LAPORAN AKHIR BIOANALISIS P3 PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL

KELOMPOK D : Agitha purwaningsih Puji leastari Bhaskara maulana Ratih Juwita Ninda G1F009046 G1F009047 G1F009048 G1F009049

ASISTEN:AKHMAD FIKI FIRDAUS

LABORATORIUM KIMIA FARMASI JURUSAN FARMASI FAKULTAS KESEHATAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN JURUSAN FARMASI PURWOKERTO

2012

I.

JUDUL PERCOBAAN Penetapan Kadar Karbohidrat Total

II.

TUJUAN PERCOBAAN Melakukan penetapan kadar karbohidrat total dalam plasma darah menggunakan metode enzimatik (GOD)

III. ALAT DAN BAHAN Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah pipa kapiler, tabung reaksi, pipet mikrometer, pipet volume, sentrifuge, kuvet dan spektrofotometer UV. Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah darah tikus , heparin, aquades, reagen dan glukosa.

IV. PROSEDUR PERCOBAAN 1. Blanko Aquades Diambil 20 Ditambahkan 2 ml reagen

Hasil

2. Standar Glukosa
Hasil

Diambil 20 Ditambahkan 2 ml reagen Diukur absorbansinya pada 485 nm

3. Sampel Darah tikus Diambil 2 ml dengan pipa kapiler Dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah ditetesi heparin Disentrifugasi Diambil plasmanya (20 L masing-masing kelompok) Ditambah 2ml reagen Didiamkan selama 20 menit Diukur absorbansinya pada 485 nm Dihitung kadar glukosanya
Hasil

V.

DATA PENGAMATAN Absorbansi standar = 0,555

Kel. 1. 2. 3. 4.

Absorbansi 0,434 0,446 0,433 0,448

Kadar Glukosa (mg/dL) 78,198 80,36 78,02 80,72

VI. PERHITUNGAN

Kadar glukosa =

Kadar glukosa 1 = Kadar glukosa 2 = Kadar glukosa 3 =

100 mg/dL = 78,198 mg/dL 100 mg/dL = 80,36 mg/dL 100 mg/dL = 78,02 mg/dL

Kadar glukosa 4 =

100 mg/dL = 80,72 mg/dL

X (rata-rata) = = 79,32 mg/dL

*(

) ( (

) ( )

) (

)+

= 2,807

Jadi kadar glukosa tikus 79,32 + 2,807 mg/dL

VII. PEMBAHASAN Monografi bahan yang digunakan dalam praktikum adalah : a. Glukosa

Rumus molekul Pemerian

:C6H12O6 :Hablur tidak berwarna, serbuk hablur atau butiran putih, tidak berbau, rasa manis. Glukosa mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,5% C6H12O6, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

Kelarutan

:Mudah larut dalam air, sangat mudah larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam etanol (95%)P mendidih, sukar larut dalam etanol (95%) P.

b. Aquades (H2O) Rumus molekul Massa molar Densitas dan fase : H2O : 18.0153 g/mol : 0.998 g/cm, cairan

0.92 g/cm, padatan Titik lebur Titik didih Pemerian : 0 C (273.15 K) (32 F) :100C(373.15K)(212F) :Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa. Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik (Mulyono, 2006) c. Fenol / phenolum Rumus molekul Pemerian :C6H5OH :Hablur bentuk jarum atau massa hablur; tidak berwarna atau merah jambu; bau khas; kaustik. Fenol mengandung tidak kurang dari 99,0%. Kelarutan :Larut dalam 12 bagian air; mudah larut dalam etanol, dalam kloroformP, dalam eterP, dalam gliserolP dan dalam minyak lemak (Anonim, 1995) d. 4-aminoantipyrine

e. Buffer fhosfat sifat yang paling menonjol dari buffer ini seperti pH buffer hanya berubah sedikit pada penambahan sedikit asam atau basa. Buffer yang bersifat asam memiliki pH kurang dari 7 sedangkan buffer basa memiliki pH lebih dari 7. Buffer yang bersifat asam biasanya terbuat dari asam lemah dan basa konjugatnya. Sedangkan buffer yang bersifat basa biasanya terbuat dari basa lemah dan asam konjugatnya.Buffer fosfat adalah buffer netral dengan kisaran pH 7. Pada makhluk hidup, buffer fosfat umumnya terdapat pada sitoplasma sel. Buffer fosfat dapat dibuat dengan menggunakan monosodium fosfat (NaH2PO4) dan basa konjugatnya yaitu disodium fosfat (Na2HPO4). f. Peroksidase Peroksidase adalah enzim yang stabil terhadap panas, sehingga seringdigunakan sebagai pengukuran indeks efektivitas blansing. Peroksida memilikiperanan pada

