1.

Media dan Cara Pembuatan Media

Pembiakan mikrobia di laboratorium memerlukan media yang berisi zat hara serta
lingkungan pertumbuhan yang sesuai bagi mikroba. Media adalah suatu bahan yang digunakan
untuk menumbuhkan mikroba yang terdiri atas campuran nutrisi atau zat-zat makanan. Selain
untuk menumbuhkan mikroba, media dapat juga digunakan untuk isolasi, memperbanyak,
pengujian sifat-sifat fisiologis dan perhitungan jumlah mikroba (Lay, 1994; Jutono dkk,1980).
Syarat media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah lingkungan kehidupannya harus
sesuai dengan lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya (media
harus mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat/metabolisme, juga
mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas), tekanan osmose yaitu harus isotonik,
derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan
steril.
Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber energi
(contoh: gula), sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang khusus, seperti
vitamin (Jawetz dkk, 1996).
Berdasarkan komposisi kimianya, media dapat dibedakan menjadi media sintetik yaitu
media yang susunan kimianya diketahui dengan pasti, medium ini biasanya digunakan untuk
mempelajari kebutuhan makanan mikroba. Media non sintetik (kompleks) yaitu media yang
susunan kimianya tidak dapat diketahui dengan pasti, media ini digunakan untuk menumbuhkan
dan mempelajari taksonomi mikroba. Berdasarkan konsistensinya media dapat dibedakan
menjadi : media cair, media padat, dan media padat yang dapat dicairkan (Lay, 1994; Jutono dkk,
1980; Jawetz dkk, 1996).

a. Media berdasarkan komposisi kimianya :

1. Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
2. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara
pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan
ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara
detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
3. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat
diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya
Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
b. Berdasarkan bentuk dan konsistensinya :
1. Media Padat
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin
media menjadi padat. Contoh : Nutrient agar dan blood agar.

Gambar : BloodAgar

2. Media Cair
Media Cair yaitu media berbentuk cair yang tidak mengandung agar, contoh : NB
(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

Gambar : Nutrient Broth

3. Media Semi Padat (Semisolid)
Media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal,
tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan
mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran
sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free
Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah
permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur.
Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media
Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat
tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

Gambar : SIM
c. Berdasarkan Kegunaannya :
1. Media Umum : Digunakan secara umum dimana media ini dapat ditumbuhi oleh berbagai
jenis mikroorganisme baik jamur maupun bakteri. Contoh : Nutrient agar dan Blood Agar
2. Media Selektif : Media ini dipakai untuk menyeleksi mikrorganisme sesuai dengan yang
diinginkan, jadi hanya satu jenis mikrorganisme saja yang dapat tumbuh dalam media ini
atau hanya satu kelompok tertentu saja, misalnya media Salmonella atau Sigella dari
makanan atau bahan lain. Contoh : Manitol Salt Agar (MSA)

Gambar : MSA
3. Media Diferensial : Media ini dipergunakan untuk menyeleksi mikrorganisme dimana
dapat ditumbuhi berbagai jenis mikrorganisme tapi salah satu diantaranya dapat
memberikan ciri yang khas sehingga dapat dibedakan dari yang lain dan dapat
dipisahkan. Contoh : Mc. Conkey Agar

Gambar : MCA
4. Media Enrichment : Medium ini gunanya untuk menumbuhkan mikrorganisme untuk
keperluan tertentu. Dibiakkan dalam medium ini supaya sel-sel mikrorganisme tersebut
dapat berkembang dengan cepat sehingga diperoleh populasi yang tinggi. Kompossisi
medium sangat diperlukan dan sangat menguntungkan bagi pertumbuhan sel
mikrorganisme yang bersangkutan. Contoh : Selenit-F Broth

Gambar : Selenit F-Broth

5. Media Selektif
Media selektif (selective medium) atau media penghambat adalah media yang
ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba
lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung
kristal violet pada kadar tertentu, dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa
mempengaruhi bakteri gram negatif. Media ini selain mengandung nutrisi juga ditambah
suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan
merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Media ini dipakai untuk menyeleksi
mikrorganisme sesuai dengan yang diinginkan, jadi hanya satu jenis mikrorganisme saja
yang dapat tumbuh dalam media ini atau hanya satu kelompok tertentu saja.

