ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

BAB 4
METODE PENELITIAN

4.1

Jenis Penelitian
Jenis

penelitian

yang

dilakukan

adalah

penelitian

eksperimental

laboratoris.

4.2

Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang dipergunakan adalah rancangan post test only

control group design.

K
R

Keterangan:
R
= randomized
S
= sample
K
= kelompok kontrol
P
= kelompok yang diberi perlakuan
E
= evaluasi / pengamatan setelah 5 hari
4.3

Besar dan Sampel Penelitian

4.3.1

Besar Sampel Penelitian

Jumlah hewan coba yang akan digunakan sebagai sampel didapat

berdasarkan rumus: (Lameshow et. al., 1990, p. 40) dihitung menggunakan

program sample size determination for health studies
n = 22(Z 1- + Z 1-)2
( 1 2 )2

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

Keterangan :
n
= Jumlah sampel masing-masing kelompok

= Standart deviation
Z
=1,96 bila = 0,05
1
= Mean kelompok perlakuan 1
2
= Mean kelompok perlakuan 2
4.3.2

Kriteria Inklusi Sampel Hewan Coba Cavia cobaya

Sampel hewan coba Cavia cobaya yang digunakan mempunyai kriteria

inklusi sebagai berikut :

a. Jenis kelamin jantan.
b. Usia 2-3 bulan.
c. Berat badan berkisar antara 200-300 gram.
d. Kondisi fisik sehat dan memungkinkan untuk dijadikan sampel (gigi tidak
fraktur, mata berbinar, kotoran lembek).

4.4

Tempat dan Waktu Penelitian

4.4.1

Tempat Penelitian

1.

Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

Surabaya

2.

Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Sutomo Surabaya

3.

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Gigi

Universitas

Airlangga Surabaya
4.

Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas

Airlangga Surabaya

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.4.2

Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Mei-September 2012.

4.5

Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

: gel kitosan 1% derajat deasetilasi > 75%

2. Variabel tak bebas

: jumlah makrofag

3. Variabel terkendali

a. Makanan Cavia cobaya

b. Teknik pencabutan gigi Cavia cobaya
c. Dosis kitosan
d. Cara pemberian kitosan

4.6

Definisi Operasional Penelitian

1. Kitosan adalah polimer jenis polisakarida yang didapatkan dari ekstraksi

cangkang kepiting produksi Sigma dengan derajat deasetilasi > 75%,
konsentrasi 1% yang dilarutkan dalam asam asetat 2% dengan perbandingan
1gr : 100ml
2. Makrofag adalah jumlah sel makrofag yang intinya berbentuk seperti kacang,
dengan sitoplasma yang besar dan pucat yang berlokasi pada sepertiga daerah
apikal soket gigi dengan teknik pemerikasaan Histopatologi Anatomi (HPA)
dan pengecatan Haematoksilin eosin (HE). Perhitungan dengan pemeriksaan
mikroskop lensa trinokuler pembesaran 1000 x yang terhubung dengan
komputer / lapang pandang jumlah dari sel makrofag pada sepertiga daerah
apikal soket.

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

3. HPA adalah preparat histopatologi yang diambil dari potongan soket bekas
pencabutan gigi insisivus rahang bawah Cavia cobaya dengan pengecatan
haematoksilin eosin.

4.7

Bahan dan Alat

4.7.1

Bahan penelitian :

1. Kitosan (dari cangkang kepiting, Sigma, C3646-10G) derajat deasetilasi >75%

2. Eter 10 %
3. Asam asetat 2% ( Laboratorium Bio Analitika, Surabaya)
4. Bahan pengecatan : Hematoksilin Eosin (HE)
5. Makanan yang sama untuk semua hewan coba Cavia cobaya

Gambar 4.1 a. Asam asetat, b. kitosan

4.7.2

Alat penelitian :

1. Kandang Cavia cobaya ukuran 40 x 40 x 60 cm

2. Scalpel dan handle yang steril.
3. Syringe 2,5 cc steril
4. Timbangan
5. Tang dan elevator khusus yang steril untuk mencabut gigi Cavia cobaya.
6. Mikroskop cahaya
7. Peralatan untuk membuat sediaan

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

8. Pinset chirurgis

Gambar 4.2 Alat yang digunakan untuk melakukan penelitian

4.8

Cara Kerja

4.8.1

Pengajuan Laik Etik Penelitian

Laik Etik diajukan ke Komite Kelaikan Etik Penelitian Kesehatan

(KKEPK) Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga sebelum melakukan

penelitian. Penelitian dilakukan setelah mendapatkan sertifikasi laik etik yang
dikeluarkan oleh komisi etik penelitian (Lampiran 1).

4.8.2

Pengelolaan Hewan Coba Cavia cobaya

Cavia cobaya tiap kelompok diletakkan dalam kandang dan ditempatkan

dalam ruangan yang cukup aliran udara dan cahaya, terlindung dari pengaruh
hujan dan cahaya matahari yang terik. Kandang diusahakan kering agar tidak
menjadi sarang penyakit. Setiap Cavia cobaya diberi makanan yang banyak
mengandung serat kasar, umbi-umbian, jagung, serta hijau-hijauan yang lain
secara adlibitum (tanpa dibatasi). Hewan coba diambil dari peternakan sehingga
perlu diadaptasikan selama tiga hari, untuk mendapatkan kesehatan umum yang
baik dan penyesuaian dengan lingkungan (Hume, 1972, p.97).