kerusakan oksidatif selama penyimpanan sayuran.. Peroksidase kelas enzim golongan oksireduktase yang mengkatalis oksidasi substrat organik dengan H2O2 dan mereduksinya menjadi H2O Pembahasan praktikum 1. Metode enzimatik GOD Glukosa adalah gula yang terpenting bagi metabolisme tubuh, di kenal juga sebagai gula fisiologis . dalam ilmu kedokteran gula darah adalah istilah yang mengacu kepada tingkat glukosa di dalam darah.sedangkan dalam tumbuhan glukosa 6-n fodfat yang di hasilkan selama fotosintetis adaaalah precusor dari tiga jenis karbohidrattumbuhn , yaitu sukrosa pati dan selulosa. Konsentrasi gula darah atau tingkat glukosa serum, di atur dengan ketat di dalam tubuh. Glukosa yang di alirkan melalui darah adalah sumber utama energi untuk sel- sel tubuh. Meskipun di sebut gula darah, selain glukosa kita gija menemukan jenis- jenis gula lainnya, seperi fruktosa dan galaktosa, namun demikian , hanya tingkatan glukosa yang di atur melaui insulin dan leptin. Dalam pemeriksaan klinik, penentuan kadar gula dalam darah dapat di lakukan berdasarkan Senyawa- senyawa mereduksi : gula reduksi gula yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi. Hal ini di karenakan adanya gugus aldehid atau ketin bebas. Senyawa- senyawa yang mengoksidasi atau bersifar reduktor adalah logamlogam oksidatir seperti Cu. Contih gula yang termasuk gula reduksi adalah guloksa manosa, fruktosa, laktosa, maltosa dan lain- lain. Prinsip penentuannya di dasari pada kemampuan gukosa untuk meredksi ion anorganik seperti Cu2+ . penentuan gukosa secara reduksi kurang spesifik di banding cara

nbzimatik,terutama bila dalam darah terdapatbahan yang dapat mereduksi misalnya kreatinin , asam urat dan gula-gula lain selain glukosa ( manosa, galaktosa dan laktosa) yang akan membrikan hasil pemeriksaan yang lebih tinngi daripada kadar gukosa yang sebenernya. Karbohidrat total: pengukura kadar karbohidrat dala serum atau plasma di gunkan untuk diagnosa dan monitoring treatment diabtets melitis, serta untuk mendeteksi hipoglikemia, fungsi pankreas, arcinoma seldan kemingkian terdapat berbagai penyakit linnya yang di sebabkan oleh kelainan metabolisme karbohidrat. Prinsipnya yaitu glukosa di oksidasi menjadi asam glukonat dan H202 denagn enzim GoD, kemudian H2)2 di reaksikan dengan peroksidase dan

O- di anisisn menghasilkan senyawa berwarna yang dapat di baca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 500 nm Enzimatik gula darah: glukosa dapat di tentuka kadarnya secara enzimatik, misalnya dengan penambhan enzim gukosa oksidase (GOD), prinsip kerja metode ini adalah metode enzimatik d bantu enzim- enzim contoh katalase ( reaksi HNtz) dan peroksodase ( reaksi trinder) pereagen yang di gunakan menggunakan pereagenGOD- PAP. Absorbansi panjang gelobang warna absorbansi metode enzimatik intesitasnya pada panjang gelombang 500 nm dengan waran merah ( sdari H2O2 yeng terbentuk + peroki9dase). Dengan prinsip dasar glukos di oksidai oleh oksigen dengan katalis enzim glukosa oksodase ( GOD) ajkan membentuk asam gk]lukonik dan hisrogen peroksida (H2O2). Dengan adanya oksigen atau udara, glukosa di oksidasu oleh enzim menjadi asam glukoronat di sertai pembentuak H2O2 membebaskan O2 yang mengoksidasi aseptor kromogen yang sesuai serta memberika warna yang sesuai pula.kadar glukosa darah di tentukan berdasrkan intensitas warna yang terjadi, di ukur secara spektrofotometri. Hidrogen peroksida akan bereaksi dengan 4aminoantipyirin dan fenol dengan katalis peroksidase (POD) membnetuk quinoenimine dan air. Quinoenimine ini merupakan indikator yang menunjukan kadar gikosa dalam darah.Gukosa + 02 asam glukonat + H2O2 4

