EFEK ANTIPROLIFERASI EKSTRAK KLOROFORM DARI Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.

PADA TITISAN SEL KANKER MANUSIA Kintoko , Azimahtol Hawariah Lope Pihie Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan ** Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia
* *) **)

Email: maskinjogja@yahoo.com.sg

ABSTRACT The antiproliferative effect of the chloroform extracts from Phaleria macrocarpa (mahkota dewa) was evaluated in vitro on three human cell lines (HeLa, HM3KO, MCF-7) a d n r l e le ( h n le)using methylene blue assay. In this study, used n oma c l i C a g i r ln s v various part of plant namely leaves, barks, epicarps and seeds. Chloroform extract from seeds acted growth inhibition on HeLa cell line with IC 50 value was 9,02 0,84 g/ml. Its antiproliferative effect was n t e cv w i i it rwho n r le leo C a g o s l te he n b go t n oma c li f h n ei l hi ln s liver as well. However, this extract can be selected for chemopreventive agents of melanoma skin cancer. Key words: Phaleria macrocarpa, Antiproliferative, Cancer cell PENDAHULUAN
Kanker menjadi masalah utama kesehatan di seluruh dunia dan penyakit pembunuh terbesar kedua setelah kardiovaskuler. Kanker merupakan penyakit degeneratif yang ditandai dengan keadaan sel yang membagi secara terus menerus (proliferasi) tanpa kontrol dan mempunyai kemampuan untuk menyebar (metastasis) ke jaringan yang berlainan secara patologi (Hawariah 1998a). Pengobatan konvensional yang umum dilakukan pada penyakit kanker antaranya dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi (Apantaku 2002). Namun, terapi kanker secara pembedahan tidak dapat dilakukan khususnya pada sel kanker yang telah menyebar (metastasis), sementara pengobatan kemoterapi dan radiasi dapat menimbulkan efek samping meskipun pengobatan kemoterapi mampu mengeluarkan keseluruhan tumor (Hawariah 1998b). Karena itu, usaha pencarian agen kemoterapi dari bahan alami yang mensasarkan target aksinya pada gengen pengatur pertumbuhan atau proliferasi sel dengan efek samping minimum adalah amat diperlukan dalam pengobatan penyakit kanker. Mahkota dewa dipilih dalam kajian antiproliferasi berdasarkan pada kajian terdahulu tentang potensi sitotoksiknya terhadap Artemia salina Leach. Kajian sitotoksik mahkota dewa ekstrak biji, kulit buah, daun dan kulit batangnya dalam bentuk fraksi polar, semipolar dan nonpolar menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) memberikan nilai LC50 antara 0.16 11.83 g/ml (Lisdawati 2002). Ekstrak tumbuhan telah lama digunakan dalam pengobatan penyakit kanker (Newman et al. 2000). Uji antiproliferasi/sitotoksisitas menyediakan data permulaan yang penting untuk membantu dalam pemilihan ekstrak-ekstrak tumbuhan yang berpotensi sebagai agen

antineoplastik (Cardellina et al. 1999). Dengan demikian, kajian antiproliferasi dari ekstrak kloroform mahkota dewa diperlukan untuk menilai aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel-sel kanker.

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

Bahan mentah Daun, kulit batang, kulit buah dan biji Phaleria macrocarpa diperoleh dari daerah Wates, Kulonprogo, Yogyakarta pada bulan Agustus 2005. Bahan kimia D l co Mo i d E g Me im (DMEM), penisilin-streptomisin, fungizon, FBS u ec b s di f e a ls e d u (Gibco, USA), tripsin, EDTA, tamoksifen, glutaraldehid, metilen biru, DMSO (Sigma, USA), miramisin (Atlantik, Thailand), Na2HPO4 (Hamburg, Jerman), KH2PO4, KCl (Fluka, Switzerland), NaCl, HCl, kloroform (Merck, Jerman).

