LAPORAN PRATIKUM BIOKIMIA

UJI PEROKSIDA LIPID DALAM CAIRAN BIOLOGIS

KELOMPOK 1 :

Dosen Pembimbing : dr. Sylvia Riannissa Putri, M.Sc

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS BENGKULU

BAB I
PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang
Lemak dan minyak adalah golongan dari lipida (latin yaitu lipos yang artinya lemak). Lipida

larut dalam pelarut nonpolar dan tidak larut dalam air. Sifat kelarutan ini yang membedakan
lipida dari golongan senyawa alam penting lain seperti protein dan karbohidrat yang pada
umumnya tidak larut dalam pelarut nonpolar.
Lipid atau Lemak adalah senyawa yang merupakan ester dari asam lemak dengan gliserol
yang kadang-kadang mengandung gugus lain. Lipid tidak larut dalam air, tetapi larut dalam
pelarut organic se[erti eter, aseton, kloroform, dan benzene. Lipid tidak memiliki rumus molekul
yang sama, akan tetapi terdiri dari beberapa golongan yang berbeda. Berdasarkan kemiripan
struktur kimia yang dimiliki, lipid dibagi menjadi beberapa golongan, yaitu Asam lemak, Lemak
dan fosfolipid (Salirawati et al, 2007).
Lemak dan minyak merupakan zat makanan yang penting untuk menjaga kesehatan tubuh
manusia. Selain itu lemak dan minyak juga merupakan sumber energi yang lebih efektif
dibanding dengan karbohidrat dan protein.
Lemak merupakan bahan padat pada suhu ruang disebabkan kandungannya yang tinggi akan
asam lemak jenuh yang tidak memiliki ikatan rangkap, sehingga mempunyai titik lebur yang
lebih tinggi, sedangkan minyak merupakan bahan cair pada suhu ruang disebabkan tingginya
kandungan asam lemak yang tidak jenuh, yang memiliki satu atau lebih ikatan rangkap diantara
atom-atom karbonnya, sehingga mempunyai titik lebur yang rendah (F.G Winarno, 2004).
Asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi
peroksida lipid. PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) pada manusia disintesis dari MUFA
(Mono Unsaturated Fatty Acid ), melalui penambahan ikatan rangkap antara ikatan rangkap yang
sudah ada dan gugus karboksil menghasilkan asam lemak w-9. Peroksidasi lipid adalah reaksi
penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang mengandung
sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh yang
diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di dalam
2

tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal

anion

superoksida,

radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat
dibuat oleh tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu
reaksi berantai yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh
radikal bebas lain dan oleh sistem antioksidan tubuh. Peroksida lipid selanjutnya mengalami
dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan
yang paling sering digunakan untuk mengukur proses peroksidasi lipid. Adanya malonaldehid
dapat diidentifikasi dengan asam tiobarbiturat (TBA) yang akan membentuk kompleks berwarna
merah, sehingga dapat ditetapkan secara spektrofotometri. Pengujian MDA dilakukan dengan
TBA diukur menggunakan spektrofotometri dengan serapan cahaya pada panjang gelombang
532 nm, juga dapat diukur dengan HPLC (High Performance Liqiud Chromatography) (Halliwell
& Gutteridge 1999). Reaksi yang terjadi antara malonaldehid dengan TBA adalah sebagai
berikut:

Uji ini penting dilakukan karena selain menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan
biologis kita juga dapat mempelajari bagaimana proses peroksidasi lipid dan apa saja yang
mempengaruhi proses peroksidasi lipid tersebut.

1.2

Tujuan
Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis

Peroksida lipid merupakan reaksi berantai yang terus menghasilkan pasokan radikal

bebas sehingga terjadi reaksi-reaksi peroksidasi berikutnya. Keseluruhan proses tersebut dapat
diganbarkan sebagai berikut:
1. Inisiasi
Xo+ RH Ro + XH
Pada tahap ini dengan adanya oksigen bebas akan terjadi pengambilan atom H dari
PolyUnsaturated Fatty Acid (PUFA) yang terdapat pada membran sel sehingga
menyebabkan kerusakan pada sel.
2. Propagasi
Ro+ O2ROOo
ROOo + RH ROOH + Ro ,danseterusnya
Hasildarireaksiiniakanmenjadiinisiatorbaruuntukbereaksidengan

