Cara Titrasi Karl Fischer (1935)

Metode ini digunakan untuk mengukur kadar air contoh dengan metode volumetri
berdasarkan prinsip titrasi. Titran yang digunakan adalah pereaksi Karl Fischer (campuran iodin,
sulfur dioksida, dan pridin dalam larutan metanol). Metanol dan piridin digunakan untuk melarutkan
iodin dan sulfur dioksida agar reaksi dengan air menjadi lebih baik dan juga mengikat asam sulfat
yang terbentuk sehingga akhir titrasi dapat lebih jelas dan tepat. Pereaksi karl fischer pada metode ini
sangat tidak stabil dan peka terhadap uap air oleh karena itu sebelum digunakan pereaksi harus selalu
distandarisasi. Standarisasi menggunakan standart Na-tartrat 2 H2O.
Selama masih ada air dalam bahan, iodin akan bereaksi, tetapi begitu air habis, maka iodin
akan bebas. Pada saat itu, titrasi dihentikan iodin bebas ini akan memberikan warna kuning coklat.
Untuk memperjelas pewarnaan maka dapat ditambahkan metilin biru dan akhir titrasi akan
memberikan warna hijau (Sudarmadji, 1989).
Dalam pelaksanaannya titrasi harus dilakukan dengan kondisi bebas dari pengaruh
kelembaban udara.Untuk keperluan tersebut dapat dilakukan dalam ruang tertutup. Cara titrasi Karl
Fischer ini telah berhasil dipakai untuk penentuan kadar air dalam alkohol, ester-ester, senyawa
lipida, lilin, pati, tepung gula, madu dan bahan makanan yang dikeringkan. Cara ini banyak dipakai
karena memberikan harga yang tepat dan dikerjakan cepat. Tingkat ketelitiannya lebih kurang 0,5 mg
dan dapat ditingkatkan lagi dengan sistem elektroda yaitu dapat mencapai 0,2 mg (Sudarmadji,
1989).
Pereaksi karl fischer sangat sensitif terhadap air. Sehingga metode ini dapat diaplikasikan
untuk analisis kadar air bahan pangan yang mempunyai kandungan air sangat rendah (seperti
minyak/lemak, gula, madu, dan bahan kering). Metode Karl Fischer juga dapat digunakan untuk
mengukur kadar air konsentrasi 1 ppm.
Tahapan reaksi yang terjadi dapat dituliskan sebagai berikut:
I2 + SO2 + 2 C6H5N C6H5N.I2 + C6H5N. SO2
C6H5N. I2 + C6H5N.SO2 + C6H5N + H2O 2(C6H5N. HI) + C6H5N. SO 3
C 6H5N. SO3 + CH3OH C6H5N (H)SO4CH 3 I 2
(dengan metilen biru akan berubah warnanya menjadi hijau)

http://www.share-
pdf.com/1a524a737ab24167912b8257315aa699/Penentuan%20Kadar%20Air%20Metode%20Titrasi%2
0-%20Christine%20Destyara%20Dewi%20P%20278340110043.htm
Kromatografi Gas-Cair

Pelaksanaan kromatografi gas-cair

Pengantar

Seluruh bentuk kromatografi terdiri dari fase diam dan fase gerak. Dalam seluruh bentuk
kromatografi yang lain, anda akan menemui fase gerak adalah cairan. Dalam kromatografi gas-
cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam adalah cairan yang mempunyai titik
didih yang tinggi diserap pada padatan.

Bagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan tergantung pada
seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan sebaliknya melekat pada
cairan dengan jalan yang sama.

Diagram alir kromatografi gas-cair

Injeksi sampel

Sejumlah kecil sampel yang akan dianalisis diinjeksikan pada mesin menggunakan semprit kecil.
Jarum semprit menembus lempengan karet tebal (Lempengan karet ini disebut septum) yang
mana akan mengubah bentuknya kembali secara otomatis ketika semprit ditarik keluar dari
lempengan karet tersebut.

Injektor berada dalam oven yang mana temperaturnya dapat dikontrol.Oven tersebut cukup panas
sehingga sampel dapat mendidih dan diangkut ke kolom oleh gas pembawa misalnya helium atau
gas lainnya.