Kultur sel Kultur sel HeLa (kanker serviks), HM3KO (kanker kulit melanoma), MCF-7 (kanker payudara) dan hati Chang diperoleh dari American Type Cell Culture (ATCC). Kultur sel disimpan pada freezing medium dalam kriovial yang mengandung campuran FBS dan DMSO dengan perbandingan 9:1. Penyiapan ekstrak Setiap bagian tanaman yang dikumpulkan, dicuci, dikeringkan, diserbuk dan diayak. Serbuk diekstraksi sempurna dengan kloroform dalam Soxhlet. Ekstrak dipekatkan dengan rotarievaporator, ditimbang dan disimpan dalam almari es suhu 4 Setiap ekstrak diencerkan C. dengan DMSO untuk mendapatkan sembilan konsentrasi antara 10 0,04 mg/ml. Pengkulturan dan pengsubkulturan sel Titisan-titisan sel kanker (HeLa, MCF-7, HM3KO) dan sel normal (hati Chang) masingmasing dikultur dalam medium pertumbuhan DMEM (D l co Mo i dE g Me im) yang u ec b s d i a ls d f e e u mengandungi 5% serum anak sapi (Fetal Bovine Serum), 1% penisilin-streptomisin, 1% fungizon dan 0,1% miramisin. Diinkubasi dalam inkubator suhu 37 dengan 5% CO2. C Pengsubkulturan dilakukan apabila sel telah mencapai konfluen 90%. Medium lama di dalam flask kultur dibuang dan sel dibasuh dengan PBS-EDTA sebanyak 3 kali. Ditambahkan larutan tripsin 0,025% (0,1 ml/cm ) ke dalam flask kultur dan diinkubasi selama 5 menit dalam inkubator pada suhu 37 dengan 5% CO2. Sel pada dasar permukaan medium yang tanggal C ditambah medium pertumbuhan baru dan dibagikan menjadi beberapa flask kultur baru. Sel dieram kembali di dalam inkubator pada suhu 37 dengan 5% CO2. Semua kerja pengkulturan dan C pengsubkulturan sel dilakukan secara steril di dalam laminar air flow (LAF) kelas II.
2

Uji antiproliferasi Uji aktivitas antiproliferasi dilakukan pada kultur sel kanker HeLa, HM3KO dan MCF-7 menggunakan metode uji metilen biru yang telah dilaporkan oleh Lin & Hwang (1991). Tamoksifen

digunakan sebagai kontrol positif manakala larutan DMSO sebagai kontrol negatif. Jumlah sel hidup per telaga dihitung menggunakan alat ELISA Reader Dynatech MR5000 pada panjang gelombang 660 nm. Nilai IC50 ditentukan dari grafik persen sel hidup vs log konsentrasi sampel uji (Lieberman et al. 2001).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi merupakan upaya mendapatkan komponen kimia (metabolit sekunder) pada tumbuhan yang akan diujikan. Ekstraksi yang tidak tepat dapat mempengaruhi bioaktivitas komponen yang diujikan (Spitaler et al. 2006). Oleh itu, dalam ekstraksi perlu diperhatikan penggunaan pelarut dan metode ekstraksi (Hayouni et al. 2007) yang sesuai dengan sifat fisikokimia komponen yang terkandung dalam tanaman. Selain itu, faktor ekologi dan umur tanaman juga dapat mempengaruhi kandungan metabolit sekunder (Rahardjo dkk., 2006) dan bioaktivitasnya (Jagetia & Baliga 2005). Untuk mengendalikan faktor ekologi dan umur tanaman, maka mahkota dewa diambil di Wates pada bulan Agustus 2005. Dalam penelitian ini bagian daun, kulit batang, kulit buah dan biji mahkota dewa diekstraksi dengan pelarut organik kloroform menggunakan Soxhlet.. Kandungan metabolit sekunder yang bersifat nonpolar akan lebih banyak terekstraksi berbanding komponen polar. Hasil ekstraksi diringkaskan pada Tabel I.

Tabel I.

Persen berat ekstrak kloroform dari daun, kulit batang, kulit buah dan biji Phaleria macrocarpa menggunakan Soxhlet.

