang hampir semuanya terdapat diekspresikan secara berlebihan, dilaporkan
dalam tanaman famili Leguminosae terlibat dalam tumorigenesis (Zecha et al.,
(Papilionaceae), yang dilaporkan dapat 2004). Prostaglandin hasil aktivitas COX-2
menghambat ekspresi COX-2 pada makrofag

88 Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006

Zullies Ikawati

dilaporkan berperan dalam upregulasi VEGF
(vascular endothelial growth factor) dan menginduksi
angiogenesis pada tumor (Akarasereenont et al.,
2002). VEGF sendiri dapat meningkatkan
protein dan aktivitas COX-2 pada human
umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Akiyama
et al., 1987).
Nurbayani (2003) melaporkan bahwa
ekstrak uji mampu menghambat angiogenesis
pada membran korio alantois embrio ayam
terinduksi bFGF. Hal ini menguatkan dugaan
bahwa ekstrak uji dapat menekan ekspresi
COX-2, yang pada gilirannya dapat menurun-
kan produksi PGE2 dan VEGF sehingga
menghambat angiogenesis.
Sebagai media uji adalah sel Raji. Sel Raji
merupakan sel limfosit-β yang terinfeksi oleh
Eipstein-Barr Virus (EBV) (Alfieri and Joncas,
1987). Sel yang terinfeksi EBV akan mengeks-
presikan protein bcl-2 yang menjadikan sel
resisten terhadap sistem apoptosis (Komano
et al., 1998). Karakteristik resistensi sel Raji
terhadap apotosis ini kemungkinan diperantarai
oleh overekspresi COX-2 oleh sel Raji (Wun
et al, 2004). Dalam penelitian ini, ekstrak uji
dapat menekan ekspresi COX-2 pada sel Raji,
maka dapat diasumsikan bahwa ekstrak uji
dapat menekan konversi asam arakidonat
menjadi PGE2. Penurunan konversi asam
arakidonat akan meningkatkan ketersediaan
asam arakidonat, sehingga akan meningkatkan
ketersediaan ceramide, suatu induktor apoptosis
poten (Lema, 2002), sedang penekanan
produksi PGE2 akan menurunkan ekspresi
bcl-2, suatu antiapoptosis (Shacter and
Weitzman, 2002). Maka diduga kemampuan
ekstrak uji menginduksi apoptosis pada sel Raji
adalah melalui penekanan ekspresi COX-2,
sehingga meningkatkan induktor apoptosis
poten, ceramide, dan menekan ekspresi onkogen
antiapoptosis bcl-2.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
ekstrak etanol daun E. fusca Lour dapat
menekan ekspresi COX-2 secara bermakna
terhadap kontrol. Hal ini diharapkan dapat
memperkaya bukti-bukti ilmiah akan aktivitas
ekstrak tersebut sebagai antiinflamasi dan
antikanker.
Kesimpulan
Dari penelitian menggunakan ekstrak
etanol daun E. fusca Lour dapat ditarik
kesimpulan bahwa ekstrak etanol daun E. fusca
Lour dengan kadar 250,0; 125,0; dan 62,50
µg/mL mampu memberikan efek penekanan
ekspresi enzim siklooksigenase-2 secara
bermakna (p < 0,05) dibandingkan dengan
kontrol, dengan persen penekanan berturut-
turut 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ± 1,62 %; dan
23,25..±..2,21.%.

Daftar Pustaka
Akarasereenont, P.C., Techatraisak, K., Thaworn, A., and Chotewuttakorn, S., 2002, The expression
of COX-2 in VEGF-treated endothelial cells is mediated through protein tyrosine
kinase, Mediators Inflamm., 11 (1), 17-24
Akiyama T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., Itoh, N., Shibuya, M, and Fukami,
Y., 1987, Genistein, a Spesific Inhibitor of Tyrosine-spesific Protein Kinases, J Biol
Chem, 262 (12), 5592-5595.
Alfieri, C, and Joncas, J.H., .1987, Biomolecular analysis of a defective nontransforming Epstein-
Barr virus (EBV) from a patient with chronic active EBV infection, J Virol.
61(10):3306-9.
Baroroh, H.N., 2003, Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca
Lour.) pada Pasca Inflamasi Akut yang Diinduksi Karagenin, Skripsi, Fakultas
Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Hu, K., Yu, C., Mineyama, Y., McCracken, J.D., Hillebrand, D.J., and Hasan, M., 2003, Inhibited
proliferation of cyclooxygenase-2 expressing human hepatoma cells by NS-398, a
selective COX-2 inhibitor, Int J Oncol, 22, 757-763.
Koki, A.T., and Masferrer, J.L., 2002, Celecoxib: A Specific COX-2 Inhibitor with Anti Cancer
Properties, Cancer Control, 9 (2), 28-35.

Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006 89

 Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour.....................

Komano J, Sugiura M, and Takada K. 1998, Epstein-Barr virus contributes to the malignant
phenotype and to apoptosis resistance in Burkitt's lymphoma cell line Akata. J Virol.
72(11): 9150-6.
Lema, M.J., 2002, Coxib Therapy and Colorectal Cancer: Emerging options with coxib therapy,
Cleve Clin J Med, 69, 176-184.
Moore, B.C., and Simmons, D.L., 2000, Cox-2 Inhibition, Apoptosis, and Chemoprevention by
Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs, Curr Med Chem, 7, 1131-1144.
Nurbayani, N., 2003, Efek Penghambatan Angiogenesis Ekstrak Etanol Daun Tanaman Cangkring
(Erythrina fusca Lour) pada Membran Korio Alantois Embrio Ayam Terinduksi bFGF,
Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., and Bohlin, L., 2001, Search for Natural Product
which Affect Cyclooxygenase-2, in Tringali, C., (Ed.), Bioactive Compounds from Natural
Sources: Isolation, Characterisation, and Biological Properties, 434-465, Taylor and Francis,
London.
Riadi, I., 2002, Efek Antiproliferatif Ekstrak Etanol Daun Tanaman Cangkring (Erythrina fusca
Lour.) terhadap Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta.
Rukoyah, U., 2003, Pengaruh Pra Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca
Lour.) terhadap Inflamasi Akut pada Tikus Jantan yang Diinduksi Karagenin, Skripsi,
Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Schror, K. and Meyer-Kirchrath, J., 2000, Cyclooxygenase-2 Inhibition and Side-effects of
Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs in the Gastrointestinal Tract, Curr Med
Chem, 7, 1121-1129.
Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002, Chronic Inflammation and Cancer, Oncology, 16 (2), 217-232.
Wun, T., McKnight, H., and Tuscano, J.M., 2004, Increased cyclooxygenase-2 (COX-2): a potential
role in the pathogenesis of lymphoma, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/,
Desember 2005
Zecha, G., Lin, D.W., and Montgomery, R.B., 2004, The increasing role of CAM in prostate cancer,
JAAPA, 17, 37-44.

90 Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006