PR,CEEDNGSnBloL 20, No.

112,1987

4l

ANALISISASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFICAIRAN KINERJA

TINGGISECARADERIVATISASI PRAKOLOMDAN PASCAKOLOM

Oleh: lvayanRediatningS*. da Nanny Karti i H.*

ABSTRACT
Tlrough an experiment process,an optimum condition of amino acid analysisusing High
krformance Liquid Chlromatography(HPl{) with post- and pre+olumn derivatization
methodshasbeen found.
The optimum condition of the analysisfor the post{olumn deriyatization was obtained
(R-SO3 Na) as the column,citric acidbuffer of the pH 3,0
by usingresincation exchanger
and bodc acid buffer of the pH 9,? as the mobile phase,and O-phtalaldehyde(OPA) /2-mercaptoethanolasthe derivator,
Cl8 wasusedasthe colunn,
In the pre-columnderivatizationmethod,Resolve5;r spherical
=
(methanol
:
which
2
:
96)
2
contains 005 M Na2HPOa and
: THF ; H2O
solution A
=
0.05M NaOAc) and solutionB(methanol:H2O 65 : 35) as the mobile phase,and OPA/
ethantiolasthe derivator.
Each of both HPlf methods can separatemore than 17 kinds of amino acids.The result
showstiat the prc-column derivatization method was more sensitiveand took a shorter
analysingtime than the post{olumn derivatizationme'thod;howyer,secondaryamino acid
couldnot be determinedby the first method.
SARI
Tlah dilakukan percobaan untuk mencari kondisi optimum proses analisisasam amino
dergan komatograii cair kineda tinggi (KCKT) secaraderiyatisasiprakolom dan pascakolom.
Kondisi analisisoptirnuri untuk cara derivatisasi pascakolomdiperoleh dengan menggunalon resin penukar kation (R-SO; Na), larutan dapar sitrat pH 3,0 dan larutan daparborat
pH 9,? sebaSaifase gerak, serta O-ftalaldehila (OPA)/2flerkaptoetanol sebagaipenderivalisasinya.
Unluk c{n derivatisasiprakolom, sebaSaikolom digunakanResolvesphericalCl8, sebagai
fasegerak digunakan larutan A yang terdid dari metanol : THF : air (2:2: 96) yang mengndung 0p5 M Na2HPOa dan larutan B yang terdiri dari metanol : air (65 :35), sedangkan
sebaSai
zal penderivalisasidigunakanOPA/etantiol.
I Purat Penelitian Teknik Nuuir- BATAN, alumtri ITB

42

PROCEEDINGS
nB yol 20,No. l/2, 1987

Kedua metode KCKT ini rBsir8-masing dapat memisahkan 17 macam campuBn asam
amino. Diketahui bahwakepekaancaradrivatisasiprakolom lebih tinggi dan waktu analisisnya lebih cepat daripada cara derivatisasipascakolom,tetapi ca.rapnkolom tidak dapat menentukan asamamino sekunder.

