Prosiding Seminar Nasional Fundamental dan Aplikasi

Teknik Kimia 2011

Makalah No. XXX-XXX

Biosensor Glukosa Amperometrik dengan Prussian Blue /

Glucose oxidase yang Diimmobilisasi dengan Metode Solgel Berbasis Senyawa Alkoksida
Adrian Nur, Debora Puspitasari, Dian Ningsih, Arief Widjaja, Minta Yuwana,
Heru Setyawan*
Jurusan Teknik Kimia, Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya, Indonesia
*E-mail: sheru@chem-eng.its.ac.id

ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan biosensor glukosa berbasis sol-gel silika
dengan pengukuran amperometri. Enzim glucose oxidase (GOD) diperangkap dalam
lapisan sol-gel silika yang dilapiskan pada elektroda Pt berlapis prussian blue (PB). Disini
PB berfungsi sebagai pengganti enzim horse radish peroxidase (HRP) untuk mereduksi
H2O2 hasil reaksi enzimatik yang bertindak sebagai mediator tranfer elektron.
Percobaan elektrokimia dilakukan dalam sistem 3 elektroda konvensional dengan
elektroda Pt/PB/SiO2/GOD sebagai elektroda kerja, elektroda platina sebagai elektroda
lawan dan elektroda Ag/AgCl (KCl jenuh) sebagai elektroda acuan. Kinerja biosensor ini
dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama potensial yang digunakan, konsentrasi
silika dalam sol dan jumlah enzim. Respon arus cenderung meningkat dengan
meningkatnya potensial. Akan tetapi, dengan semakin besarnya potensial,
kecederungan terjadinya reaksi samping semakin besar. Oleh karena itu, untuk
mencegah terjadinya gangguan, pengukuran dilakukan pada potensial 0,4 V. Respon
arus dengan potensial tersebut tertinggi diperoleh pada konsentrasi SiO2 untuk
immobilisasi GOD 1,1% dan jumlah enzim 7 U.

Kata kunci: Biosensor glukosa; glucose oxidase; immobilisasi; prussian blue; sol-gel.

1. Pendahuluan
Biosensor enzim amperometri adalah suatu
alat yang merubah informasi konsentrasi senyawa
kimia menjadi sinyal elektronika yang dapat
dikuantifikasi. Enzim mengenali molekul target
dengan transfer langsung kecepatan reaksi menjadi
arus listrik. Salah satu biosensor yang paling populer
adalah biosensor untuk mendeteksi gula darah yang
diperlukan untuk memantau kadar gula darah
penderita diabetes mellitus yang harus selalu
menjaga kadar gula darah mendekati normal untuk
mengurangi resiko komplikasi lanjutan.
Saat ini, sensor untuk keperluan mengukur
kadar glukosa sangat mahal. Hal ini dikarenakan
pada umumnya bioensor glukosa melibatkan dua
enzim secara serentak. Satu enzim berfungsi

mengurai glukosa menjadi asam glukonat dan

hidrogen peroksida dan enzim satunya berfungsi
sebagai mediator untuk transfer elektron yang
merupakan sinyal yang dapat dikuantifikasi. Enzim
yang paling umum digunakan adalah glucose
oxidase (GOD) sebagai pengurai glukosa dan
horseradish peroxsidase (HRP) sebagai mediator
transfer elektron.
Faktor keberhasilan suatu biosensor salah
satunya tergantung pada sebaik apa suatu enzim
terikat pada permukaan biosensor dan tetap aktif
selama aplikasi yang diinginkan [1]. Untuk
biostabilitas dan efisiensi reaksi yang optimal,
matrik penyangga harus mampu mengisolasi
biomolekul dan melindunginya dari agregasi antar
molekul serta dari serangan mikroba. Immobilisasi
yang bagus dicirikan oleh aktivitas enzimatik yang