Ekstrak kloroform Daun Kulit batang Kulit buah Biji

Berat (%) 0,28 0,05 0,23 0,40

Ekstrak yang diperoleh akan diujikan efek antiproliferasinya pada panel kultur sel kanker HeLa, HM3KO, MCF-7 dan sel normal hati Chang dengan kontrol positif tamoksifen dan kontrol negatif 1% DMSO (Ferrandina et al. 2001). Metode yang digunakan dalam pengujian antiproliferasi dengan uji metilen biru (Lin & Hwang 1991). Metode ini didasarkan pada prinsip kolorimetrik dimana sel hidup yang diwarnakan dengan metilen biru akan memberikan nilai serapan pada spektrofotometer yang berbanding lurus dengan jumlah sel-sel hidup. Parameter efek antiproliferasi ditunjukkan oleh nilai IC50, yaitu konsentrasi paling kecil yang menyebabkan kematian sel sebanyak 50% dari populasi sel. Sesuatu ekstrak dikatakan mempunyai efek antiproliferasi yang signifikan apabila mempunyai nilai IC5020 g/ml mengikut garis panduan American National Cancer Institute (ANCI) (Itharat et al. 2004).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -3.4

V ia b iliti sel (% )

-3.1

-2.8

-2.5

-2.2

-1.9

-1.6

-1.3

-1

Log [kepekatan (ug/ml)] HeLa

Grafik 1.

HM3KO

MCF-7

Hati Chang

Profil aktivitas antiproliferasi ekstrak kloroform daun Phaleria macrocarpa terhadap sel HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -3.4

V iab iliti sel (% )

-3.1

-2.8

-2.5

-2.2

-1.9

-1.6

-1.3

-1

Log [kepekatan (ug/ml)] HeLa

Grafik 2.

HM3KO

MCF-7

Hati Chang

Profil aktivitas antiproliferasi ekstrak kloroform kulit batang Phaleria macrocarpa terhadap sel HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -3.4

V iab iliti sel (% )

-3.1

-2.8

-2.5

-2.2

-1.9

-1.6

-1.3

-1

Log [kepekatan (ug/ml)] HeLa

Grafik 3.

HM3KO

MCF-7

Hati Chang

Profil aktivitas antiproliferasi ekstrak kloroform kulit buah Phaleria macrocarpa terhadap sel HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang.

80 70
Viabiliti sel (% )

60 50 40 30 20 10 0 -3.4 -3.1 -2.8 -2.5 -2.2 -1.9 -1.6 -1.3 -1

Log [kepekatan (ug/ml)] HeLa

Grafik 4.

HM3KO

MCF-7

Hati Chang

Profil aktivitas antiproliferasi ekstrak kloroform biji Phaleria macrocarpa terhadap sel HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang.

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -3.4

V iab iliti sel (% )

-3.1

-2.8

-2.5

-2.2

-1.9

-1.6

-1.3

-1

Log [kepekatan (ug/ml)] HeLa

Grafik 5.

HM3KO

MCF-7

Hati Chang

Profil aktivitas antiproliferasi tamoksifen terhadap sel HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang.

Grafik 1 menunjukkan hasil perlakuan ekstrak kloroform daun mahkota dewa terhadap titisan sel (HeLa, HM3KO, MCF-7). Tiada diperoleh nilai IC50 lebih kecil dari 20 g/ml yang bermakna tiada penghambatan pertumbuhan yang signifikan pada titisan sel kanker. Tetapi, ekstrak kloroform daun lebih aktif terhadap sel HeLa (40,19 4,89 g/ml) berbanding sel HM3KO (62,90 2,89 g/ml) dan MCF-7 (70,79 4,21 g/ml) serta menghambat pertumbuhan sel normal hati Chang (14,97 0,74 g/ml). Grafik 2 adalah hasil perlakuan ekstrak kloroform kulit batang ke atas panel titisan sel. Nampak tiada nilai IC50 yang sesuai dengan ketentuan ANCI yang bermakna tiada efek penghambatan yang signifikan ke atas sel-sel kanker tetapi menghambat pertumbuhan sel normal hati Chang (6,67 0,81 g/ml). Ekstrak ini lebih aktif terhadap sel HM3KO (31,62 4,32 g/ml) berbanding sel HeLa (55,62 2,72 g/ml) dan MCF-7 (70,79 3,54 g/ml). Grafik 3 merupakan hasil perlakuan ekstrak kloroform kulit buah pada panel titisan sel. Tiada diperoleh nilai IC50 yang signifikan, bahkan efek antiproliferasi ekstrak ini relatif sama terhadap sel HeLa (63,83 0,74),HM3KO (63,94 0,10 g/ml) dan MCF-7 (69,59 1,70 g/ml) tetapimenghambat pertumbuhan sel normal (8,66 1,27 g/ml). Grafik 4 menunjukkan hasil perlakuan ekstrak kloroform biji ke atas panel titisan sel (HeLa, HM3KO, MCF-7 dan hati Chang). Ekstrak kloroform biji didapati mampu menghambat pertumbuhan ke atas sel kanker HM3KO pada nilai IC50 19,95 3,57 g/ml. Efek antiproliferasinya berbeda secara signifikan terhadap sel HeLa (58,63 4,29 g/ml) dan MCF-7 (62,43 3,32 g/ml). Namun demikian, efek antiproliferasinya tidak selektif karena juga menghambat pertumbuhan sel