PUFA

yang

lain

sehinggamenghasilkanprodukradikalbaru.
3. Terminasi
ROOo + ROOo ROOR + O2
ROOo + Ro ROOR
Ro + Ro RR
Tahapinimengkombinasikanduaradikalmenjadisuatuproduk non radikal (Murray dkk.,
2000).
Parameter yang digunakan untuk mengevaluasi nilai biologis lemak, antara lain:
1 Bilangan peroksida
2 Bilangan TBA
3 Bilangan iod
4 Kadar asam lemak trans dan asam lemak esensial
5 Profillipid darah (total kolesterol, trigliserida, HDL, LDL)
6 Kadar TBARS menunjukkan tingkat oksidasi lemak
7 Pengujian daya hipokolesterolemik in vitro
4

8 Pengujian kapasitas pengikatan asam empedu atau kolesterol in vitro

9 Kadar asam empedu sekum
2.2

Kadar Malondialdehid (MDA) Sebagai Indikator Peroksidasi Lipid

MDA terbentuk dari peroksidasi lipid (lipid peroxidation) pada membran sel yaitu reaksi

radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA). Reaksi tersebut
terjadi secara berantai, akibat akhir dari reaksi rantai tersebut akan terbentuk hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida tersebut dapat menyebabkan dekomposisi beberapa produkal dehid yang
bersifat toksik terhadap sel dan berbeda panjang rantainya, antara lain MDA, yang merupakan
salah satu aldehid utama yang terbentuk (Edyson, 2003).
Pengukuran kinetika peroksidasi lipid secara in vitro dapat dilakukan dengan mengukur
berapa banyak oksigen yang dibutuhkan. Ada beberapa metode yang dapat digunakan, salah
satunya TBA (Thiobarbituric Acid) reactivity test, yang dapat dilakukan baik secara in vivo
maupun in vitro. Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu molekul MDA dengan
dua molekul TBA pada kondisi asam. Hasilnya adalah pigmen berwarna merah yang dapat
diukur pada panjang gelombang 532 nm. Jumlah MDA yang terdeteksi menggambarkan
banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi (Janero, 1990).
MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai
biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres oksidatif.
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron yang tidak
berpasangan di orbit luarnya (unpaired electron). Zat ini sangat reaktif, dan struktur yang
demikian membuat radikal bebas cenderung mencuri atau mengekstraksi satu elektron dari
molekul lain di dekatnya untuk melengkapi dan selanjutnya mencetuskan reaksi berantai yang
dapat mengakibatkan cedera sel.
Oksidan adalah senyawa penerima elektron (electron acceptor), yaitu senyawa yang dapat
menarik elektron. Sering dibaurkan pengertian antara radikal bebas dan oksidan, karena
keduanya memiliki sifat-sifat yang sama yaitu kecenderungan untuk menarik elektron (penerima
elektron). Aktivitas keduanya menghasilkan akibat yang sama walaupun prosesnya berbeda, oleh
karena itu radikal bebas digolongkan dalam oksidan, namun tidak setiap oksidan adalah radikal
bebas. Radikal bebas lebih berbahaya dibandingkan dengan oksidan yang bukan radikal bebas,
dikarenakan sifat radikal bebas memiliki reaktivitas tinggi dan kecenderungan membentuk

radikal yang baru sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction) dan akan berhenti apabila dapat
diredam oleh antioksidan.
Strategi yang digunakan anti-oksidan dalam meredam oksidan adalah strategi 2 tahap,
yaitu:
1 Mencegah terhimpunnya senyawa-senyawa oksidan secara berlebihan
2 Mencegah reaksi rantai berlanjut
Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida
lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA). MDA akan
membentuk senyawa berwarna merah muda bila direaksikan dengan asamtiobarbiturat (TBA).
Jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui berdasarkan kemampuan penyerapan cahaya pada
A532 nm. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.