tinggi dengan perembesan keluar yang dapat

diabaikan dan difusi molekul analit serta produk
reaksi hampir tidak terhambat.
Berbagai macam teknik immobilisasi telah
digunakan, meliputi adsorpsi pada penyangga padat
[2,3] pengikatan kovalen [4,5] dan pemerangkapan
dalam polimer [6,7]. Pada umumnya, teknik
adsorpsi mudah dilakukan, tetapi ikatan enzim
seringkali lemah yang menyebabkan perembesan
keluar sehingga derajat kestabilannya kurang.
Sebaliknya, teknik kovalen membutuhkan persiapan
yang kompleks dan seringkali memerlukan
beberapa tahapan reaksi kimia. Immobilisasi,
meskipun mencegah perembesan keluar tetapi
seringkali mengarah kepada kehilangan aktivitas
dan stabilitas enzim seiring dengan berjalannya
waktu [8].
Sol-gel menawarkan cara yang lebih baik untuk
mengimmobilisasi biomolekul dengan matriksnya
yang berpori dan menunjukkan aktivitas fungsional
biomolekul yang terselubungi [1,8,9]. Hal ini
disebabkan kondisi proses sol-gel yang sederhana
dan kemungkinan untuk merancang sesuai
kebutuhan. Fleksibilitas sol-gel mengijinkan
membentuk sensor sebagai monolith dan lapisan
tipis yang dapat dipasangkan dengan serat optik
atau dideposisikan pada elektroda, maupun sebagai
nanopartikel.
Akan tetapi, pada proses sol-gel ketika terjadi
reaksi hidrolisis senyawa alkoksida menjadi silica,
dihasilkan alkohol. Selain itu, reaksi tersebut
biasanya dikatalisis dengan asam atau basa yang
menyebabkan pH larutan menjadi ekstrim. Adanya
alkohol dan pH ekstrim dapat menyebabkan
denaturasi dan penurunan aktivitas enzim. Oleh
sebab itu, perlu dicari suatu metoda immobilisasi
untuk menekan agar kedua faktor diatas tidak
berpengaruh pada enzim yang diimobilisasi.
Sebagaimana disebutkan diatas alah satu
penyebab mahalnya biosensor adalah digunakannya
dua enzim secara serempak yang diperangkap
dalam silika gel [10]. Untuk mengurangi biaya
produksi telah ada upaya untuk mangganti HRP
dengan (PB) [11]. PB memiliki karakteristik yang
baik karena memiliki aktivitas elektrokatalik dan
stabilitas yang tinggi, serta mudah dibuat.
Kemampuan PB untuk mendeteksi hidrogen
peroksida menyebabkan PB dapat digunakan untuk
menggantikan enzim HRP.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk
mengembangkan metoda immobilisasi enzim GOD
dalam lapisan sol-gel silica dari enyawa alkosida
sehingga faktor yang dapat mendenaturasi enzim
dapat diabaikan. Selain itu, juga dipelajari
penggunaan PB sebagai pengganti HRP dalam untuk
biosensor amperometri untuk analisa glukosa.

2. Bahan dan Metode

2.1. Bahan
Glucose oxidase (GOD, dari Aspergillus niger, 5800
U/g) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Bahan lain yang
digunakan adalah reagen-reagen untuk membuat
larutan sol-gel (tetraethoxysilane, TEOS, 99%,
Merck; air demineralisasi; etanol, 97%, Merck;, HCl,
p.a. 37%, Merck), reagen-reagen untuk membuat
lapisan film prussian blue (FeCl3.6H2O, K3Fe(CN)6,
HCl, and KCl, Merck) dan reagen untuk analisa
aktivitas enzim (Dglucose, anhydrous, 96%,
Aldrich; K2PO4 monobasic, anhidrat, Sigma Aldrich;
KOH, Merck). Larutan glukosa dibiarkan 24 jam
pada suhu kamar untuk mutorasi sebelum
digunakan. Larutan penyangga fosfat pH 7 dibuat
dengan pencampuran 0.1 M KH2PO4 and 0.1 M
KOH.
2.2. Peralatan
Pengukuran dan pengumpulan data percobaan
elektrokimia
dilakukan
dengan
Autolab
PGSTAT302N (Eco Chemie) dan software NOVA 1.6.
Percobaan elektrokimia dilakukan dalam sistem 3
elektroda konvensional dengan elektroda enzim
sebagai elektroda kerja, elektroda platina sebagai
elektroda counter, dan elektroda Ag/AgCl (KCl
jenuh) sebagai elektroda referensi. Percobaan cyclic
voltammetric (CV) dilakukan pada sel elektrokimia
statis pada suhu ruangan. Sedangkan percobaan
amperometrik dilakukan pada sel elektrokimia
berpengaduk pada potensial konstan. Seluruh
potensial dinyatakan sebagai versus Ag/AgCl (KCl
jenuh).
2.3. Pembuatan larutan sol gel
Larutan sol gel yang digunakan pada penelitian
ini berbasis TEOS sebagai prekursor silika dengan
katalis asam. Larutan terdiri dari TEOS 1,95 mL,
etanol sebagai pelarut 9,5 mL, air demineralisasi 3,1
mL, dan HCl 0,005 M 0,5 mL [9]. Larutan ini diaduk
dengan magnetik stirer selama 15 jam. Setelah
reaksi hidrolisa selesai, etanol diuapkan pada suhu
ruang dengan hembusan udara sehingga dihasilkan
sol silika yang bebas etanol.
2.4. Pembuatan lapisan film prussian blue
Elektrodeposisi lapisan film PB dilakukan
secara elektrokimia. Kawat platina (diameter 1 mm
dan panjang efektif 20 mm) dicuci dengan air, HCl,
dan etanol. Selanjutnya kawat dikeringkan dalam
oven 100 oC sampai kering. Kawat ditempatkan
pada sel elektrokimia yang terdiri dari 2,5 10-3 M

