LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Materi Isolasi DNA

Nama
NIM
Kelompok
Asisten

: Muhammad Bari Muwardi

: 135040201111032
: M1
: Finsa Dwi Arisandi

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2014

BAB l
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu
gula

deoksiribosa,

basa

nitrogen

dan

fosfat

yang

tergabung membentuk nukleotida. Materi genetik yang

terdapat di dalam inti sel makhluk hidup. Materi itu
berbentuk seperti tangga. Bukan tangga yang lurus, tetapi
tangga yang berpilin. Kedua sisi tangga dihubungkan oleh
anak tangga. Pada DNA, hanya ada dua jenis anak
tangga, yaitu anak tangga yang dibentuk oleh pasangan
basa nitrogen Adenin dan Timin (A-T) dan basa GuaninCitosin (G-C). Molekul DNA ini terikat membentuk
kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan
kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan
nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double
helix), dimana basa nitrogen dan kedua benang
polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang
tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang
satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan
ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk
hidup dan disebut sebagai cetak biru kehidupan karena
molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan struktur protein dan proses
metabolisme lain. DNA dapat mengalami denaturasi dan
renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.
I.2 Tujuan
Untuk pengetahui pengertian isolasi DNA
Untuk mengetahui macam-macam metode isolasi
DNA

Untuk mengetahui tahapan-tahapan isolasi DNA

Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA

I.3 Manfaat
Praktikum isolasi DNA dilakukan, bermanfaat untuk
mengetahui adanya DNA murni pada tumbuhan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian isolasi DNA
Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya
strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam
bentuk kumpulan strand berwujud benang-benang
putih. (Aditia, 2010)

Deoxyribonucleic

acid (DNA) isolasi

adalah

proses

ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk

isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat
diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumbersumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh
darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda
darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin
(Yuwono,2006)
DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for
subsequent molecular or forensic analysis. (Isolasi
DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA
untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)
(Doyle, 1987)
DNA isolation is the most important step in molecular
biology analysis. Several DNA isolation techniques
which are developed were expensive. (Listanto,1996)
Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam
analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA
yang

telah

dikembangkan

sangat

mahal

dan

memerplukan waktu yang lama.

2.2 Macam metode Isolasi DNA
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)
dengan Nitrogen Cair.
a. Metode I.

Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus

dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi
tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat
dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke
dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang
perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm
selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang
dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak
10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5
menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas
dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan
dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume.
Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es
selama

30

menit.

Pelet

dikoleksi

dengan

sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20

menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol
76%

dan

ammonium

asetat).

Sentrifugasi

dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10

menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet
yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan
bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan
konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi
pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya,
dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan

12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan

diresuspensi dengan molecular water. Proteinase
K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.
Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990)
tanpa Nitrogen Cair.
b. Metode II.
Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan
digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi
(2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM
Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol).
Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada
suhu 65C dengan 50 rpm selama satu jam.
Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk
proses cooling. Sampel

ditambahkan

0.75

mL

kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi

12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC.
Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru
dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol
dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10
kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah
kering diberi 25 L molecular water dan disimpan
pada suhu -20C.
Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).
c. Metode III.

Sampel daun 200 mg digerus hingga halus

dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA
(pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl,
dan SDS 1%) sebanyak 400 L dalam mortar
dingin.

Sampel

ditambahkan

100

buffer

ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan

400 L kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi
dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu
4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800
L etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC
selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm
selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa
pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan
disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering
diresuspensi dengan 50 L molecular water dan
ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu
37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm
dilakukan

selama

menit.

Pellet

kering

ditambahkan 50 L molecular water. Suspensi

tersebut disimpan pada suhu -20oC.
Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi
untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas
terbaik.

Modifikasi

dilakukan

dengan

variasi

penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol

76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K,
RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu,

modifikasi

juga

dilakukan

dengan

variasi

penambahan larutan pada tahap yang berbeda.

(Utami, 2012)

2.3 Tahap Isolasi DNA

a. Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah
terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik
secara fisik kimia atau dengan mempergunakan
enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik
misalnya dengan menggunakan alat sonikator,
yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara
ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya
cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi
kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.
b. Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan
menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah
dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini
dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya
dengan pemansan sehingga sel lebih mudah
pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk
memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB
(Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).
c. Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan
pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen
DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong

dengan

menggunakan

enzin

endonuclease

restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong

molekul DNA di bagian tertentu. Hasil potongan
dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujungujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong
oleh enzim.
d. Selain dengan menggunkan enzin endonuclease
restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong
secara

mekanis,

misalnya

menggunakan

alat

sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis

adalah

molekul

DNA

yang

ujungnya

tidak

beraturan.
(Yuwono,2006)
2.4 Manfaat Isolasi DNA (khususnya bagi pertanian)
a. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.
b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan
secara

enzimatik

melaluiteknik

Hibridisasi

Southern
c. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan
pustaka genomik.
d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur
rutin peminakan DNA.
e. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan
(template) dalam prosedur perbanyakan DNA
secara in vitro melalui teknik PCR. (Zubaidah,
2004)