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.8.3

Persiapan Kitosan
Bubuk kitosan 0,05 gram ditambahkan dalam 5 ml asam asetat 2% diaduk

dengan menggunakan magnetic stearer diputar dengan kecepatan 5 selama kurang

lebih 3 menit sampai homogen sehingga mendapatkan bentuk gel dan tidak ada
yang menggumpal.

4.8.4

Pencabutan Gigi Insisivus Kiri Rahang Bawah Hewan Coba Cavia

cobaya
Hewan coba Cavia cobaya yang telah memenuhi kriteria sampel dibius

umum dengan menggunakan eter 10% secara inhalasi (dalam suatu kotak kaca
khusus) selama kurang lebih 2 menit dengan dosis kurang lebih 2 ml, ditunggu
hingga Cavia cobaya terlihat lemas dan tidak dapat bergerak. Gigi insisivus kiri
rahang bawah dibersihkan dari sisa makanan dengan semprotan air menggunakan
syringe kemudian dikeringkan. Pencabutan gigi insisivus kiri rahang bawah pada
Cavia cobaya dilakukan oleh tenaga ahli dengan menggunakan needle holder dan
elevator steril dengan gerakan searah (ke arah lingual) sampai gigi goyang.
Kemudian dilakukan pencabutan gigi dengan kekuatan yang sama serta dilakukan
hati-hati agar akar gigi tidak mengalami fraktur dan gigi tercabut sempurna
(gambar lampiran 4).

4.8.5

Perlakuan Hewan Coba Cavia cobaya

Pada kelompok perlakuan setelah pencabutan, hewan coba Cavia cobaya

diberikan gel kitosan 1% secara topikal menggunakan syringe, sebanyak 0,4 cc

per soket, kemudian luka pencabutan dijahit dengan menggunakan benang non

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

absorbable. Pada kelompok kontrol, luka bekas pencabutan dibiarkan tanpa diberi
perlakuan apapun dan luka pencabutan dijahit dengan benang non absorbable
(gambar lampiran 4).
Hewan coba setelah dilakukan pencabutan dan perlakuan hewan coba
diberi makanan secukupnya dengan memperhatikan kesehatan hewan coba
tersebut. Pada hari ke lima masing-masing hewan coba dari kelompok kontrol dan
perlakuan dimatikan dengan cara disembelih, lalu dilakukan pengambilan
mandibula dengan melepasnya dari angulus mandibula. Semua hewan coba Cavia
cobaya dalam kedua kelompok dikuburkan secara layak (gambar lampiran 4).

4.8.6

Pembuatan Sediaan Sampel

Mandibula yang telah diambil dari hewan coba didekalsifikasi

terlebih dahulu dengan asam nitrat 2,5 % selama kurang lebih 7 hari untuk
menunggu jaringan tulang mandibula menjadi lunak dan dapat dipotong kecil
kurang lebih berbentuk persegi panjang (Ahmad, 2009, hal. 5, 9).
Bahan biopsi dari potongan sagital soket insisivus rahang bawah diiris
menjadi potongan bahan yang berukuran 1 X 1 X cm kemudian dilakukan
dehidrasi. Dehidrasi dilakukan bertahap dengan merendam jaringan dalam
alkohol yang konsentrasinya semakin meningkat secara perlahan sebagai berikut:
alkohol 70 % selama 1 hari, alkohol 80 % selama 1 hari, Alkohol 90 % selama 1
hari, alkohol 95 % selama 2 hari, alkohol 100 % selama 2 hari secara berturutturut (Ahmad, 2009, hal. 15-16).
Clearing dilakukan dengan cara sebagai berikut: memasukkan jaringan
yang telah didehidrasi ke dalam larutan xylol I selama 1 jam hingga jaringan