normal (18,12 1,32 g/ml). Keseluruhan hasil IC50 diringkas pada Tabel II di bawah ini. Nilai IC50 tamoksifen 4,5 kali lebih kuat berbanding ekstrak kloroform biji pada sel kanker HM3KO, tetapi tamoksifen juga tidak selektif terhadap sel normal hati Chang (Gambar 5) karena menghambat pertumbuhannya. Menurut Kamuhabwa et al. (2000), ekstrak dengan nilai IC50100 g/ml tetap dikatakan memiliki potensi antiproliferasi meskipun nilainya kecil (level +). Upaya meningkatkan potensi antiproliferasi dapat dilakukan melalui fraksinasi dan isolasi terhadap ekstrak kasarnya. Proliferasi sel dipercayai memainkan peran penting dalam pencegahan dan

perkembangan sel kanker (Mori et al. 2004). Dalam penelitian ini, terbukti ekstrak kloroform biji mahkota dewa memiliki nilai IC50 19,95 3,57 g/ml terhadap sel kanker HM3KO. Dimungkinkan efek antiproliferasi berhubungan dengan kemampuannya dalam menghambat signal transduksi dan program kitar sel (cell cycle). Ekstrak ini potensial untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker kulit melanoma melalui kajian lanjutan menggunakan hewan uji (in vivo). Ini karena hasil kajian in vitro dapat memberikan data permulaan dalam kajian in vivo agar diperoleh pemahaman terhadap kelainan melanositik yang melekat pada melanoma (Beermann 2006). Tabel II. Efek antiproliferasi ekstrak kloroform Phaleria macrocarpa berbanding tamoksifen terhadap titisan sel kanker manusia dan sel normal.

Sampel

HeLa ( g/ml)

HM3KO ( g/ml)

MCF-7 ( g/ml)

Hati Chang ( g/ml)

Kloroform daun Kloroform kulit batang Kloroform kulit buah Kloroform biji Tamoksifen

40,19 4,89

62,90 2,89

70,79 4,21

14,97 0,74

55,62 2,72

31,62 4,32

70,79 3,54

6,67 0,81

63,83 0,74

63,94 0,10

69,59 1,70

8,66 1,27

58,63 4,29

19,95 3,57

62,43 3,32

18,12 1,32

7,12 0,17

4,22 0,09

8,52 0,28

2,28 0,06

KESIMPULAN
Ekstrak kloroform biji mahkota dewa menunjukkan efek antiproliferasi terhadap titisan sel kanker HM3KO dengan IC50 19.95 3.57 g/ml. Efek antiproliferasinya bersifat tidak selektif apabila menunjukkan penghambatan pertumbuhan pada titisan sel normal hati Chang dengan nilai IC5018.12 1.32 g/ml. Ekstrak kloroform biji mahkota dewa dapat dipilih sebagai agen kemopreventif terhadap kanker kulit melanoma secara in vivo.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kepada Prof. Dr. Azimahtol Hawariah Lope Pihie diucapkan terima kasih di atas budi baiknya dalam memberikan tunjuk ajar dan bahan penelitian.