Media tumbuh yang digunakan :

Media Eosin Methylene Blue :
Simpan pada +15C hingga +25C
Ph 7.0 - 7.2
Media tidak boleh digunakan jika ada tanda-tanda kontaminasi, kemerosotan
(menyusut, retak, atau perubahan warna), atau jika tanggal kadaluarsa telah berlalu
termasuk agar padat. Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan
mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan
laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi
laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan
mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen

blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini
digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan
Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk
mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah

E.coli. Agar EMB (levine)

merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli
dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan
metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang
meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena
kemempuan bakteri coli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk
mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal
dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat),
tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml
dan 0,1 ml contoh air.
6. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik:
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu
mikroba. Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakan untuk menguji
kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
2. Teknik-teknik Isolasi atau Penanaman Mikroba
Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi serta kebutuhan
akan oksigen (gas, O2 atau udara). Cara menumbuhkan mikroba yang anaerob sangat berbeda
dengan yang aerob. Mengisolasi suatu mikroba ialah memisahkan mikroba tersebut dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan.

Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan menumbuhkan mikroba pada medium
biakan serta syarat-syarat lain untuk pertumbuhannya (Jutono dkk, 1980).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pembiakan mikroorganisme :

Faktor Fisik
1. Suhu / Temperatur
2. pH
3. Kekuatan Ion dan Tekanan Osmotik
4. Potensial Oksidasi-Reduksi
Faktor Kimia
1. Air
5. Sumber Nitrogen
2. Oksigen
6. CO2
3. Garam-garam Anorganik
7. Faktor Pertumbuhan
4. Mineral
a. Metode Pembiakan Mikrobiologi :
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari
teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke
dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada
bentuk sampel :
a. Swab (ulas)
Dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan
pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut.Contohnya adalah meja,
batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh
permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik
jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.

Gambar : Teknik Swab

b. Rinse (bilas)
Ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat
yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur

kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v).

Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml
yang terdapat dalam beaker glass.

Gambar : Teknik Rinse

c. Maseration (pengancuran)
Sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga
mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam
air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel
dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu
dimaserasi

Gambar : Teknik Meseration

2. Teknik Pengenceran Bertingkat

Gambar :
Teknik Pengenceran

Gambar : Hasil Pengenceran

Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba
yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran
tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9
untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya
mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
1. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10
atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi).
2. Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades
yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1
3. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat
dilihat pada gambar disamping). Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian
dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung
ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran
terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan
harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari
sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspense

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan

suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi
(mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
Mikroba jarang terdapat di alam dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan
campuran bermacam-macam spesies mikroba. Macam-macam cara mengisolasi dan
menanam mikrobia adalah : 1). Spread plate method (cara tebar/sebar), 2). Streak plate
method (cara gores), 3). Pour plate method (cara tabur).
a. Spread PlateMethod (Cara Tebar/Sebar)
Teknik spread plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur
mikroba secara pulasan/sebaran di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini
dilakukan dengan mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba
pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap, sehingga
sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu yang mengandung koloni terpisah (30-300
koloni). Koloni mikrobia yang terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung.

b. Pour PlateMethod (Cara Tabur)

Cara ini dasarnya ialah menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
temperatur 45-50OC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke

dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di permukaan
agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk,
1980).

d. Streak PlateMethod (Cara Gores)

Cara gores umumnya digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar
sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya ialah
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan medium agar yang
sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni
terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono
dkk,1980). Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Bakteri yang
memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang menyebar terutama bila digunakan
lempengan yang basah. Untuk mencegah hal itu harus digunakan lempengan agar yang benarbenar kering permukaannya (Lay, 1994)