200

0
a

i (A)

FeCl3, 2,5 103 M K3[Fe(CN)6], 0,1 M HCl, dan 0,1 M

KCl dengan potensial konstan 0,4 V selama 20 detik.
Kawat tersebut kemudian dipindahkan pada sel
elektrokimia yang terdiri 0,1 M HCl dan 0,1 M KCl
dengan potensial disiklik sebanyak 25 kali antara
0,35 sampai -0,05 V dengan laju 0,05 V/detik. Kawat
kemudian dikeringkan pada 100 oC selama 1 jam
[12].

-200

-400
b

2.5. Pembuatan elektroda enzim

-600

3. Hasil dan Diskusi

3.1. Sifat Elektrokatalitik elektroda Pt/PB/GOD/
sol-gel silika terhadap H2O2
Elektroda Pt/PB/GOD/sol-gel silika diuji dengan
larutan H2O2 untuk mengetahui kemampuan PB
dalam memberikan respon terhadap H2O2. H2O2
merupakan hasil reaksi antara glukosa dengan GOD.
Pengujian dilakukan dengan menempatkan
elektroda Pt/PB/GOD/sol-gel pada sel elektrokimia
tanpa H2O2 dan ada H2O2 dengan potensial siklik.
Gambar 1 menunjukkan voltammogram siklik
elektroda Pt/PB/GOD/sol gel tanpa (a) dan dengan
adanya (b) 5 mM H2O2 dalam larutan penyangga
fosfat. Tanpa adanya H2O2, elektroda enzim tidak
memberikan respon dan hanya memberikan sifat
elektrokimia hasil reaksi reduksi oksidasi PB dalam
larutan penyangga. Setelah penambahan H2O2
puncak katodik pada CV meningkat, sedangkan
puncak anodik menurun. Perubahan pada CV
disebabkan kenaikan reduksi elektrokatalitik H2O2
oleh Prussian white (PW) yaitu bentuk PB tereduksi.
Reaksi katalitik tersebut dapat dinyatakan
sebagai [11] :
GODFAD + Dglucose
GODFADH2 + gluconolactone
(1)

GODFADH2 + O2 GODFAD + H2 O2
(2)
+
FeCN

FeCN

Fe4
6 3 + 4 e + 4K Fe4 K4
6 3 (3)
Fe4 K4 FeCN6 3 + 2H2 O2
Fe4 FeCN6 3 + 4OH- + 4K+
(4)
Glukosa mendifusi dari larutan ke lapisan film
enzim yang selanjutnya secara enzimatik dioksidasi
menjadi glukonat dan H2O2 (pers. 1 dan 2). H2O2
yang terbentuk kemudian direduksi secara katalitis

-0.1

0.1
0.2
E / V vs Ag/AgCl

0.3

0.4

Gambar 1. CV elektroda enzim dengan laju scan

0.05 V/detik dalam penyangga fosfat (pH 7).
oleh PW (pers. 3) dan pada saat yang bersamaan
PW kemudian teroksidasi menjadi PB (pers. 4). PB
kemudian
tereduksi
menjadi
PW
secara
elektrokimia pada potensial yang diberikan (pers.
3).
3.2. Respon Amperometrik Elektroda Enzim
Beberapa parameter yang mempengaruhi
respon amperometrik elektroda enzim diteliti, yaitu
potensial yang digunakan, konsentrasi SiO2, dan
jumlah enzim.
Gambar 2 menunjukkan pengaruh potensial
yang diberikan pada respon arus biosensor.
Pengukuran dilakukan pada 1,086 % konsentrasi
SiO2 dan jumlah enzim 7 U. Semakin tinggi potensial
yang digunakan semakin besar arus respon yang
dihasilkan. Potensial yang digunakan diusahakan
pada rentang potensial serendah mungkin namun
memiliki respon arus yang besar. Hal ini bertujuan
untuk menghindari terjadinya interferensi yang
timbul akibat reaksi samping. Namun, dalam
pemilihan ini perlu juga diperhatikan bahwa pada
potensial yang terlalu rendah akan dapat
mengakibatkan enzim tidak dapat mengoksidasi
12

i (A)

GOD yang telah dilarutkan pada penyangga

fosfat dicampurkan ke dalam larutan sol-gel silika
bebas alkohol. Larutan GOD/sol-gel kemudian
ditempelkan pada kawat platina yang telah dilapisi
PB. Elektroda Pt/PB/GOD/sol-gel silika dikeringkan
pada suhu ruangan selama 24 jam dan disimpan
pada suhu 10 oC sampai digunakan.