PENDAIIULUAN
Asam amino adalah senyawayang mempunyai rumus umum +H3NCH - (R)
COO- , benifat ion dan hidrohl. Asam-asamamino salingberbedagugusR-nyii.
Ada sekitar 20 macam asamamino penting yang merupakanpembentuk prG
tein dan disebut asam amino hidrolisat, seperti Alanin (Ala), Arginin (Arg),
Sistein (Sis),Glutamin (Gln), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Histidin (His),
Iso leusin (Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin(Phe), Prolin (Pro),
Serin (Ser),Treonin (Thr), Triptofan (Trp), Tirosin (Tyr), dan Valin (Val).
Analisis asam amino ini sangat diperlukan, misalnyauntuk mengaralisishasil
industri seperti makaran, makanan temak, obat-obatan,juga untuk analisis
caira:rbiologi dan hidrolisat protein.
Cara a-nalisisasam amino yang masih lazim digunakansampaisaat ini adalah
kronratografi denganb!'rbageinracanrteknik scpcrti kromatogratikertas,lapise n t i p i s , d a r rk o l o i r . K r o n l l r t i j g f : r tkl o l o n r l c b i h b a n y : k , - l i k c n t ' . ; . t i i g kh:ar r, c i - , : i
selain dapat digunakanuntuk kcpcrluan kualitatifjuga dapi.ltuntLrkkeperluair
kuantitatif dan prcparatif. Akan tetapi pada kromatografi kolont biasa(open
column), diperlukan waktu yang lama untuk memisahkanasam amino secara
sempuma. Karena itu perlu ada metode analisisyang dapat memisahkanasam
amino tersebut secarasempurna dalam waktu singkat dengan hasil yang tepat
dan teliti.
Analisisasamamino dengankromatograhcair yang menggunakanresinpenukar
kation sebagaifase diam, pertama kali dikembangkanoleh Williem Stein dkk.
(8) pada tahun 1951, yarg kernudian dikembangkanbenama Sparknran(8)
menjadi sistenryang otomatis pada tahuD I958. Akar tetapi metode ini masih
sangat rumit, biayanya mahal, dan peralatannyakurang dapat disesuaikan
dengan keadaan. Akhir-akhir ini kromatografi cair dengan kinerja tinggi (fligft
PerJormanceLiquid Chromatography)banyak digunakanuntuk analisisasam
anino. Metode ini ditunjang oleh peralatanyang baik dan modcnl, menggunakan kolom yang sangatefisien dan di bawah tekananyang besar,;:hingga ana,lisis asam amino dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan
hasil yang tepat dan teliti. Percobaanini dilakukan oleh Pfeiferdkk. pada tahun
I 983 (7).
Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor ultra-lembayung,
sinar tampak. atau detektor fluoresensi. Dalam hal ini asam amiro harus

43

PROCEEDINGSNB T/OL20, NO. 1/2, 1987

diderivatisasi terlebih dahulu supaya dapat membentuk derivat yang dapat

menyerap cahaya UV, tampak, atar.l berfluoresensi. Senyawa yang banyak
digunakan untuk tujuan ini adalah o-ftalaldehida (Qptr)/etantiol (ETSH),
dan OPA/2-merkaptoetanol(2-ME). Pereaksiini dengan asam amino dapat
membentuk derivat iso-indolyang berfluoresensi
kuat, sehinggadapat terdeteksi oleh detektor fluoresensi.
Ada I macam cara derivatisasi, yaitu derivatisasi pascakolom dan derivatisasi
prakolom (4. 5, 6). Pada cara derivatisasipascakolom,mekanismepemisahan
asamamino adalah tegadinya penukaranion antara gugusamino yang terprotonasi denganion Na+ dari resin penukar kation (R SO3-Na+) pada pH ren,
dah.
Bila pH fase gerak dinaikkan secaragradien kontinu, protonasi asam amino akan
berkurang, yang menyebabkan asam amino akan terelusi berturut-turut sesuai
denganderajat protonasinya,dan hal ini berkaitandenganpH isoelektrikasam
anlino tersebut.Asanr anrino yang mempunyai pH isoelektrikrendahakan terelusilebih dahulu (4, 5, 6).
Dalam teknik derivatisasi prakolom, ttekanisme pemisahan adalah partisi dengan sistem kromatografi fase balik (reverse phase chrcmatoglaphy). Asam
sii,rr,v

prrr,r\

jclord

spsslrrn

udrr

r!,r!A!rr

uwr1E,.ur \_/r rt/:,_rvr[

aLdu

OPA/ETSH. Terbelrtuk suatu derivat yang selainberfluoresensikuat juga bersitat hidrofob yang memungkinkan tedadinyapemisahansecarakromatograti
fase balik menggunakankolom nonpolar dan fase gerak yang polar (4, 5, 6).
Asam amino terderivatisasiyang rlempunyai kepolaran tinggi akan terelusi
lebih dahulu. Dalam percobaanini dicari kondisi pemisahanyang baik dengan
menggunakankedua metode di atas, dan dicoba menganalisisasamamino dari
beberapacuplikan sepertimakanar temak, bir, dan berem.

