BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1 Rancangan Penelitian Perlakuan vaksinasi dengan lima vaksin komersial dilakukan dengan 4 ulangan (A1, A2, B1 dan B2) pada ayam pejanat layer sebagai media untuk mendapatkan serum. Serum diambil 3 minggu setelah vaksinasi. Pengambilan dilakukan satu minggu kemudian sampai didapatkan serum dalam jumlah 8 ml. 10 antigen virus AI-H5 disiapkan dengan melakukan uji HI menggunakan virus referen AI-H5 sehingga didapatkan 10 virus dengan subtipe H5. Sampel yang sudah positif AI-H5 kemudian dilakukan retritasi (titer dalam uji HI standard 4HA unit). Uji HI untuk mengetahui titer tiap antigen terhadap tiap serum antibodi.
Analisis data dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap menggunakan Analysis of Variance (ANAVA) dengan uji HSD (Honestly Significant Difference) dengan taraf signifikansi 5% (Kusriningrum, 2008). Analysis of Variance (ANAVA) maupun uji HSD dilakukan dengan menggunakan fasilitas program perangkat lunak SPSS (statistical product and service solution) versi 17.0 for Windows.

3.2

Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian yang dilakukan mulai bulan Maret 2008 November

2009

di

Departemen Airlangga

Mikrobiologi yang meliputi

Fakultas

Kedokteran serum,

Hewan inaktifasi

Universitas

pengumpulan

serum, inokulasi antigen pada Telur Ayam Bertunas (TAB), tes HA dan HI.

18

19

3.3

Alat dan Bahan Penelitian

3.3.1 Alat Uji HI Test Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spuit + needle, rak tabung reaksi, lemari pendingin, centrifuse, mikroplate bentuk v, mikro pipet, gelas beker 100 ml, labu erlenmeyer 100 ml, botol gelas, pipet hisap 1, 5 dan 10 ml, pipet Pasteur, pembakar Bunsen serta korek

api, PZ, eritrosit ayam, alcohol 70%, aquades steril, kapas steril, dan anti koagulan EDTA.

3.3.2 Layer Pejantan Dalam mendapatkan serum antibodi spesifik menggunakan media ayam layer pejantan. Penggunaan ayam ras layer pejantan dimaksudkan karena pertimbangan kecepatan pertumbuhannya lebih dari ayam kampung (dalam penelitian ini layer pejantan digunakan sebagai saranan/ media dalam mendapatkan serum antibodi dari vaksin). Layer pejantan yang dianggap bebas dari paparan virus dan vaksinasi dengan melihat hasil uji HA dan HI dari masing masing ayam. Layer pejantan yang dibutuhkan sebanyak 10 ekor yang dibagi dalam 5 kelompok, sehingga masing masing kelompok terdapat 2 ekor. Pada umur 4 minggu dilakukan vaksinasi. Kemudian setelah mencapai umur 3 minggu dilakukan uji serologis HI dengan mengambil serum darah masing masing ayam dengan menggunakan spuit sebanyak 3 cc.

20

3.3.3

Vaksin inaktif AI Vaksin Al yang diperoleh dari distributor sebanyak lima jenis vaksin

komersial di Indonesia baik buatan luar negeri atau lokal Indonesia, berupa vaksin inaktif dalam adjuvan minyak (emulsi). Vaksin yang digunakan juga terdapat yang homolog dan heterolog.

3.4

Metode Penelitian

3.4.1 Penentuan Lokasi Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan pasar unggas hidup di kota Surabaya yang mempunyai resiko tinggi terhadap penyebaran virus Avian Influenza.

3.4.2 Isolasi Virus Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah swab kloaka ayam buras yang didapat dari satu individu. Pengambilan sampel swab kloaka ayam buras dilakukan dengan menggunakan cottonbud steril. Hasil swab kemudian dimasukkan dalam mikrotube yang telah berisi media transport. Setelah itu, diberi nomor sampel pada mikrotube dan sampel tersebut dimasukkan dalam ice box yang telah berisi cooler. Sampel yang telah didapat secepatnya dikirim ke laboratorium. Spesimen untuk tujuan isolasi virus harus secepatnya disimpan dalam keadaan dingin.