aminoantipirin + fenol quinonemine H2O. Pada reaksi ini terbentuk H2O2 yang dengan peroksidase (POD) akan bereaksi dengan 2,4 diklorofenol dan 4 amino antipirin. Oksidasi ini menimbulan zat warna merah antipirin quinonemine yang intensitasnya sebanding dengan kadar glikose yang di ukur secara fotometrik. Kelebihan dari metode enzimatik ialah spesifik, presisi tinggi, relatif bebas dari gangguan dan cocok di adaptasikan untuk otomatisasi. Sedangkan

kekurangannya antara lain adanya efek steriod namun sangat minim karena kadar yang sangat kecil Pada praktikum kali ini, glukosa ditetapkan kadarnya setelah dioksidasi secara enzimatis menggunakan enzim GOD (glucose oksidase). H2O2 yang terbentuk kemudian bereaksi dengan fenol dan 4-aminoantipirin dengan katalis enzim peroksidase (POD) yang membentuk quinoneimine. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi glukosa dalam sampel (Anonim,2009)

Metode Glukosa Oksidase (GOD-PAP)memiliki prinsip yaitu enzim glukosa oksidase mengkatalisis reaksi oksidasi glukosamenjadi glukonolakton dan hydrogen peroksida.

Penambahan

enzim

perokidase

dan

aseptor

oksigen

kromogenik

seperti

(Wirahadikusumah,1985)

Tujuan dari percobaan kali ini adalah untuk menentukan kadar glukosa dalam darah denganmetode GOD-PAP.Metode GOD-PAP adalah salah satu metode penentuan kadar glukosa . Reaksinva adalah:

Glukosa oksidase (GOD) mengkatalisis oksidase glukosa, pada reaksi initerbentuk H-O-H , yang dengan adanya peroksidase (POD) akan bereaksi dengan fenol dan aminoantipirinmenimbulkan zat warna (Mayes,1984). 2. Cara Kerja dan fungsi penambahan Langkah awal yang dilakukan adalah mengukur absorbansi standar glukosa dengan blanko aquades. Dan dilanjutkan dengan analisis absorbansi plasma darah tikus. Cara kerja adalah a) Preparasi sempel (plasma) Diambil darah kurang lebih 2 ml lalau setelah itu di sentrifuse b) Penetapan kadar

Sampel (plasma 20 L), Blangko (aquadest 20 L) dan standar ( standar 20 L) di tambah reagen 2 ml dan di capur lalu setelah itu di inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar Baca Absorbansi pada panjang gelombang 485 nm Analisis sampel yang dilakukan dalam percobaan adalah mengambil sampel darah dari seekor tikus melalui ekornya menggunakan silet. Darah ditampung dalam tabung sentrifugasi sebanyak 2 ml yang sebelumnya ditetesi dengan heparin. Penambahan heparin ini berfungsi untuk mencegah koagulasi atau penggumpalan dari darah. Setelah itu darah disentrifugasi untuk diambil plasma darahnya. Proses sentrifugasi ditujukan untuk memisahkan plasma darah dari protein-protein yang mengganggu berdasarkan bobot molekulnya dimana protein yang memiliki bobot molekul yang lebih besar sehingga akan mengendap di bawah. Plasma darah sebagai sampel uji diambil sebanyak 20 l dengan menggunakan mikropipet. Kemudian ditambahkan dengan 2 ml reagen. Reagen tersebut berisi : Phosphate buffer pH 7,5 Phenol 4-Aminoantipyrine Glucose oxidase Peroxidase 250 mmol/L 5 mmol/L 0,5 mmol/L 10 kU/L 1 kU/L.

Macam-macam metode pengambilan darah dari tikus antara lain adalah:

1. Pengambilan darah dilakukan pada ekor mencit. Kelebihan dari metode ini adalah

metode mudah dilakukan akan tetapi hanya diperoleh jumlah sampel darah yang sedikit. Caranya adalah: a. Dibersihkan ekor mencit menggunakan alkohol dengan cara digosok dari pangkal hingga ke ujung ekor agar darah tampak jelas dan melabar. b. Dilakukan pengambilan darah dengan jarum injeks atau dengan memotong ekor mencit. c. Diambil darah mencit mulai dari bagian tengah ekor hingga pangkal ekor. Pengambilan darah dalam jumlah sedikit dilakukan dengan memotong ekor mencit.
2. Pengambilan darah melalui mata.