Bagaimana kerja kolom?

Material padatan

Ada dua tipe utama kolom dalam kromatografi gas-cair. Tipe pertama, tube panjang dan tipis
berisi material padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan memiliki fase diam yang berikatan dengan
pada bagian terdalam permukaannya.

Untuk menyederhanakan, kita akan melihat pada kolom terpadatkan.
Kolom biasanya dibuat dari baja tak berkarat dengan panjang antara 1 sampai 4 meter, dengan
diameter internal sampai 4 mm. Kolom digulung sehingga dapat disesuakan dengan oven yang
terkontrol secara termostatis.

Kolom dipadatkan dengan tanah diatomae, yang merupakan batu yang sangat berpori.Tanah ini
dilapisis dengan cairan bertitik didih tinggi, biasanya polimer lilin.

Temperatur kolom

Temperatur kolom dapat bervariasi antara 50
o
C sampai 250
o
C.Temperatur kolom lebih rendah
daripada gerbang injeksi pada oven, sehingga beberapa komponen campuran dapat
berkondensasi pada awal kolom.

Dalam beberapa kasus, seperti yang anda akan lihat pada bagian bawah, kolom memulai pada
temperatur rendah dan kemudian terus menerus menjadi lebih panas dibawah pengawasan
komputer saat analisis berlangsung.

Bagaimana pemisahan berlangsung pada kolom?

Ada tiga hal yang dapat berlangsung pada molekul tertentu dalam campuran yang diinjeksikan
pada kolom:
Molekul dapat berkondensasi pada fase diam.
Molekul dapat larut dalam cairan pada permukaan fase diam
Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak satupun yang bersifat permanen.

Senyawa yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari temperatur kolom secara jelas
cenderung akan berkondensasi pada bagian awal kolom. Namun, beberapa bagian dari senyawa
tersebut akan menguap kembali dengan dengan jalan yang sama seperti air yang menguap saat
udara panas, meskipun temperatur dibawah 100
o
C. Peluangnya akan berkondensasi lebih sedikit
selama berada didalam kolom.

Sama halnya untuk beberapa molekul dapat larut dalam fase diam cair. Beberapa senyawa akan
lebih mudah larut dalam cairan dibanding yang lainnya. Senyawa yang lebih mudah larut akan
menghabiskan waktunya untuk diserap pada fase diam: sedangkan senyawa yang suka larut akan
menghabiskan waktunya lebih banyak dalam fase gas.

Proses dimana zat membagi dirinya menjadi dua pelarut yang tidak bercampurkan karena
perbedaan kelarutan, dimana kelarutan dalam satu pelarut satu lebih mudah dibanding dengan
pelarut lainnya disebut sebagai partisi.Sekarang, anda bisa beralasan untuk memperdebatkan
bahwa gas seperti helium tidak dapat dijelaskan sebagai pelarut .Tetapi, istilah partisi
masih dapat digunakan dalam kromatografi gas-cair.

Anda dapat mengatakan bahwa substansi antara fase diam cair dan gas.Beberapa molekul dalam
substansi menghabiskan waktu untuk larut dalam cairan dan beberapa lainnya menghabiskan
waktu untuk bergerak bersama-sama dengan gas.

Waktu retensi

Waktu yang digunakan oleh senyawa tertentu untuk bergerak melalui kolom menuju ke detektor
disebut sebagi waktu retensi.Waktu ini diukur berdasarkan waktu dari saat sampel diinjeksikan
pada titik dimana tampilan menunujukkan tinggi puncak maksimum untuk senyawa itu.

Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk senyawa tertentu, waktu retensi
sangat bervariasi dan bergantung pada:
Titik didih senyawa.
Senyawa yang mendidih pada temperatur yang lebih tinggi daripada temperatur kolom,
akan menghabiskan hampir seluruh waktunya untuk berkondensasi sebagai cairan pada
awal kolom. Dengan demikian, titik didih yang tinggi akan memiliki waktu retensi yang
lama.
Kelarutan dalam fase cair.
Senyawa yang lebih mudah larut dalam fase cair, akan mempunyai waktu lebih singkat
untuk dibawa oleh gas pembawa..Kelarutan yang tinggi dalam fase cair berarti memiiki
waktu retensi yang lama.
Temperatur kolom.
Temperatur tinggi menyebakan pergerakan molekul-molekul dalam fase gas; baik karena
molekul-molekul lebih mudah menguap, atau karena energi atraksi yang tinggi cairan dan
oleh karena itu tidak lama tertambatkan.Temperatur kolom yang tinggi mempersingkat
waktu retensi untuk segala sesuatunya di dalam kolom.
Untuk memberikan sampel dan kolom, tidak ada banyak yang bisa dikerjakan menggunakan titik
didih senyawa atau kelarutannya dalam fase cair, tetapi anda dapat mempunyai pengatur
temperatur.

Semakin rendah temperatur kolom semakin baik pemisahan yang akan anda dapatkan, tetapi
akan memakan waktu yang lama untuk mendapatkan senyawa karena kondensasi yang lama
pada bagian awal kolom!

Dengan kata lain, menggunakan temperatur tinggi, segala sesuatunya akan melalui kolom lebih
cepat, tetapi pemisihannya kurang baik. Jika segala sesuatunya melalui kolom dalam waktu yang
sangat singkat, tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam kromatogram.

Jawabannya dimulai dengan kolom dengan suhu yang rendah kemudian perlahan-lahan secara
teratur temperaturnya dinaikkan.

Pada awalnya, senyawa yang menghabiskan lebih banyak waktunya dalam fase gas akan melalui
kolom secara cepat dan dapat dideteksi. Dengan adanya sedikit pertambahan temperatur akan
memperjelas perlekatan senyawa. Peningkatan temperatur masih dapat lebih `melekatan`
molekul-molekul fase diam melalui kolom.

Detektor

Ada beberapa tipe detektor yang biasa digunakan.Detektor ionisasi nyala dijelaskan pada bagian
bawah penjelasan ini, merupakan detektor yang umum dan lebih mudah untuk dijelaskan
daripada detektor alternatif lainnya.

Detektor ionisasi nyala

Dalam mekanisme reaksi, pembakaran senyawa organik merupakan hal yang sangat kompleks.
Selama proses, sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion
dan elektron dapat dideteksi.

Seluruh detektor ditutup dalam oven yang lebih panas dibanding dengan temperatur kolom.Hal
itu menghentikan kondensasi dalam detektor.

Jika tidak terdapat senyawa organik datang dari kolom, anda hanya memiliki nyala hidrogen
yang terbakar dalam air.Sekarang, anggaplah bahwa satu senyawa dalam campuran anda analisa
mulai masuk ke dalam detektor.

Ketika dibakar, itu akan menghasilkan sejumlah ion-ion dan elektron-elektron dalam nyala. Ion
positif akan beratraksi pada katoda silinder. Ion-ion negatif dan elektron-elektron akan beratraksi
pancarannya masing-masing yang mana merupakan anoda.

Hal ini serupa dengan apa yang terjadi selama elektrolisis normal.

Pada katoda, ion positif akan mendatangi elektron-elektron dari katoda dan menjadi netral. Pada
anoda, beberapa elektron dalam nyala akan dipindahkan pada elektroda positif; ion-ion negatif
akan memberikan elektron-elektronnya pada elektroda dan menjadi netral.

Kehilangam elektron-elektron dari satu elektroda dan perolehan dari elektroda lain, akan
menghasilkan aliran elektron-elektron dalam sirkuit eksternal dari anoda ke katoda. Dengan kata
lain, anda akan memperoleh arus listrik.

Arus yang diperoleh tidak besar, tetapi dapat diperkuat. Jika senyawa-senyawa organik lebih
banyak dalam nyala, maka akan banyak juga dihasilkan ion-ion, dan dengan demikian akan
terjadi arus listrik yang lebih kuat. Ini adalah pendekatan yang beralasan, khususnya jka anda
berbicara tentang senyawa-senyawa yang serupa, arus yang anda ukur sebanding dengan jumlah
senyawa dalam nyala.