0
0.2

0.3

0.4

0.5
0.6
E(V vs Ag/AgCl)

0.7

0.8

Gambar 2. Pengaruh potensial yang digunakan

terhadap respon arus pada larutan glukosa 5
mM dengan laju scan 0.05 V/detik dalam
penyangga fosfat (pH 7).

1.50

1.00

1.00

i (A)

i (A)

1.50

0.50

0.50

0.00
0

1
2
SiO2 concentration (%, w/w)

Gambar 3. Pengaruh konsentrasi SiO2 terhadap

respon arus pada larutan glukosa 5 mM.
glukosa dengan baik. Berdasarkan hasil analisa
amperometrik untuk uji potensial, didapatkan
potensial sebesar 0,4 V. Potensial ini telah mampu
menghasilkan arus yang relatif besar. Oleh karena
itu, pengukuran amperometrik selanjutnya untuk
mengetahui pengaruh konsentrasi SiO2 dan jumlah
enzim digunakan potensial sebesar 0,4 V.
Konsentrasi silika berhubungan dengan
porositas/ukuran
pori.
Dalam
immobilisasi
diinginkan porositas yang optimal yaitu tidak terlalu
kecil yang dapat menghalangi tranfer massa glukosa
dan elektron, namun tidak terlalu besar yang dapat
menyebabkan berkurangnya aktivitas dan stabilitas
enzim. Semakin besar porositas, maka enzim akan
semakin mudah merembes keluar.
Gambar
3
menunjukkan
pengaruh
konsentrasi silika pada respon arus. Pengukuran
dilakukan pada potensial sebesar 0,4 V dan enzim
sebesar 7 U. Respon arus meningkat dengan
naiknya konsentrasi SiO2, mencapai maksimum
pada konsentrasi SiO2 1,086 %, dan kemudian turun
dengan naiknya SiO2.
Konsentrasi SiO2 mempengaruhi porositas
jaringan sol-gel. Pada konsentrasi SiO2 yang rendah,
enzim tidak dapat terikat secara sempurna dalam
jaringan sol-gel sehingga enzim cenderung dapat
keluar dan menjadi tidak stabil yang menyebabkan
respon arus rendah. Sebaliknya, konsentrasi SiO2
yang tinggi membuat ketebalan lapisan film solgel/GOD menjadi meningkat yang menyebabkan
difusi glukosa melalui jaringan berpori menjadi
semakin sulit dan lambat. Hal ini yang
menyebabkan respon arus menjadi lebih kecil.
Performa biosensor glukosa bergantung pada
aktivitas enzimatis dalam mengoksidasi glukosa,
yang dipengaruhi oleh jumlah enzim (enzyme
loading). Pada umumnya enzim memberikan respon
karena adanya kontak dengan substrat -D glukosa.
Penelitian ini menggunakan enzim GOD yang
merupakan katalis untuk mengubah glukosa
menjadi asam glukonat. Pada umumnya respon
arus semakin meningkat dengan meningkatnya
enzim yang digunakan.

0.00
5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

GOD loading (U)

Gambar 4. Pengaruh jumlah enzim terhadap

respon arus pada larutan glukosa 5 mM.
Gambar 4 menunjukkan pengaruh jumlah
enzim terhadap aktivitas biosensor pada
konsentrasi SiO2 sebesar 1,086 % pada larutan -D
glukosa 5 mM dengan potensial sebesar 0,4 V. Dari
gambar tersebut terlihat bahwa semakin besar
jumlah enzim maka arus yang dihasilkan akan
semakin besar pula. Hal ini terjadi karena dengan
bertambahnya jumlah enzim, maka enzim yang
bereaksi dengan glukosa juga semakin banyak
sehingga H2O2 yang terdeteksi oleh PB juga semakin
banyak. Akibatnya elektron yang terlepas dan
terbaca sebagai arus juga semakin tinggi. Setelah
mencapai maksimum pada jumlah enzim 7 U, arus
respon menjadi turun secara tajam dan cenderung
konstan. Sensor berbasis enzim oksidase
membutuhkan oksigen sebagai ko-substrat untuk
terjadinya oksidasi sehingga konsentrasi oksigen
dapat mempengaruhi respon arus. Pada nilai
optimumnya, kecepatan reaksi meningkat pada
elektroda enzim. Konsentrasi substrat menjadi
jenuh setelah mencapai kecepatan maksimum dan
menurun karena kekurangan oksigen [13].