MDA sebagai salah satu produk lipid peroksidasi yang bersifat toksik terhadap sel
merupakan senyawa dialdehid yang memiliki tiga rantai karbon serta memiliki berat molekul
(BM) rendah dan dapat diproduksi oleh mekanisme yang berbeda-beda.
Beberapa studi menyatakan bahwa jumlah MDA dapat dihasilkan oleh beberapa sumber,
diantaranya berasal dari asam lemak yang setidaknya memiliki 3 ikatan rangkap, radikal bebas
melalui reaksi ionisasi dalam tubuh dan produk samping biosintesis prostaglandin yang
merupakan produk akhir oksidasi lipid membran, hasil dekomposisi dari asam amino,

karbohidrat kompleks, pentosa, dan heksosa serta berasal dari produk radikal bebas yang
dihasilkan oleh iridasi gamma.
2.3

Latihan Fisik
Latihan fisik berlebih untuk mendapatkan hasil maksimal dan risiko minimal pada

pelatihan, diperlukan kondisi lingkungan yang memadai dan takaran pelatihan yang tepat untuk
setiap individu meliputi FITT, yaitu Frequency, Intencity, Tipe, Time. Frekuensi pelatihan yang
dianjurkan tiga hingga lima kali per minggu dengan intensitas kurang lebih 60-85% dari denyut
jantung maksimal: 220 - umur (dalam tahun). Latihan didahului pemanasan selama 3-5 menit,
dilanjutkan latihan inti 15-60 menit, diakhiri pendinginan 3-5 menit.
Tenaga aerobik maksimum sebagai ukuran kesegaran fisik yang dinyatakan sebagai
kemampuan bekerja berat untuk waktu lama dipengaruhi kerja otot secara aerobik seperti:
1). Tipe pelatihan yang meliputi intensitas, durasi, otot yang terlibat, posisi tubuh
2). Aktivitas otot secara aerobik tergantung jenis kelamin dan umur
3). Lingkungan (ketinggian, dingin, panas)
4). Adaptasi
Tenaga aerobik maksimum dikaitkan dengan pengambilan O 2 maksimum yang erat
terkait umur. Bila pada permulaan kerja langsung dilakukan pembebanan berat, kebutuhan energi
hanya dapat dipenuhi dengan mengaktifkan proses anaerob yang menghasilkan asam laktat dan
konsentrasinya tetap meninggi selama kerja berlangsung dan dapat dipertahankan terus-menerus
selama 30 menit atau lebih. Pada kerja yang sangat berat terjadi defisit penyediaan O 2 yang
bertambah besar sehingga konsentrasi asam laktat semakin meningkat. Akumulasi asam laktat
dalam otot menyebabkan kelelahan otot.
Pada pelatihan aerobik pemecahan glikogen menjadi CO 2 dan H2O yang dikenal sebagai
metabolisme aerobik merupakan sumber energi yang ekonomis dan asam laktat tidak
terakumulasi. Pelatihan berlebih menyebabkan banyak asam laktat yang dihasilkan dalam otot,
kehabisan glikogen meningkat, dua-duanya penyebab stres fisik.

Latihan fisik berlebih merangsang terjadinya leukositosis, peningkatan isoprostan dalam

urine (7-fold), TBARS (56%), protein karbonil (73%), katalase (96%), glutathione peroxidase,
serta glutathione yang teroksidasi (GSSG) (25%). Sebaliknya latihan fisik berlebih akan
menurunkan glutathione tereduksi (GSH) (31%), GSH/GSSG (56%), dan kapasitas total
antioksidan. Dapat disimpulkan, latihan fisik berlebih merangsang respon terhadap biomarker
stres oksidatif (Winasi H, 2007).

BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

3.1

Alat dan Bahan

1. Urin
2. Larutan asam trikloroasetat ( TCA) 10 %
3. Larutan TBA 0,67 %
4. Tabung reaksi
5. Tabung kupet
6. Pemanas
7. Spektrofotometri
3.2

Cara Kerja
1. Tabel langkah kerja pada urin sebelum berolahraga
Bahan

Uji (mL)

Urin
Akuades
TCA 10%
Kocok, sentrifugasi

Blanko (mL)

0,25

0,25

0,5

0,5

0,75

0,75

ambil

supernatan
TBA 0,67 %
Masukkan

ke

penangas

10

menit, dinginkan, baca serapan

pada gelombang 532nm

2. Ulangi langkah kerja di atas dengan menggunakan urin setelah berolahraga selama 15
menit
3. Kadar MDA = Absorbansi : 153.000 M-1 cm-1 ---> Konversi ke mmol/L
9

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil
Perhitungan Kadar Malondialdehid (MDA)