Penerjemahan hasil dari detektor

Hasil akan direkam sebagai urutan puncak-puncak; setiap puncak mewakili satu senyawa dalam
campuran yang melalui detektor. Sepanjang anda mengontrol secara hati-hati kondisi dalam
kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
tampak-tentu saja anda atau seseorang lain telah menganalisa senyawa murni dari berbagai
senyawa pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding dengan jumlah setiap senyawa yang telah melewati detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui komputer yang dihubungkan dengan monitor.
Area yang akan diukur tampak sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar yang
disederhanakan.

Perlu dicatat bahwa tinggi puncak tidak merupakan masalah, tetapi total area dibawah puncak.
Dalam beberapa contoh tertentu, bagian kiri gambar adalah puncak tertinggi dan memiliki area
yang paling luas. Hal ini tidak selalu merupakan hal seharusnya..

Mungkin saja sejumlah besar satu senyawa dapat tampak, tetapi dapat terbukti dari kolom dalam
jumlah relatif sedikit melalui jumlah yang lama.Pengukuran area selain tinggi puncak dapat
dipergunakan dalam hal ini.

Perangkaian kromatogram gas pada spektrometer massa

Hal ini tidak dapat dillakukan menggunakan detektor ionisasi nyala, karena detektor dapat
merusak senyawa yang melaluinya. Anggaplah anda menggunakan detektor yang tidak merusak.
Senyawa,

Ketika detektor menunjukkan puncak, beberapa diantaranya melalui detektor dan pada waktu itu
dapat dibelokkan pada spektrometer massa. Hal ini akan memberikan pola fragmentasi yang
dapat dibandingkan dengan data dasar senyawa yang telah diketahui sebelumnya pada komputer.
Itu berarti bahwa identitas senyawa-senyawa dalam jumlah besar dapat dihasilkan tanpa harus
mengetahui waktu retensinya
http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_gas_cair/
Analisis Dengan Kromatografi Gas
Analisis Kualitatif
Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan yang dapat menghasilkan identifikasi
kualitatif.Bagaimanapun juga seorang analis harus dapat memastikan bahwa hasil yang diperoleh
adalah benar seperti yang dtunjukkan oleh contoh di bawah.

Kromatografi gas dapat digunakan untuk analisis karenaretensi bersifat karakteristik pada tiap
senyawa. Identifikasi puncak dapat diperoleh dengan menggunakan inframerah atau spektrometri
masa akan tetapi teknik sering tidak ada atau biaya sangat mahal.
Sampel yang paling sulit dianalisis adalah sampel yang komponen-komponennya benar-benar
tidak diketahui.Dalam hal ini konsultasi data retensi terkadang tidaklah cukup.
Perbandingan Data Retensi
Volume retensi suatu komponen adalah karakteristik sampel dan fase cair.Ini dapat digunakan
untuk identifikasi komponen-komponen dalam sampel. Data retensi yang belum terkoreksi
biasanya tidak digunakan mengingat volume retensi tergantung pada :
1. Kolom
2. Fase cair
3. Temperatur kolom
4. Kecepatan aliran
5. Jenis gas pembawa
6. Volume mati instrumen
7. Penurunan tekanan across kolom
Akan tetapi hal itu dapat digunakan pada sampel yang sudah diketahui informasinya dan tersedia
standarisasinya.Kemampuan instrumen dalam menghasilkan data di perlukan dalam operasional
isotermal maupun terprogram.Jika semua parameter operasional dapat konstan berulang-ulang
maka perbandingan data retensi sampel dapat dibuat terhadap standar.

Gambar 18.19. Perbandingan kromatogram larutan standar (B) dengan larutan sampel (A)
Retensi Relatif a sebagai Data Retensi yang direkomendasikan untuk Indentifikasi sampel yang
tidak diketahui. Retensi relatif a adalah yang direkomendasikan untuk indentifikasi puncak
sebagai sesuatu yang relatif terhadap standar dan juga diperoleh dari data retensi yang
disesuaikan. Ini lebih mudah diperoleh dan hanya bergantung pada jenis fase cair dan temperatur
kolom.