Kelebihan metode pengambilan sampel darah melalui mata mencit adalah dapat diperoleh sampel darah dalam jumlah besar dan cepat akan tetapi apabila pengambilan tidak dilakukan dengan hati-hati maka dapat melukai mata tikus bahkan

bisa menyebabkan kebutaan. Caranya adalah darah diambil lewat mata mencit dengan cara menusuk cabang vena opthalmicus yang terletak pada saccus medianus orbitales dengan pipa kapiler. Darah yang mengalir lewat pipa kapiler ditampung dalam tabung ependorf yang dipegang miring. Darah tersebut dialirkan lewat dinding tabung ependorf untuk menghindari terjadinya hemoli-sis. Penambahan glucose oxidase untuk membantu proses reaksi biokimia glukosa. Peroxidase digunakan dalam reaksi biokimia antara 4-aminoantipyrine dengan phenol sehingga menghasilkan quinoneimine. Buffer phosphate memiliki sifat dapat menghambat aktivitas dari beberapa metabolic enzim termasuk karboksilase, fumarase, dan phosphor glucomutase. Glukosa oksidase (GOD) adalah enzim yang mengkatalisis oksidasi -Dglukosa menjadi glukonolakton yang kemudian dengan adanya molekul air terhidrolisis menjadi asam glukolonat dan peroksida(Adhisuwignjo et al, 2008). Setelah itu, dilakukan inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar 20-25C. Proses inkubasi ini ditujukan agar reaksi berjalan sempurna. Langkah terakhir adalah dengan mengukur absorbansinya pada spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang yang didapat dari pengukuran standar dengan blanko aquades. Panjang gelombang maksimum yang didapat adalah 485 nm. Metode ini digunakan untuk mengukur kadar glukosa pada rentang 1 400 mg/dL (0,06 22,2 mmol/L). Ketika hasil yang diperoleh lebih dari rentang tersebut, sampel seharusnya diencerkan 1 + 4 dengan larutan NaCl (9 g/L). Pengukuran dilakukan minimal sebanyak 3 kali. Namun pada praktikum ini dilakukan sebanyak 4 kali. Pada hasil pengukuran diperoleh kadar absorbansi larutan standar sebesar 0,555, sehingga tidak diperlukan pengenceran. Hasil dari pengukuran absorbansi sampel dengan replikasi 3 kali adalah : Kel. 1. 2. 3. 4. Absorbansi 0,434 0,446 0,433 0,448 Kadar Glukosa (mg/dL) 78,198 80,36 78,02 80,72

Selanjutnya dilakukan penetapan kadar glukosa dengan rumus:

Kadar glukosa = Dari rumus tersebut didapatkan kadar sampel sebesar: 78,198 mg/dL ; 80,36 mg/dL ; 78,02 mg/dL ; 80,72 mg/dL. Kemudian dihitung nilai SD-nya, sehingga didapatkan nilai kadar gula sampel darah tikus sebesar 79,32 2,807 mg/dL. Selanjutnya dihitung dengan Faktor konversi : Glukosa (mg/dL) x 0,05551 = Glukosa (mmol/L). Sehingga didapatkan nilai kadar gula dalam darah adalah 4,403 0,1558 dalam mmol/L. 3. Spektrofotometer UV-Vis Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energy secara relative jika energy tersebut ditransmisikan atau direfleksikan sebagai fungsi dari panjang gelombang Prinsip dasar dari suatu spektrofotometer adalah penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu. Jenis-jenis spektrofotometer :berdasarkan pada daerah spektrum yang akan dieksporasi, terdiri dari :

Spektrofotometer sinar tampak (Vis). Spektrofotometer sinar tampak (Vis) dan ultraviolet (UV).

berdasarkan teknik optika sinar, terdiri dari : Spektrofotometer optika sinar ganda (double beams optic). Spektrofotometer optika sinar tunggal (single beams optic). Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spectrum tampak kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorbansi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Khopkar, S.M, 2002) Skema konstruksi spektrofotometer : Ketika cahaya putih dilewatkan dalam suatu substansi maka setiap warna cahaya yang dipantulkan akan memiliki panjang gelombang yang berbeda. Berkas cahaya tersebut diasumsikan sebagai warna komplemen dari panjang gelombang yang diserap. Mekanisme kerja dari spektrofotometer pada dasarnya adalah memencilkan cahaya menjadi monokromatik, yang kemudian cahaya tersebut dilewatkan pada suatu sampel yang akan diukur kekuatan radiasinya. Jika P merupakan banyaknya sinar sinar yang diteruskan oleh larutan sampel dan Po merupakan banyaknya sinar yang diserap, maka

ratio P/Po dapat kita sebut sebagai transmitansi. %: Selain mengukur transmitansi, spektrofotometer pada dasarnya adalah untuk mengukur absorbansi sampel karena adanya interaksi atom, molekul, dan ion pada sampel tersebut. Secara matematis kita dapat menuliskan hubungan antara Transmitansi sebagai berikut:

A = Log (1/T) = -Log T

Panjang gelombang yang diserap oleh sampel dari sejumlah cahaya yang diberikan akan sebanding dengan konsentrasi sampel dan ketebalan larutan sampel. Secara matematis hubungan ini diberikan oleh hukum Lambert beer:

A = bc Dimana: = absorptivitas molar (L.cm-1.mol-1) b = ketebalan kuvet (cm) c = konsentrasi (molL-1) Ada tiga macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu: 1. Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan (elektron sigma, elektron phi, dan elektron yang tidak berikatan atau non bonding elektron) 2. Penyerapan yang melibatkan elektron d dan f a. Penyerapan oleh ion-ion golongan lantanida dan aktinida b. Penyerapan oleh logam-logam golongan transisi pertama dan kedua 3. Penyerapan karena perpindahan muatan (Sudjadi, 2007). 4. Hasil vs Pustaka Pada praktikum ini didapatkan kadar karbohidrat total adalah sebesar 79,32 2,807 mg/dL. Sedangkan kadar karbohidrat normal berdasarkan teori adalah 70-106 mg/dL. Sehingga dengan demikian, hewan uji dinyatakan memiliki kadar gula yang normal. Glukosa oksidase digunakan dan diaplikasikan secara luas, digabungkan untuk peroksidase reaksi yang vizualizes colorimetrically itu H2O2 dibentuk, untuk penentuan glukosa bebas dalam serum atau plasma darah untuk diagnostik, menggunakan spektrometri tes secara manual atau dengan prosedur otomatis, dan bahkan titik menggunakan tes cepat. Tes serupa memungkinkan untuk memantau kadar glukosa dalam fermentasi, bioreaktor, dan untuk mengendalikan kadar glukosa.

Aplikasi dari pengujian kadar karbohidrat total dalam darah ini dapat digunakan dalam mendiagnosis penyakit Diabetes Melitus (DM). Penetapan kadar karbohidrat total bermanfaat untuk mengetahui kadar gula dalam darah, sehingga dapat mengetahui apakah pasien tersebut menderita hipoglikemia, hiperglikemia atau normal.

DAFTAR PUSTAKA Adhisuwignjo et al.2008.Penentuan Nutrien dalam Jaringan dan Plasma Tubuh. Hal 54 61.PAU Pangan dan Gizi. UGM. Yogyakarta Anonim. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Departemen Kesehatan RI : Jakarta. Anonim. 1979. Farmakope Indonesia edisi III. Departemen Kesehatan RI : Jakarta. Day, RA dan Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi Keenam. Jakarta: Erlangga Ganiswara. 1995. Farmakologi dan Terapi. Bagian Farmakologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia. Jakarta. Hendayana, S.(1994).Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu.Semarang:IKIP Semarang. Khopkar, S, M. (2002). Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

Lehninger.A.L, 1995. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta Nurfaisyah. 2011. http://nurfaisyah.web.id/spektrofotometri-uv-vis-serta-aspek-kualitatif-

dan-kuantitatifnya.html. diakses 26 April 2012. Satria, Yogi. 2011. Asam Sulfanilat. http://chemicalland21.com diakses tanggal 26 April 2012 Skoog, DA, West, DM, Holler, FJ, Crouch, SR. 1996. Fundamentals of Analytical Chemistry 7th edition. New York: Saunders College Publishing. Sudarmadji, S., Haryono, B. dan Suhardi. 1996. Prosedur Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty: Yogyakarta. Sukati.2010.Penanganan Umum Hewan Percobaan.http://www.scrib.com/doc/28. diakses tanggal 10 mei 2012.

Ten, Afril. 2011. Sulfonamid. http://www.scribd.com/doc/87906840/aomk-sulfo-afril Diakses tanggal 10 mei 2012 Underwood, A. & Day. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga: Jakarta.