DAFTAR PUSTAKA
Apantaku, L.M. 2002. Breast-conseving surgery for breast cancer. Am. Fam. Physician66(12): 2271-2278. Beermann, F. 2006. Modeling melanoma. Drug Discovery Today: Disease Models1(2): 129-135. Cardellina II, J.H., Fuller, R.W., Gamble, W.R., Westergaard, C., Boswell, J., Munro, M.H.G., Currens, M. & Boyd, M.R., 1999. Evolving strategies for the selection, dereplication and prioritization of antitumor and HIV-inhibitory natural products extract. Dlm. Bohlin, L. & Bruhn, J.G. (pnyt.). Biossay methods in natural product research and development. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. Ferrandina, G., Ranelletti, F.O., Larocca, L.M., Maggiano, N., Fruscella, E., Legge, F., Santeusanio, G., Bombonati, A., Mancuso, S. & Scambia, G. 2001. Tamoxifen mudolates the expression of Ki67, apoptosis and microvessel density in cervical cancer. Clin. Can. Res. 7: 2656-2661. Hawariah, A.L.P. 1998a. Kanser payudara. Serdang: Penerbit Universiti Putra Malaysia. Hawariah, A.L.P. 1998b. Memahami kanser. Serdang: Penerbit Universiti Putra Malaysia. Hayouni, E., Abedrabba, M., Bouix, M. & Hamdi, M. 2007. The effects of solvents and extraction method on phenolic contents and biological activities in vitro of Tunisian Quercus coccifera L. and Juniperus phoenicea L. fruits extracts. Food Chem. 105: 1126-1134. Itharat, A., Houghton, P.J., Eno-Amooquaye, E., Burke, P.J., Sampson, J.H. & Raman, A. 2004. In vitro cytotoxic activity of Thai medicinal plants used tradisionally to treat cancer. J. Ethnopharmacol.90: 33-38. Jagetia, G.C. & Baliga, M.S. 2005. The effect of seasonal variation on the antineoplastic activity of Alstonia scholaris R.Br. in HeLa cells. J. Ethnopharmacol. 96: 37-42. Kamuhabwa, A., Nshimo, C. & de Witte, P. 2000. Cytotoxicity of some medicinal plant extracts used in Tanzanian tradisional medicine. J. Ethnopharmacol.70: 143-149. Lieberman, M.M., Patterson, G.M.L. & Moore, R.E. 2001. In vitro bioassay for anticancer drug screening: effects of cell concentration and other assay parameters on growth inhibitory activity. Cancer Letter173: 21-29. Lin, L. & Hwang, P.L. 1991. Antiproliferative effects of oxygenated sterols: positive correlation with binding affinities for the estrogen-binding sites. Biochem-et-Biophysica-Acta1082: 177184. Lisdawati, V. 2002. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT): bioassai antikanker in vitro dengan sel leukimia L1210 dan isolasi serta penemuan struktur molekul senyawa kimia dari buah mahkota dewa [Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl]. Tesis, Program Studi Ilmu Kefarmasian, Departemen Farmasi-PMIPA, Universitas Indonesia. Mori, H., Niwa, K., Zheng, Q., Yamada, Y., Sakata, K. & Yoshimi, N. 2001. Cell proliferation in cancer prevention: effects of preventive agents on estrogen-related endometrial carcinogenesis model and on an in vitro model in human colorectal cells. Mut. Res.480481: 201-201. Newman, D.J., Cragg, G.M. & Snader, K.M. 2000. The influence of natural products on drug discovery. Nat. Prod. Rep.17(3): 215-234.

Rahardjo, M., Darwati, I dan Shusena, A. 2006. Produksi dan mutu simplisia Purwoceng berdasarkan lingkungan tumbuh dan umur tanaman. Bahan Alam Indonesia5(1): 310-316. Spitaler, R., Schlorhaufer, P.D., Ellmerer, E.P., Merfort, I., Bortenschlager, S., Stuppner, H. & Zidorn, C. 2006. Altitudinal variation of secondary metabolite profiles in flowering heads of Arnica Montana cv. ARBO. Phytochemistry67: 409-417.