21

Sampel

Uji HA

Sampel Positif

4HA Unit Uji HI

Positif

Negatif

Gambar 3.1 Diagram alir pengumpulan isolat virus AI/H5 (Sampel : isolat dari pasar yang berada difeces atau swab trakea yang berasal dari ayam; kemudian dilakukan uji hemaglutinasi (HA); jika sampel positif islat dibuat menjadi 4 HA unit; kemudian dilakukan uji Hemaglutination Inhibition untuk melihat sampal itu positif AI/H5 dengan menggunakan serum yang berasal dari virus referen. 3.4.3 Pengumpulan Serum Setelah empat minggu pasca vaksinasi, maka pengambilan serum antibodi yang terbentuk dari hasil vaksinasi pada masing kelompok yang terdiri dari 2 ekor perkelompok dengan lima vaksin komersial yang beredar di Indonesia. Sehingga ada di masing masing kelompok akan mewakili respon antibodi yang terbentuk pasca vaksinasi. Setelah di ambil darah sekitar 3 ml dengan menggunakan spuit 5 ml di biarkan di suhu ruangan selama proses pembekuan. Jika pembekuan telah sempurna, bagian dinding spuit sebisa mungkin untuk dipisahkan dengan darah. Diharapkan serum yang keluar menjadi lebih banyak. Kemudian disimpan dalam refrigrator selama kurang lebih 24 jam. Pemisahan serum dilakukan dengan menggunakan mikropipet dan ditampung dalam microtube. Darah yang masih terdapat pada cairan serum dipisahkan dengan cara mensentrifus serum dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Hasil centrifuge akan memisahkan serum dengan darah, yang kemudian dipisahkan pada microtube lainnya.

22
Vaksinasi masing masing ayam bloiler pejantan dengan vaksin Medivac (A) pada pejantan 1; Nobilis (B) pada pejantan 2; Gallimun (C) pada pejantan 3; Avimec (D) pada pejantan 4; Quanjuo (E) pada pejantan 5

Ayam Layer Pejantan 1

Ayam Layer Pejantan 2

Ayam Layer Pejantan 3

Ayam Layer Pejantan 4

Ayam Layer Pejantan 5

Pengambilan Darah

Serum Antibodi

Uji HI viru referen H5

Titer antibodi

Gambar 3.2 Diagram alur koleksi serum antibodi pasca vaksinasi dengan uji hemaglutination inhibition dengan antigen referen H5 puesvetma Surabaya. 3.4.4 Inaktivasi Serum Antibodi Serum antibodi yang benar-benar telah homogeny kemudian masukkan dalam waterbath suhu 56 oC selama 30 menit. Kemudian siap untuk dilakuan uji HI atau disimpan dalam frezer.

3.4.5 Pembuatan Suspensi Eritrosit 0,5% Dalam melakukan uji HA mikroteknik dan uji HI mikroteknik, diperlukan suspensi eritrosit dengan konsentrasi 0,5%. Cara mendapatkan suspensi eritrosit dengan konsentrasi 0,5% adalah sebagai berikut: darah ayam diambil melalui vena brachialis dengan menggunakan spuit + needle diambil (3 ml) kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan EDTA. Darah tersebut dipusingkan selama 15 menit

23 dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapannya dicuci dengan menambahkan PZ, kemudian dipusingkan lagi selama 15 menit. Setelah terjadi endapan kembali, supernatannya dibuang.

Pencucian tersebut diulang sampai tiga kali dengan cara yang sama. Untuk mendapatkan suspensi eritrosit ayam 0,5% maka eritrosit ayam tersebut ditambah dengan PZ hingga berkonsentrasi 0,5%. Pertama buat konsentrasi eritrosit menjadi 5 % dahulu dengan mengambil 0.5 ml eritrosit masukkan tabung glass tambahkan 9,5 ml PZ. Kemudian eritrosit 5 % tersebut satu dijadikan bagian 0.5% eritrosit dengan 5% pengencaran ditambah 10 kali dengan PZ

mengambil

sembilan

bagian

homogenisasi dengan perlahan.

3.4.6 Uji Hemaglutinasi (HA) Mikroteknik Uji hemaglutinasi (uji HA) dapat digunakan untuk mendeteksi virus yang memiliki hemaglutinin. Adanya hemaglutinin akan dapat mengaglutinasi eritrosit dari beberapa spesies, seperti unggas, mamalia maupun manusia. Selain dapat mendeteksi adanya virus yang memiliki hemaglutinin, uji HA juga bisa digunakan untuk mengukur titer antigen. Uji HA mikroteknik pada penelitian ini digunakan untuk mengetahui titer isolat dan juga dapat digunakan untuk retitrasi antigen. Alat yang digunakan untuk uji ini adalah microplate V . Langkah-langkah dalam uji HA mikroteknik, diawali dengan memasukkan 0,025 ml PZ kedalam tiap sumur microplateV. Kemudian tambahkan 0,025 ml cairan alantois kedalam sumur pertama, homogenkan lalu pindahkan 0,025 ml ke sumur ke-2 dan seterusnya. Langkah selanjutnya dengan menambahkan 0,025 ml

24 PZ kedalam tiap sumur microplateV, dan ditambahkan 0,05 ml dari 0,5 % sel darah merah ayam ketiap sumur, kocok perlahan dan biarkan sekitar 20-30 menit pada temperatur 20oC, lalu dibaca titernya. Untuk lubang microplate pada baris H digunakan sebagai kontrol eritrosit. Hasil HA positif dinyatakan dengan terjadinya aglutinasi atau tidak terjadi pengendapan eritrosit.