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Fungsi
3.2 Langkah Kerja + dokumentasi
Campurkan buffer CTAB 1 ml + karbon +
mercaptoetanol 4L

Timbang masing-masing daun jagung dan

daun kacang tanah 0,1 g dan gerus dalam
mortar. Tambahkan reagen cair + PVP

Masukkan ke dalam tube 2 mL

Vortex tube inkubasi dalam oven 65OC (15 menit)
dinginkan sebentar
Sentrifuge kecepatan 10.000 rpm (5 menit)
Ambil supernatant pindahkan ke tube (2 mL) baru
Tambahkan 500 L Chisam

Tambahkan vortex lagi 5 menit

Sentrifuge 10.000 rpm 5 menit
Pindahkan supernatant + 300 L isopropanol dingin
Bolak balik tube secara perlahan dan inkubasi dalam
freezer 15 menit
Sentrifuge 8000 rpm 5 menit
Ambil supernatant dan buffer pencuci 500 L dan
vortex
Sentrifuge 9000 rpm 5 menit
Ambil supernatant dan keringkan 20 menit
Tambahkan buffer TE sebanyak 50 L
Larutkan pellet DNA dan mengetuk tube perlahan
3.3 Analisis Perlakuan
Pertama timbang masing-masing daun kacang
dan daun jagung tanpa tulang daun dengan berat 0,1
gram. Dihaluskan dengan mortar kemudian campurkan
buffer CTAB 1 ml, karbon dan mercaptoetanol 4L
kemudian timbang 0,4 g dan gerus dalam mortar lalu
tambahkan reagen cair dan PVP. Masukkan ke dalam
tube 2 mL, Vortex tube lalu inkubasi dalam oven 65 OC

selama

15

menit

kemudian

dinginkan

sebentar.

Sentrifuge larutan dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 5 menit. Ambil supernatant dan pindahkan ke
tube sebanyak 2 mL (baru). Tambahkan 500 L
Chisam kemudian divortex lagi selama 5 menit dan
disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit. Pindahkan
supernatant dan 300 L isopropanol dingin. Bolak balik
tube secara perlahan dan inkubasi dalam freezer 15
menit. Lakukan sentrifuge lagi 8000 rpm 5 menit. Ambil
supernatant dan buffer pencuci 500 L dan vortex.
Sentrifuge
supernatant

9000
dan

rpm

selama

keringkan

20

menit.

Ambil

menit.Kemudian

tambahkan buffer TE sebanyak 50 L. Terakhir

larutkan pellet DNA dan mengetuk tube perlahan.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)
Berdasarkan hasil pengamatan pada isolasi DNA daun
jagung terlihat adanya DNA hal ini dilihat dari adanyan
benang double helix. Sedangkan pada isolasi DNA daun
kacang tanah terlihat adanya RNA hal ini karena tampak
benang single helix.
4.2 Pembahasan (bandingkan dengan literature)

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan

5.2 Kritik dan Saran

5.2.1 Kritik dan Saran untuk Praktikum Tahun Depan
5.2.2 Kritik dan Saran untuk Asisten

DAFTAR PUSTAKA

Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/201
0/03/i solasiDNA.html Diakses 20 Desember 2014
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation
procedure for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem. Bull. 19: 11-15.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen,
Penambahan Enzim, dan Ekstrak

Nanas (Ananas

comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA

Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum
Matakuliah

Genetika.

Skripsi

tidak

diterbitkan.

Malang: Universitas Negeri Malang

Puspita, 2010.TahapanIsolasi DNA. http://puspitt .multiply.com
/journal/item/14/ISOLASI-

DNA? &show_interstitia

l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem. Diakses tanggal 20

Desember

2014

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA

Baru pada Bakteri

Radioresisten

Deinococcus

radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan

Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.
Aditia.2010.IsolasiDNA.http://sharkestaditia.blogspot.com/201
0/03/isolasiDNA.html Diakses 20 Desember 2014.
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation
procedure for small quantities of fresh leaf tissue.
Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah.

2005.

Pengaruh

Berbagai

Macam

Detergen,

Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas

comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA
Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum
Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:
Universitas Negeri Malang
Puspita,

2010.TahapanIsolasi

.multiply.com
&show_interstitia

DNA.

http://puspitt

/journal/item/14/ISOLASI-DNA?
l=1

&u=%2Fjournal%2Fitem.

Diaksestanggal 21 Desember 2014

Zubaidah, 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA
Baru pada Bakteri

Radioresisten

Deinococcus

radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan

Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004