MDA UJI 1
M

absorbansi
153.000 M 1 cm1

0,210
153.000

1,375 10

mol
103
L

1,375 106 103

= 1,375 10 mmol/L
Kadar MDA 1

3
= 1,375 10 18

= 2,475 10 mg/dl

MDA UJI 2
M

absorbansi
153.000 M 1 cm1

0.277
153.000

10

= 1,8104 10

mol
103
L

1,8104 106 103

3

= 1,8104 10 mmol/ L
Kadar MDA 2

3
= 1,8104 10 18

= 5,4312 10 mg/dl

4.2

No
1
2

Tabung
Tabung Blanko I
Tabung Uji I

Nilai Absorbansi
0,000
0,210

Kadar MDA (mg/dl)

0,000 mg/dl
2,475 102 mg/dl

3
4

Tabung Blanko II
Tabung Uji II

0,000
0,277

0,000 mg/dl
5,4312 102 mg/dl

Pembahasan

Pada praktikum uji peroksida lipid dalam cairan biologis. Kita mengukur kadar peroksida
lipid di dalam cairan biologis, cairan biologis yang digunakan adalah urin. Peroksidasi lipid
adalah reaksi penyerangan radikal bebas terhadap asam lemak tidak jenuh jamak (PUFA) yang
mengandung sedikitnya tiga ikatan rangkap. Reaksi ini dapat terjadi secara alami di dalam tubuh
yang diakibatkan oleh pembentukan radikal bebas secara endogen dari proses metabolisme di
dalam tubuh. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh radikal bebas seperti radikal anion superoksida,
radikal hidroksil dan radikal peroksil. Radikal bebas secara berkesinambungan dapat dibuat oleh
tubuh kita. Setiap radikal bebas yang terbentuk oleh tubuh dapat memulai suatu reaksi berantai
yang akan terus berlanjut sampai radikal bebas ini dihilangkan oleh radikal bebas lain dan oleh
sistem antioksidan tubuh (Halliwell & Gutteridge 1999).
Peroksida lipid selanjutnya mengalami dekomposisi menjadi malondialdehid (MDA).
MDA produk akhir proses peroksidasi lipid dan yang paling sering digunakan untuk mengukur
proses peroksidasi lipid. Pengujian MDA dilakukan dengan TBA (Asam tiobarbiturat) yaitu akan

11

membentuk senyawa warna merah muda dan diukur serapan pada panjang gelombang 532 nm,
juga dapat diukur dengan HPLC (High Performance Liqiud Chromatography).
Pada percobaan kali ini pengukuran kadar malondialdehid (MDA) dilakukan sebelum OP
(orang percobaan) berolahraga (UJI 1) dan sesudah OP melakukan olahraga selama 15 menit
(UJI 2). MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai
biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stress oksidatif.
MDA terbentuk dari peroksidasi lipid (lipid peroxidation) pada membrane sel yaitu reaksi
radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA). Radikal bebas
adalah atom atau molekul yang memiliki sebuah elektron yang tidak berpasangan di orbit
luarnya (unpaired electron). Zat ini sangat reaktif, dan struktur yang demikian membuat radikal
bebas cenderung mencuri atau mengekstraksi satu elektron dari molekul lain di dekatnya
untuk melengkapi dan selanjutnya mencetuskan reaksi berantai yang dapat mengakibatkan
cedera sel.
Pada uji 1 dan 2 masing-masing ditambahkan 0,25 ml urin sedangkan blanko
ditambahkan aquadest selanjutnya pada uji 1,2 dan blanko ditambahkan TCA 10% penambahan
TCA bertujuan agar protein yang terkandung dalam urin pada uji 1 dan 2 mengalami presipitasi
setelah di sentrifugasi pada 3500 rpm. Presipitasi protein dilakukan karena kandungan protein
yang terkandung dalam urin akan mengganggu penetapan kadar peroksida lipid.
Mekanisme TCA 10 % sebagai agen presipitasi yakni ion negatif dari TCA akan
bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam
kondisi asam hingga pH isoelektrik protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam
yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk
memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam
protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang
bermuatan negatif atau anionic protein).
Selanjutnya setelah disentrifugasi pada 3500rpm dan supernatantnya diambil dan
tambahkan larutan TBA 0,67% yang telah dipanaskan. Tujuan pemanasan adalah agar TBA
segera bereaksi dengan supernatant dan memberikan warna merah yang menandakan bahwa
mengandung malondialdehida (MDA). Selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan setelah dingin
dibaca pada panjang gelombang 532 nm.
Malonaldehida, 4-hidroksinonenal, dan heptanal, merupakan aldehida-aldehida hasil
dekomposisi senyawa hidroperoksida, yang bereaksi dengan TBA dan menghasilkan warna
merah. Warna merah tersebut menyerap cahaya ultraviolet pada panjang gelombang () 532 nm.