3.4.7 Retitrasi Antigen Empat HA Unit Untuk menguji ketepatan pengenceran perlu dilakukan retitrasi dengan cara yang sama seperti pada uji HA, tetapi dengan menggunakan antigen yang telah diencerkan. Sebelum dilakukan retitrasi antigen 4 HA unit, maka antigen yang akan dipakai terlebih dahulu diinaktifkan dengan mengunakan formalin 0,1% dan didiamkan selama satu malam didalam lemari es. Langkah pertama yang dilakukan untuk retitrasi antigen 4 HA unit, adalah mengisikan 0,025 ml PZ kedalam lubang microplateV dari nomor satu sampai lima dengan menggunakan mikropipet dengan volume 0,025 ml. Setelah itu, lubang pertama diisi dengan antigen yang telah diencerkan (antigen 4 HA unit) sebanyak 0,025 ml dengan mikropipet. Dengan menggunakan mikropipet, antigen dan PZ pada lubang pertama dicampurkan dengan jalan menghisap dan mengeluarkan cairan pada lubang satu. Kemudian ambil cairan pada lubang satu sebanyak 0,025 ml dan masukkan pada lubang berikutnya sampai lubang nomor 4, prosedur dilakukan sama seperti perlakuan pada lubang nomor satu. Lubang nomor lima tanpa penambahan antigen, karena digunakan sebagai kontrol eritrosit. Selanjutnya semua lubang diisi dengan PZ sebanyak 0,05 ml dan setelah itu, ditambahkan eritrosit ayam 0,5 % sebanyak 0,025 ml. Bila pengenceran pada

25 uji HA tepat, maka pada lubang nomor satu dan lubang nomor dua akan terjadi aglutinasi.

3.4.8 Uji Hambatan Hemaglutinasi ( HI ) Mikroteknik Uji HI mikroteknik menggunakan lubang mikroplat bottom V diisi PZ sebanyak 25 l pada semua lubang yang ada dengan menggunakan mikrom pipet. Lubang nomor satu dan sebelas belas diisi dengan serum yang diperiksa sebanyak 25 l sedang lubang 12 sebagai kontrol. PZ dan serum pada lubang nomor satu dicampur dengan menggunakan pipet mikro, kemudian mikrodiluter (beserta PZ+serum sebanyak 25 l) dipindahkan kelubang nomor berikutnya. Demikian seterusnya sampai lubang nomor sepuluh. Lubang nomor satu sampai sepuluh diisi dengan antigen empat HA unit sebanyak 25 l dengan menggunakan pipet dropper. Inkubasikan pada suhu kamar selama tiga puluh menit. Setelah diinkubasikan pada suhu kamar selama tiga puluh menit, semua lubang diisi eritrosit ayam 0,5% sebanyak 50 l dengan menggunakan pipet dropper 50 l. Selanjutnya diinkubasi lagi selama tiga puluh menit pada suhu kamar atau sampai kontrol eritrosit pada lubang nomor sebelas dapat dibaca. Pada kontrol tersebut terjadi pengendapan eritrosit seperti titik merah pada dasar lubang mikroplat. Pada lubang nomor dua belas merupakan kontrol serum yang dalam hal ini digunakan sebagai pembanding (Ernawati dkk, 1996).

26
Serum Antibodi E Serum Antibodi D Serum Antibodi C Di uji dengan metode HI antara Serum antibodi A dengan isolate AI kemudian Serum antibodi B dan seterusnya Serum Antibodi B Serum Antibodi A

Gambar 3.3 diagram alur uji reaktifitas hambatan hemaglutination inhibition (HI) serum terhadap Isolat AI/H5 asal ayam Surabaya, mekanisme pengujian masing masing isolat antigen direaktifkan dengan seluruh antibodi A, B, C, D dan E. Kemudian data titer yang muncul di lanjutkan dengan uji BJN/Tukey HSD.

3.5

Nilai titer serum antibodi yang terbentuk pada masing masing kelompok pasca vaksinasi terhadap isolat virus.

Isolate 9

Peubah yang Diamati Peubah yang dapat diamati pada penelitian ini adalah :

Isolate 9

Isolate 8

Isolate 7

Isolate 6

Isolate 5

Isolate 4

Isolate 3

Isolate 2

Isolate 1