Identifikasi dengan Logaritma Retensi
Mengambarkan grafik dari data retensi relatif atau yang disesuaikan terhadap berbagai parameter
fisik senyawa atau serangakaian homologi dapat memberikan petunjuk dari identitas sampel
yang belum diketahui.
Identifikasi dengan Menggunakan Retention Index
Konstanta bahan terlarut Kovats Indices dan Rohschneider dapat memberikan petunjuk yang
baik mengenai identitas atau jumlah karbon untuk beberapa senyawa.Data ini tersedia dalam
Jurnal Kromatografi dan publikasi ASTM.Metode pergeseran puncak juga merupakan alat yang
baik untuk identifikasi kualitatif.
Identifikasi dengan Menggunakan Dua Detektor
Perbandingan rasio respon dari senyawa yang dianalisa oleh dua detektor yang berbeda dibawah
kondisi yang telah ditetapkan bersifat karakteristik pada senyawa tersebut.
Sampel biasanya dikromatografikan pada satu kolom dan kolom dibagi untuk dua detektor yang
berbeda dengan yang masing-masing di rekam ke kromatogram secara bersamaan.
Kedua detektor tersebut spesifik seperti detektor flame photometric detector (FPD) akan
memberi respon pada senyawa-senyawa sulfur dan phosporus, detektor electron captive
detector (ECD) akan memberi respon pada senyawa-senyawa halogen, sementara thermionic
spesific detector (TSD) akan memberi respon pada senyawa-senyawa nitrogen dan phosphorus.
Detektor-detektor tersebut diterapkan secara luas dalam analisa obat-obatan dan pestisida.
Pendekatan ini umumnya direkomendasikan untuk deteksi senyawa spesifik dibandingkan
general qualitative digunakan sebagai kromatogram yang sulit untuk diinterpretasikan.
Identifikasi dengan Penggabungan dengan Metode penentuan Fisik lainnya
Pada saat fraksi dari senyawa yang dielusi telah dikumpulkan ini memungkinkan untuk
diidentifikasi oleh teknik fisik lainnya. Teknik ini termasuk :
1. Mass Spectrometry Berhubungan langsung dengan kolom kapiler
2. Infra red spectrometry langsung ke dalam cell sampel gas atau cair
3. Nuclear Magnetic Resonance
4. Coulometry
5. Polarography
6. UV Visible Spectroscopy
7. Atomic absorption
8. Inductively coupled plasma
9. Flamephotometry
Uji Kimia
Effluen gas dapat bergelembung pada saat meewati tabung yang berisi reagen-reagen dan rekasi
dapat teramati untuk memberikan petunjuk untuk mengidentifikasi senyawa seperti yang
ditunjukkan pada tabel di bawah ini.Metode ini mahal dan diterapkan dengan cepat.

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/analisis-dengan-
kromatografi-gas/

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana
pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom.
Pelaksanaan HPLC

Pengantar

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.Selain
dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi
sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan
pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode
pendeteksian yang dapat digunakan.Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
Kolom dan pelarut

Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif
dari pelarut dan fase diam.
Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau
kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai normal , ini bukan merupakan bentuk
yang biasa dari HPLC.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya
heksan.Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari
nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika
yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non
polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa
atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam
campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan.
Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk
bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang
larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya
senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh
karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak
lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.Melihat seluruh proses

Diagram alir HPLC

I njeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui
apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya
dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
komposisi yang tepat dari pelarut
temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika
anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada
sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang
diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak
mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan
menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm.Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan
yang salah dari pelarut.
I nterpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa
yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa
tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari
senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area
ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati.Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya?Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X.
Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y
mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin
ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak
yang kecil.

Rangkaian HPLC pada spektrometer massa

Ini menunjukkan hal yang sangat menakjubkan! Pada saat detektor menunjukkan puncak,
beberapa senyawa sementara melewati detektor dan pada waktu yang sama dapat dialihkan pada
spektrometer massa. Pengalihan ini akan memberikan pola fragmentasi yang dapat dibandingkan
pada data komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui. Ini berarti bahwa identifikasi
senyawa dalam jumlah besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui waktu retensinya.
http://www.chem-is-
try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Kromatografi adalah pemisahan
komponen-komponen berdasarkan migrasi selektif atas pengaruh fasa gerak terhadap fasa diam. HPLC
juga merupakan pemeriksaan berdasarkan pemisahan. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan
dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.