12

Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon nomor 5 (C5) TBA yang reaktif.
Uji TBA hanya mendeteksi MDA bebas dan mengukur jumlah MDA bebas dalam sistem
lipid peroksidasi. Pada uji 1 dan 2 menunjukkan warna bening yang berarti negatif terkandung
Malondialdehida. Malondialdehida merupakan proses akhir dari peroksidasi lipid dan blanko
tidak menunjukkan perubahan warna dan larutan blanko tetap bening.
Pada percobaan ini, nilai MDA pada uji 1 sebesar 2,475 x 10-2mg/dl dan pada uji 2
didapatkan MDA sebesar 5,4321 x 10-2 mg/dl. Walaupun nilai tersebut sangatlah kecil, namun
terlihat bahwa terdapat perbedaan signifikan antara kadar MDA yang diukur ketika OP sebelum
melakukan olahraga dan pengukuran MDA setelah OP melakukan olahraga selama 15 menit
nonstop.
Dari hasil percobaan ini dapat disimpulkan bahwa ketika kita melakukan olahraga yang
berlebihan akan terjadi reaksi radikal bebas, dimana radikal bebas ini nanti akan cenderung
mengekstrasikan satu elektron dari molekul lain yang berada di dekatnya untuk melengkapi
(reaksi radikal bebas (radikal hidroksi) dengan Poly Unsaturated Fatty Acid (PUFA)) (Diedrich
F, dkk., 2001). Dari reaksi tersebut pada membran sel, MDA terbentuk.

13

BAB V
KESIMPULAN
1. MDA merupakan suatu produk akhir peroksidasi lipid, yang biasanya digunakan sebagai
biomarker biologis peroksidasi lipid dan menggambarkan derajat stres oksidatif.
2. Kadar MDA yang terkandung di dalam urin sebelum melakukan olahraga pada uji 1 =
2,475 102 mg/dl.
3. Kadar MDA yang terkandung di dalam urin sesudah melakukan olahraga pada uji 2 =
5,4312 102 mg/dl.
4. Peningkatan kadar MDA setelah melakukan olahraga membuktikan bahwa radikal bebas
pada saat olahraga lebih besar dari pada sebelum berolahraga.
5. Radikal bebas bereaksi dengan asam lemak di sel (proses peroksidasi lemak) yang
mengakibatkan membran sel rusak dan terbentuk MDA.
6. Penambahan TBA 0,67 % tidak memberikan reaksi apapun pada uji dan blanko.
7. Kemampuan TBA bereaksi dengan aldehida atau keton, karena adanya atom karbon
nomor 5 (C-5) TBA yang reaktif.
8. Penambahan TCA % bertujuan untuk mengendapkan protein yang terdapat pada urin
sehingga tidak mengganggu penetapan kadar peroksida lipid, tetapi dari hasil praktikum
urin yang diuji tidak mengandung protein, dibuktikan tidak adanya endapan (pellet)
setelah di sentrifugasi 3500 rpm selama 10 menit.

14

DAFTAR PUSTAKA

Diedrich F, Renner A, Rath W, Kuhn W, Wieland E. 2001. Lipid hydroperoxides and free radical
scavenging enzyme activities in preeclampsia and HELLP (hemolysis, elevated liver
enzymes, and low platelet count) syndrome: no evidence for circulating primary
products of lipid peroxidation. AmJ Obstet Gynecol: 185:166-72.
Halliwel, B., J.M.C. Gutteridge. 1999. Free radicals in Biology and Medicine. Oxford University
Press. New york.
Janero DR. 1990. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of
lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. USA.
Murray, R.K., Bender, D.A., Botham, K.M., Kennelly, P.J., Rodwell, V.W., Weil, P.A. 2009.
Biokimia Harper. The McGraw-Hill Companies, Inc, New York.
Salirawati et al. 2007. Belajar Kimia Menarik. Jakarta: Grasind.
Winarno F.G. 2004. Kimia Panngan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
Winasi H, 2007. Antioksidan Alami dan radikal Bebas. Yogyakarta : Penerbit Kanisius, p: 105109.

15

LAMPIRAN

16