Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Kcepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran.dengan demikian elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi makromolekul
(seperti protein dan asam nukleat).posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi
dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid
dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan
asam nukleat elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel
poliakrilamida (PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi
medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik,
molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan
sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-
molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini
akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid
bermuatan negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh

medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-
sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik
Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu
elektroda.
Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid
berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid
berkumpul di elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif.
Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat
Cottrell

1. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Prinsip:

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu
medan elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah
elektroforesis zonan (zonal electrophoresis) di mana protein dipisahkan dari satu campuran
yang kompleks kepada jalur (band) melalui migrasi didalam larutan penimbal berair melalui
satu matrik polimer dipanggil gel. Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim
didalam elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan.
Matrik gel boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca atau keping (slab) diantara dua
kepingan kaca.

Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI nya.
Suatu protein bercas negatif sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala suatu protein itu
bercas positif sekiranya pH larutan dibawah pI nya. Banyaknya cas dan voltan yang diberikan
akan menentukan berapa jauhnya suatu protein itu akan bergerak didalam suatu medan
elektrik. Semakin tinggi voltan dan semakin besar cas yang terdapat pada protein, maka
semakin besarlah pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan bentuk molekul yang
menentukan jejari Stokes suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan didalam matrik
gel tersebut. Pergerakan protein perlahan apabila pergeseran molekul meningkat akibat dari
mertambahnya jejari Stokes; dengan demikian, protein yang lebig kecil bergerak lebih pantas
didalam matrik gel. Bagitu juga, pengurangan dalam saiz liang (pore) matrik gel akan
memperlahankan pergerakan.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein

dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu
lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis
penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium
dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein
dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,
merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan
ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan
hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan
dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu
pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber
kuasa digunakan untuk menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber
arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas
yang sesuai pada protein dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem
penimbal yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino
metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada
pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit

(selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-metilen-bisakrilamid
dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas,
amonium persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam
makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian
(resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu
gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan
satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti
yang dimaksudkan dengan namanya, digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan
protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4).
Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif tinggi) dan
glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkan protein
menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang
mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan
pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang diskrit.
Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan
boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya
boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan
akrilamid 15 peratus selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat
molekul dibawah 50,000. Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000
lazimnya dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel
kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel
selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran
berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya
dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru
ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu
daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu
larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan
menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah
(silver stain). Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan
sesuatu protein.

Kegunaan:

Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk

makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari
protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik
pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digunakan untuk
menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk
menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas
tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan
dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat
molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam
beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat
molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak
diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini,
protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah
diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau
migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6).
Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik
pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai pI
berbeza kurang dari 0.02 unit pH.

Tatakerja:
Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul
kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif.
Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran
nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan.
Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan
pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif
kearah katod. Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit
(2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan
berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.

Kegunaan:

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu
protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang
berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam
bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi:
memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis
gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
(menggunakan prinsip dalam elektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan
zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru
Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel
berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel
difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,
autoradiogram gel tersebut dibuat.