BAHANDAN TATA KE RJA

Bohan dan perolaton
Bahar terdiri atas asam amino baku fr.ratan Sigma, BRIJ 30 (Polyoxy ethylene
lauryl ether) buatan Pierce, natrium sitrat, asam borat buatan Univar, Ajax
chemical,2-merkaptoetanol (Sigma), oftalaldehida (Pierce),dan pereaksiyang
lain buatan E. Merck. Semua pereaksi yang digunakan mempunyai tingkat
kemumian pro anaLisis.
Selainitu digunakal _iugaplasmatikus. ntakananayam.
dan bir. Air yang digunakanadalahair yang telah dilewatkanMilli Q system.
Peralatanyang digunakan adalah KCKT (Waten, Model 244) yang dilengkapi
dengandetektor fluoresensi(Model 420-AC, eksitasi= 334 nm, dan emisi =
425 mm), Autotrwted Gradient Contrcller (Waten, Model 680), Data Modul
(Waten, Model '13O).Amino Acid Analysis ColumnrM (Waten), ResolverM
5p SphericalCts (3,9 mm I.D x 15 cm) Radial Pak p Bondapak Cls (8 mm
I.D x l0 cm) dari Waters,alat vakum, oven, dan lampu infra merah.

44

PROCEEDINGS
NB VoL20,No,1/2, ]987

Tata keria
a Penyedidanlarutan baku
Asam amino baku ditimbang masing-masing25 mg, kemudian dilarutkan dalam
HCI 0,01 M (tirosin dilarutkan dalam dapar fosfat pH = 7,0) sampai volume
mencapai 25 ml. Dari masing-masinglarutan diambil sejumlah volume tertentu,
kemudian diencerkandenganHCI 0,01 M sampai kadar asamamino 50 nmol/
ml untuk cara derivatisasipascakolomdan 0,5 nmol/ml untuk cara derivatisasi
prakolom. Sebelum dbuntikkan, senrua larutan disarirg dengan penyaring milipore ukuran 0,45 gm.
b Penyediaot cuplikan
Untuk analisis asam amino dari makanan temak, cuplikan harus dihidrolisis
dahulu dengan cara sebagaiberikut: Makanan ayarn ditimbang 10-15 mg,
ditambalkan 25 nl HCI 6 N,lalu dimasukkanke dalam tabung hidrolisis.Cairan dalam tabung dibekukan dengannitrogen cair atau CO2 padat (es kenng),
lalu tabung divakumkan, dan setelahvakum, ditutup kedap. Selanjutnya,tabung dipanaskan di dalam oven pada suhu I l0"C selama 6 jam, lalu didinginkan. Setelah itu HCI dihilangkan denganpenguapandi bawah sinar inframerah.
Residu yang mengardungasam amino dilarutkan dalam HCI 0,01 M, dan untuk melarutkan tirosinnya digunakan dapar fosfat pH 7,0. Ahhimya larutan
disaringdenganpenyaringmilipore ukurar 0,45 grn.
c Perryediaanlarutan dapar
I Larutad dapar sitrat dibuat denganmelarutkan 19,6 g natrium sitrat dalam
air. pH diatur dengan larutan HCI 6 N sampaimencapai3,0; volume akhir I
liter.
2 Larutar dapar borat untuk fasegerak
Ke dalam 800 ml air dilarutkan 2,5 g asamborat dan 14,6 g NaCl. pH diatur
denganlarutan NaOH 6 N sampai9,7; volume akhir I liter.
3 Larutan sediaandapar borat
Ditinrbarg 48 g asamborat, kemudiandilamtkan dalam 1800 ml air dan ditambah 30 g KOH. pH larutan diatur sampai10,4 dengank. .trn KOH 6 N, volume
akhir 2 liter.
Semua larutan dapar tenebut kemudian disaring dengan penyaring milipore
ukuran 0,45 /um dan diawagaskan(dihilangkangas yrr 6 Lsrl "',t di dalamnya)
denganalat Utasortic batft;pH ditentukan kembaLisebelumdipax i.
d Pembuatan larutan hipo kloit
Larutan sediaan dapar borat diambil 500 ml, ditambah 1 ml larutan I a-hipoklorit 0,5%, kemudian diawagaskan.

