LAPORAN TETAP BIOKIMIA

I. NOMOR PERCOBAAN II. JUDUL PERCOBAAN III. TUJUAN PERCOBAAN

: IV : Kromatografi Lapis Tipis : 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan KLT 2. Menghitung Nilai Rf dari Asam Amino (alanin, glisin, dan arginin)

IV. DASAR TEORI Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hdrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam.dengan cara ini diperoleh campuran bermacam macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut.

V. ALAT DAN BAHAN Silica Gel G Larutan penyemprot ninhidrin. Larutkan 0,3 gr ninhidrin ke dalam 100 ml n-butanol. Tambah 3 ml asam asetat glasial. Larutan penyemprot kuprinitrat. Tambahkan 1 ml larutan jenuh kuprinitrat dalam air ke dalam 100 ml 96% alkohol. Tambahkan juga 0,2 ml larutan 10% asam nitrat. Larutan asam amino yang diselidiki. Alat-alat kromatografi lapis tipis.

VI. PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan

jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubanglubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. (b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

VII. HASIL PENGAMATAN NO NAMA ZAT JARAK (CM) 1. 2. 3. ALANIN GLISIN ARGININ 7 9,5 9 ZAT JARAK ELUEN Rf (CM) 10 10 10 0,7 0,95 0,9

TABEL PRAKTEK 1

VIII. PERSAMAAN REAKSI

REAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANOL O H3N
+

O O

C CH R

CH 3CH 2OH etanol

H3N

C CH R OCH 2CH 3

H2O

asam amino REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN

O C C C O OH

H
OH

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2
O C C C O H OH

asam amino H

C O

O C C C O OH OH

ninhidrin
O C C C O

O C

C C O

3H2O

berw arna merah muda

REAKSI ASAM AMINO DENGAN KUPRINITRIT

O H2N CH R C OH O O O C Cu R NH 2 O
++

Cu(NO 3)2 kuprinitrit

C R

2NO 3-

NH 2

asam amino senyaw a kompleks ungu

IX. ANALISA DATA

NO NAMA ZAT

JARAK (CM)

ZAT JARAK ELUEN Rf (CM) 10 10 10 0,7 0,95 0,9

1. 2. 3.

ALANIN GLISIN ARGININ

7 9,5 9 TABEL PRAKTEK 2

NAMA ZAT (ASAM AMINO) ALANIN GLISIN ARGININ

NILAI STANDAR 0,324 0,259 0,129

Rf

ALANIN Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =
7cm 0,7 10cm

GLISIN Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =

9,5cm 0,95 10cm

ARGININ Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =
9cm 0,9 10cm

X. PEMBAHASAN

XI. KESIMPULAN

XII. DAFTAR PUSTAKA XII. TUGAS DAN PERTANYAAN Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Suatu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya? Jawab : 25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio, masing-masing adalah alanini, tripthofan, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol 95%). Setelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan dengan ninhidrin dan dikeringkan kembali selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya : Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah : Harga Rf = Maka : ALANIN Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =

jarakyangditempuholehasama min o jarakyangditempuholeheluen

7cm 0,7 10cm

GLISIN Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =
9,5cm 0,95 10cm

ARGININ

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf =
9cm 0,9 10cm

Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!

REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRIN
O C C C O OH

H
OH

COOH

NH2

ninhidrin NH 3 CO 2
O C C C O H OH

asam amino H

C O

O C C C O OH OH

ninhidrin
O C C C O

O C

C C O

3H2O

pigmen berw arna ungu

Sebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT? Jawab : Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).

4. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis? Jawab : Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam etanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai noda-noda coklat. Mengamati lempeng dengan sinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lempeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak lurus dari arah semula.

5. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu? Jawab: Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90 o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.