4. Kesimpulan
Biosensor glukosa amperometrik dapat
diperoleh dengan immobilisasi enzim GOD metoda
sol-gel dan prussian blue. Beberapa parameter yang
mempengaruhi respon arus biosensor telah diteliti
yaitu potensial yang digunakan, konsentrasi silika,
dan jumlah enzim. Arus respon cenderung
meningkat dengan meningkatnya potensial. Tetapi
potensial yang dipilih adalah 0,4 V untuk mencegah
terjadinya interferensi. Respon arus maksimal
diperoleh pada konsentrasi SiO2 untuk immobilisasi
GOD 1,086 % dengan jumlah enzim GOD 7 U.

Daftar Pustaka
[1] Coradin, T., Boissere, M., dan Livage, J., 2006.
Sol gel Chemistry in Medicinal Science,
Current Medicinal Chemistry, 13, 99-108.

[2] Qian, J.M., Suo, A.L., Yao, Y., dan Jin, Z.H.,
2004. Polyelectrolyte stabilized Glucose
Biosensor Based on Woodceramics as
Electrode, Clinical Biochemistry, 37, 155-161.
[3] Tsai, M.C., dan Tsai, Y.C., 2009. Adsorption of
Glucose Oxidase at Platinum Multiwalled
Carbon Nanotube Alumina Coated Silica
Nanocomposite for Amperometric Glucose
Biosensor, Sensors and Actuators B, 141, 592598.
[4] Subramanian, A., Kennel, S.J., Oden, P.I.,
Jacobson, K.B., Woodward, J., dan Doktycz,
M.J., 1999. Comparison of Techniques for
Enzyme Immobilization on Silicon Supports,
Enzyme Microb. Technol., 24, 26-34.
[5] Yang, X., Hua, L., Gong, H., dan Tan, S.N., 2003.
Covalent Immobilization of An Enzyme
(Glucose Oxidase) onto Carbon Sol-Gel Silicate
Composite Surface as A Biosensing Platform,
Analytica Chimica Acta, 478, 67-75.
[6] Zhu, J., Zhu, Z., Lai, Z., Wang, R., Guo, X., Wu,
X., Zhang, G., Zhang, Z., Wang, Y., dan Chen, Z.,
2002. Planar Amperometric Glucose Sensor
Based on Glucose Oxidase Immobilized by
Chitosan Film on Prussian Blue Layer, Sensors,
2, 127-136
[7] Rauf, S., Ihsan, A., Akhtar, K., Ghauri, M.A.,
Rahman, M., Anwar, M.A., dan Khalid, A.M.,
2006. Glucose Oxidase Immobilization on A
Novel
Cellulose
Acetate

Polymethylmethacrylate Membrane, Journal of

Biotechnology, 121, 351-360.
[8] Gupta, R. dan Chaudhury, N.K., 2007.
Entrapment of Biomolecules in Sol gel Matrix
for Applications in Biosensors : Problems and
Future
Prospects,
Biosensors
and
Bioelectronics, 22, 2387-2399.
[9] Kunzelmann, U. dan Bottcher, H., 1997.
Biosensor Properties of Glucose Oxidase
Immobilized within SiO2, Sensors and Actuators
B, 38-39, 222-228
[10] Singh, S., Singhal, R., dan Malhotra, B.D., 2007.
Immobilization of Cholesterol Esterase and
Cholesterol Oxidase onto Sol Gel Films for
Application to Cholesterol Biosensor, Analytica
Chimica Acta, 582, 335-343.
[11] Liang, R., Jiang, J., dan Qiu, J., 2008. An
Amperometric Glucose Biosensor Based on
Titania Sol gel/Prussian Blue Composite Film,
Analytical Sciences, 24, 1425-1430
[12] de Mattos, I.L., Gorton, L., Laurell, T.,
Malinauskas, A., dan Karyakin, A.A., 2000.
Development of biosensors based on
hexacyanoferrates, Talanta, 52, 791-799.
[13] Li, T., Yao, Z., dan Ding, L., 2004. Development
of an amperometric biosensor based on

glucose oxidase immobilized through silica sol

gel film onto Prussian Blue modified electrode,
Sensors and Actuators B, 101, 155-160.