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

menjadi bening, dilanjutkan dengan memasukkan jaringan ke dalam xylol II

selama -1 jam. Jaringan direndam dalam xylol II untuk meyakinkan seluruh
cairan alkohol telah keluar. Tahap terakhir clearing adalah merendam jaringan
dalam parafin cair di dalam oven selama jam (Ahmad, 2009, hal. 17).
Embedding dilakukan dengan larutan parafin pada suhu 56-59C. Tahapan
embedding adalah merendam jaringan dalam parafin I selama 2 jam, kemudian
dipindahkan ke dalam parafin II selama 1 jam, lalu jaringan dimasukkan dalam
parafin III selama 2 jam. Setelah perendaman dalam parafin, proses selanjutnya
adalah blocking (Ahmad, 2009, hal. 20).
Blocking dilakukan dengan menuangkan parafin dalam cetakan yang berisi
jaringan. Langkah selanjutnya adalah penyayatan sediaan dengan mikrotom.
Tahap pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut:
merekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di
mikrotom kemudian dilekatkan pada pemegangnya pada mikrotom dan dikunci
dengan erat. Langkah selanjutnya adalah mengatur letak pisau mikrotom pada
tempatnya dengan sudut kemiringan 20-30 derajat kemudian atur ketebalan
potongan, yaitu sekitar 5 m. Pemotongan blok preparat dilakukan secara teratur
dan ritmis. Pita parafin awal yang tidak mengandung jaringan dibuang hingga
mendapatkan parafin dengan jaringan. Pita parafin yang mngandung jaringan
dipindahkan secara hati-hati menggunakan kuas ke dalam waterbath yang
temperaturnya 37-400C dan biarkan beberapa saat hingga pita parafin
mengembang. Setelah pita parafin mengembang, tempelkan pita tersebut pada
kaca objek dengan cara memasukkan kaca objek ke dalam waterbath dan
menggerakkannya ke arah pita parafin. Pita parafin ditempelkan ke kaca objek

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

dengan menggunakan kuas kemudian keluarkan kaca objek dengan hati-hati agar
parafin tidak terlipat (Ahmad, 2009, hal. 21-22).
Sediaan di cat dengan HE ( Hematoksilin Eosin ) menurut metode Harris,
sebagai berikut: deparafinasi dalam xylol, kemudian hidrasi dalam larutan alkohol
dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-80%-70%. Langkah
selanjutnya adalah inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 menit
lalu bilas dengan air mengalir dalam waktu yang singkat. Kemudian celupkan
preparat ke dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup, cek
diferensiasi warna di bawah mikroskop, lalu bilas dalam air mengalir dalam waktu
singkat. Proses selanjutnya adalah mencelupkan preparat ke dalam larutan
amonium atau litium karbonat sebanyak 3-5 kali hingga potongan berwarna biru
cerah lalu cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit hingga bersih. Kemudian
counter stain dengan eosin selama 15 detik sampai 2 menit, dehidrasi dalam
alkohol

dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan masing-masing

selama 2 menit. Kemudian inkubasi preparat dalam xylol 2 X 2 menit. Langkah

terakhir adalah penutupan preparat dengan kaca penutup (Ahmad, 2009, hal. 29).

4.8.7

Cara Penghitungan Jumlah Makrofag

Pengamatan dilakukan secara HPA pada makrofag hari ke lima dengan

membuat foto dari preparat HPA menggunakan mikroskop lensa trinokuler

dengan perbesaran 1000x dan dilakukan penghitungan jumlah makrofag.
Pembesaran 40x untuk melihat semua lapang pandang, kemudin ditingkatkan
dengan pembesaran 1000x. Daerah yang akan diamati ditentukan terlebih dahulu

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

yaitu daerah sepertiga apikal soket bekas pencabutan gigi yang berbatasan dengan
tulang alveolaris.
Perhitungan jumlah sel makrofag pada kelompok kontrol dan perlakuan
dilakukan dengan mikroskop lensa trinokuler pembesaran 1000x yang terhubung
langsung dengan komputer. Perhitungan dilakukan dengan cara melihat melalui 5
lapang pandang, agar daerah sel yang telah dilihat tidak terjadi penghitungan
ulang. Hal yang perlu dilakukan yakni mengingat gambaran sel yang terlihat di
daerah pojok pada setiap lapang pandang dan besarnya setiap lapang pandang
sama setiap kali dilakukan pergeseran. Cara tersebut digunakan untuk menghitung
jumlah makrofag pada kelompok kontrol dan perlakuan.

4.9

Analisis Statistik
Analisis data menggunakan Kolmogorov-smirnov test untuk mengetahui

apakah distribusi frekuensi hasil pengamatan berdistribusi normal. Setelah itu

dilakukan uji Levenes test untuk mengetahui homogenitas. Analisis data yang
diperoleh kemudian dilakukan uji statistik menggunakan uji independent t-test
dengan derajat kemaknaan p<0,05 untuk mengetahui perbedaan pengamatan
antara perlakuan kitosan dengan kontrol.

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.10

Alur Penelitian
Cavia cobaya diletakkan dalam kandang agar
adaptasi, selama 3 hari

Cavia cobaya dibius dengan eter 10% secara inhalasi

Pencabutan gigi incisive kiri rahang bawah dengan gerakan searah dan kekuatan yang sama

Kelompok kontrol (6 ekor)

Luka bekas pencabutan dijahit

Kelompok perlakuan (6 ekor)

Luka bekas pencabutan diberi kitosan gel kemudian

dijahit

Pada hari kelima Cavia cobaya kelompok kontrol dan perlakuan dimatikan dengan cara disembelih

Pengambilan mandibula dengan melepasnya dari angulus mandibula dan mengeluarkannya

Pembuatan sediaan untuk mengamati jumlah makrofag

Pembacaan jumlah makrofag

Analisis data
Pembahasan
Kesimpulan

SKRIPSI

PENINGKATAN SEL MAKROFAG ...

IRMA DEWI RATNAWATI