4. Pembuatan Pulasan Bakteri

Bakteri atau mikroba lainnya dapat dilihat dengan mikroskop cahaya tanpa
pewarnaan/pengecatan atau dengan pewarnaan/pengecatan. Pengamatan tanpa pengecatan lebih
sukar dan tidak dapat dipakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti karena sel bakteri
atau mikroba lainnya transparan atau semi transparan. Dengan pengecatan, dapat dilihat struktur
sel mikroba seksama.

Fungsi pengecatan adalah :

a) memberi warna pada sel atau bagian-bagiannya sehingga member kontras dan tampak lebih
jelas,
b) dapat untuk menunjukkan bagian-bagian struktur sel,
c) membedakan mikroba satu dengan yang lain
d) menentukan pH dan potensial oksidasi reduksi ekstraseluler dan intraseluler. (Jutono dkk.,
1980).
Pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan. Hasil
pengecatan dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti : fiksasi, substrat, dekolorisator dan
sebagainya. Dalam pembuatan pulasan bakteri yang siap diwarnai, perlu dilakukan fiksasi
terlebih dahulu yang bertujuan antara lain :
a)
b)
c)
d)

mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel,

merubah afnitas cat,
mencegah terjadinya otolisis sel,
dapat membunuh mikroba secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan

bentuk atau strukturnya,

e) melekatkan bakteri di atas gelas benda
f) membuat sel-sel lebih kuat/keras.
a. Pewarnaan Sel
Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati
morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecatan atau pewarnaan salah satunya
adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu proses.

Gambar : Pewarnaan sel

Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :

Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana

merupakan

teknik

pewarnaan

yang

paling

banyak

digunakan.Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut.Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaanpewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa).Zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin.Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa
digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet dan karbol fuehsin.
Pewarnaan Kristal violet :

Gambar : Pewarnaan Kristal violet

Pewarnaan ini masih dibagi menjadi 2 yaitu :

a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah biru
metilen dan air furksin.
Cara kerja : Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass
yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat tapi jika
suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan

mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada
object glass tanpa merusak struktur selnya.

Gambar : Metilen Biru

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri
tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang).Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan
ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan
cat

nigrosin.

Cara kerja pewarnaan negative : ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di
ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam
tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian
gesekkan ke samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau
dipanaskan di atas api.

Gambar : Tinta Cina

Pewarnaan Diferensial (gram )

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gramnegatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan
bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif
akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara
bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda.Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua
tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas 2
kelompok berdasarkan pewarnaan pewarnaan ini yaitu bakteri gram positif dan gram
negatif.Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama
disebut warna dasar, berupa pewarna basa , jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas.
Reagen kedua disebut pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna ,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan
warna dasar , maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila
warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat , yang terlihat pada hasil akhir
tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang dipakai dalam pewarnaan gram, yaitu Kristal

violet, larutan iodin, alcohol 90% , dan larutan safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan
gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap :
a. Pemberian cat warna utama ( cairan Kristal violet ) berwarna ungu
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ
c. Pencucian (dekolarisasi ) dengan larutan alkohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

1. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol , sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji
pewarnaan gram , suatu pewarna penimbal ditambahkan setelah metil ungu , yang membuat
semua bakteri gram negative menjadi bewarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.
Banyak spesies bakteri gram negatif pathogen , yang berarti mereka berbahaya bagi
inang. Sifat pantogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram negatif , terutama lapisan lipopolisakarida ( LPS atau endotoksin )

Gambar : Bakteri gram negatif

2. Bakteri Gram positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm ,
berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (14%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal . Komponen utama merupakan lebih
dari 50% berat ringan.

Gambar : Bakteri gram positif

Cara kerja pewarnaan diferensial :
a.
b.
c.
d.
e.