Prinsip Kerja :
Fasa gerak di masukkan ke dalam liquid reservoir. Lalu di pompa oleh pemompa yang kemudian akan
bertemu dengan fasa diam. Sample / Fasa diam di injeksikan ke injektor dan akan bertemu dengan fasa
gerak lalu di bawa ke kolom. Di kolom akan terjadi pemisahan yang kemudian hasilnya di baca oleh
detector dan di laporkan oleh recorder.

Pada dasarnya peralatan pokok yang selalu ( harus ) ada di dalam suatu sistem kromatografi cairan (
HPLC / KCKT ) adalah sebagai berikut :

a. Reservoir untuk fasa gerak e. Detector
b. Pompa f. Recorder
c. Injector g. Termostat untuk mengatur suhu
d. Kolom



Secara lengkap skema peralatan HPLC dapat di gambarkan sebagai berikut :


Ket :
Peralatan Wajib
Peralatan Tambahan (Option)
















I. Solvent reservoir
Sesuai dengan namanya, fungsi solvent reservoir adalah untuk menampung fasa gerak yang
akan dialirkan kedalam kolom dengan bantuan pompa. Solvent reservoir biasanya terbuat dari gelas
dengan volume yang bervariasi tergantung dari jumlah / volume fasa gerak yang dibutuhkan. Untuk
analisis yang sederhana yaitu cara analisis isokratik yang berarti dari awal sampai akhir analisis
komposisi fasa gerak yang digunakan adalah sama cukup diperlukan satu solvent reservoir. Sedangkan
untuk analisis gradient yaitu analisis yang memerlukan perubahan komposisi fasa gerak, maka
diperlukan solvent reservoir lebih dari satu, tergantung pada jumlah komposisi fasa geraknya.
Sebaiknya, sebelum fasa gerak di masukkan ke dalam solvent reservoir, fasa gerak tersebut
disaring terlebih dahulu menggunakan penyaring dengan pori-pori 5 untuk menghilangkan
pengotor dan degass untuk menghilangkan gas atau udara yang mungkin ada didalam fasa gerak yang
akan digunakan untuk analisis Karena apabila tidak dihilangkan akan mengganggu kinerja pompa dan
detector.
Liquid reservoir
Pompa Sample Injector
Kolom
Detector
Recorder
Gradient Device
Temp. Control
Temp. Control

II. Pompa
Fungsi pompa didalam sistem HPLC adalah untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.
Sedangkan apabila fasa gerak menggunakan larutan buffer, maka fasa gerak tersebut sebaiknya disaring
dahulu menggunakan filter membran untuk menghilangkan sisa sisa garam terlarut karena dapat
menyebabkan korosif pada sistem HPLC yang terbuat dari solvent reservoir.

III. Injector
Fungsi Injector pada sistem HPLC adalah tempat untuk memasukkan cuplikan dengan bantuan
syringe.

IV. Kolom
Kolom pada sistem HPLC merupakan jantung dari sistem tersebut, karena di dalam kolomlah
terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.Jadi berhasil tidaknya suatu analisis atau pemisahan
sangat bergantung pada kolom yang digunakan.

V. Detector
Fungsi Detector dalam kromatografi cairan atau HPLC adalah untuk mendeteksi komponen-
komponen cuplikan hasil pemisahan kolom secara kualitatif dan kuantitatif tergantung pada kebutuhan
analisis.
Dua jenis Detector yang dikenal didalam HPLC adalah :
1. Detector Universal
Yaitu detector yang bisa langsung digabungkan ke dalam instrument HPLC tanpa memerlukan
tambahan sistem khusus.Contoh : detector UV/Vis, detector index refreksi, detector
fluorescence dan detector hantaran.
2. Detector Khusus
Yaitu detector yang memerlukan sistem khusus agar bisa digunakan sebagai detector dalam
HPLC, Contoh : FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy), MS (mass spectrometer), dan
sebagainya.
www.scribd.com/doc/55531502-HPLC-Adalah-Alat-Yang-Sangat-at-Dalam-Analisis