ITR VoL20,Na 1/2, 1987

PROCEEDINGS

45

e Pembuatanlarutan OPA (o-ftalaldehida)

Larutansediaandaparborat diambil 500 ml, lalu ditambah0,2 ml larutan3O7o
BRIJ 30 dalamair. Di dalamgelaspiala kecil ditimbang350 mg OPA dan dilarutkan dalam l0 ml metanol. Kemudian ditambahkan2 ml 2-merkaptoetanol/etantiol;dilakukan di dalam ruang asam.Larutan OPA-merkaptoetanol
Larutan ini
ini ditambahkanke dalam larutan borat, kemudian diawagaskan.
akanlebih stabil bila disimpandi bawahnitrogen.
f Pembuatan
fasegemkA untuk teknik deritatisasiprakolom
Dibuat campuranlarutanmetanol: TIIF (tetrahidrofuran):ah (2 : 2 : 96) yang
mengandung
0,05 M Na2HPO4dan 0,05 M Na-asetat.pH larutandiatur sampai
7,5 denganmenggunakan
asamasetat.Kemudianlarutandisaringdan diawagaskan.
g Pembuatanlarutanpendeivatisasiuntuk caradeitatisasi prakolom
DitimbangOPA 50 rng,dilarutkandalam4,5 ml etanol,dan ditambahkan50 trrl
2-merkaptoetanol
atau etantiol serta0,5 ml larutandaparborat.
h Deivatisdsiasamamino baku dan cuplikan
Larutanasanlanino 250p1 ditambah250pllanttardaparboratdan l00gl
larutan OPA/merkaptoetanol.Kemudian larutan diencerkal sampaivolume
I ml denganmetanol,dan dibiarkanbereaksipadasuhukamarselama5 menit.
i Cleanup cuplikandengan:SEP-PAKCB cattidge
Larutanyangdibuatadalah:
LarutanI :0,1%TFA (asamtrifluoro asetat)dalamair;
Larutan2:0,1%TFAdalamair: metanol= 80: 20i
Larutan3 : O,I%TFA dalamair : metanol= 70 : 20.
SEP-PAKC18yang baru, diaktifkan dua kali denganl0 ml metanol,kemudian
dicucidua kali denganl0 ml larutan1. Setelahitu cucilagisatukali denganl0
ml larutan2.
Larutancuplikan sebanyakI ml dicampurdengan2 ml larutan3 (larutanharus
larut dalamair atauasamdan bebasdari partikel).
Cuplikandilewatkanmelalui SEP-PAKC1scartridge.Eluat pertama1 ml dan 2
ml, eluatberikutnyayangmengandung
asamaminoditampung.
HASILDANPEMBAHASAN
Dalam analisisasam amino dengan cara derivatisasipascakolom,derivatisasi
denganOPA/2-merkaptotanoldilakukan setelahasamamino keluar dari kolom dan telah tedadi pemishhan.Karenaitu, sebelummasukke dalamkolom,
asamamino tersebutberadadalambentuk ion, sehinggamekanismepemisahan
yangcocok adalahpenukaranion denganmenggunakan
kolom penukarkation
(R-S03-Na+ ).