Sediakan kaca yang bersih

Kemudian taruhlah kaca diatas nyala api bunsen
Teteskan aquades steril diatas kaca secara aseptic
Ambilah inoculum bakteri yang akan diperiksa , lalu letakan diatas kaca
Kemudian ratakan perlahan sambil menegakan kaca sehingga inoculum bakteri menjadi tipis

dan rata
f. Biarkan hingga kering , dengan cara melewatkan kaca tersebut diatas nyala api dengan
cepatdan letakan kaca diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna

g. Lalu teteskan larutan Kristal violet pada kaca dan biarkan selama 30-60 detik , cuci warna
dasar dengan air mengalir , keringkan
h. Teteskan larutan iodin pada kaca , biarkan 30-60 detik , cuci larutan dengen air mengalir ,
keringkan kemudian rendam atau basuh dengan alcohol yang tersedia
i. Teteskan larutan safranin , biarkan selama 30-60 detik , cuci dengan air mengalir , lalu

keringkan dan amati dengan mikroskop morfologinya,

Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus
atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel.Contohnya pewarnaan pada
Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri
yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.Endospora merupakan bentuk dorman
dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam
tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia.Tujuan
dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif,
sehingga pembedaannya tampak jelas.Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop
meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat
refraktil.Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan
inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik
pewarnaan endospora.

Sterilisasi dan Teknik Aseptis

a. Sterilisasi
Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang teradapat
pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas

(pemijaran dan udara panas) , penyaringan , penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam
perasetat, formaldehida dan glutaraldehida alkalin). (Hadioetomo, 1999).
Ada 5 metode umum strerilisasi :
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembap)
2. Sterilisasi Panas Kering
3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)
4. Sterilisasi Gas
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara :
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil
(0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses
ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misal nya larutan enzim dan
antibiotik.
2. Sterilisasi secara

fisik

dapat

dilakukan

dengan

pemanasan

&

penyinaran.

Pemanasan dengan api langsung membakar alat pada api secara langsung.
Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer,
tabung reaksi. Uap air panas konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Uap
air panas bertekanan menggunalkan autoklaf dengan bgmenggunakan panas dan tekanan
dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121C. Sinar Ultra Violet juga dapat
digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel
pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV.
3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain
alcohol atau larutan formalin. Pada praktikum kali ini menggunakan sterilisasi secara
fisik dengan menggunakan autoclave dengan prinsipnya sterilisasi dengan pemanasan
menggunakan uap air panas bertekanan.
b. Teknik Aseptis
Aseptik adalah keadaan bebas dari mikroorganisme penyebab penyakit.Oleh karena itu,
perlu dilakukan upaya melalui teknik aseptik. Teknik aseptik/asepsis adalah segala upaya yang

dilakukan untuk mencegah masuknya mikroorganisme ke dalam tubuh yang kemungkinan besar
akan mengakibatkan .infeksi. Tindakan asepsis ini bertujuan untuk mengurangi atau
menghilangkan mikroorganisme yang terdapat pada permukaan benda hidup atau benda
Tindakan ini meliputi antisepis, desinfeksi, dan sterilisasi.Teknik aseptik melibatkan
pengembangan mikroorganisme secara manual. Oleh karena itu adapun general untuk
kesalamatan selama berkerja yaitu akses ke laboratorium terbatas, memakai jas lab dan sarung
tangan, tinggalkan semua makanan dan minuman,jangan mengunyah permen karet di
laboratorium, buang bahan yang terkontaminasi dalam wadah yang tepat jika ada kontak dengan
mikroorganisme harus didesinfeksi dengan desinfektan atau diautoklaf, segera bersihkan semua
tumpahan, dekontaminasi bangku laboratorium Anda dengan disinfektan sebelum dan sesudah di
dalam lab, cuci tangan anda sebelum melakukan praktikum dan sesudah meninggalkan
laboratorium.