46

PROCEEDINGSITB Vol 20, No. 1/2. 1987

Dalam hal ini, pemisahandan elusi asamamino didasarkanpadaperbedaanpI

(pH isoelektrik) asamamino tenebut dan pengaturanpH fasegeraknya.Pada
pH yang rendah(= 3,0) asamaminoberadadalambentuk terprotonasi,sehingga dapat terikat denganresin penukarkation (R SO3-) menggantikanke{u-'
dukan Na*. Bila pH dinaikkansecaragradien(berangsur-angsur
dengantetap),
maka setelahpI di lewati, gugusNI{3r dari asamamino tersebutakanberubah
menjadi gugusNH2 yang menyebabkanterlepasnyaasamamino dari resindan
terelusi.Makin kecil pI, asamamino makin cepat terelusi.Asam amino yang
mempunyai pI yang samaakan terpisahberdasarkanperbedaanukuran molekul, karena selain mempunyaisifat menukarkanion, resin yang digunakan
juga mempunyaisifat molecularsieve(7,8).

pada
pH rendah

SO. - Na'

Resin

lil
t
H a N +- L - n

cooH
)

SO. -H^+

Besin

H
I
N-C-R
I

+ Na+

cooH

paoa
pH tinggi

Resin

\TF S O - - N a /

H^N-C-R

Joo

Padapemisahanasamamino denganmekanismepemisahanion, pH memegang

peranan penting. Pengaturan pH ini dilakukan dengan mengatur komposisi
(perbandinganvolume) dapar sitrat (pH = 3,0) dan dapar borat (pH = 9.8) secara gradienkontinu, yang didasarkanpada kurva titrasi dapar sitrat dan dapar
borat sepertiterterapada gambar l.
Untuk menyempumakan pemisahan asam amino yang keluar terlebih dahulu
seperti treonin dan serin, perlu ditanrbahkar metanol pada daparsitral. Hal ini
disebabkanUeonin dan serin mempunyai pl dan ukuran molekul yang hampir
samatetapi kelarutandalammetanol berbeda(7).
Mekanisme derivatisasi asam amino dengan o-ftalaldehida (OPA)/2-merkaptoetanol atau etanol/etantroladalahsebagaiberikut (7).

l'

r
1,.

47

PROCEEDINGS
NB VOL20,NO.I12, 1987
2ME
- H

H S - C H 2- C H 2 - O H

-H

H 2 N- C H - C O O H

o
OPA

1" asamamino
N-CH-COOH
R
derivatisoindol
berfluoresensi
kuat dan bersitathidrofil

1m
%B
,l.90

180
70
60
50
40
30
20
10

3456789
Grn$.r 1 KurvatitrasidariNa-sitrat{A} denganNaSorat(B)

48

PROCEEDINGS ITB VoL 20, No. ]/2, 1987

OPA dan 2-merkaptoetanol atau OPA dan ESTH akan bereaksi secaraspesifrk
dan selektif dengan asam amino primer membentuk derivat isoindol yang
berfluoresensi yang relatif sangat peka. Karena OPA/2-merkaptoetanol (ME)
atau OPA/ESTH hanya dapat bereaksidengan asam amiro primer saja, maka
asam amino sekunder seperti prolin dan hidroksi prolin harus dioksidasi dahulu
menjadi asam amino primer denganmenggunakanasamhipoklorit (HCLO).
Dari gambar 2 terlihat bahwa sekitar l8 macam asamamino dapat terpisah dengan sempurna dengan rnengg.rnakan KCKT secara derivatisasi pascakolom,
yang pemisahannyadidasarkan pada kromatografi penukaran ion. Untuk memisahkan asam amino tenebut hanva dioerlukan waktu kira-kira 85 menit- waktu

I
I

85 menit
Gambar 2 Kromatogram yang diperolehdenganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi
pascakolom
dari 0,25 nmol asamamino
Kondisi pemisahaountuk Eambar2
Kolom
: Amino Acid Analysiscolum-TM.Resinpenukarkation (SO3-Na+)
Fasegerak : A DaparsitratpH = 3,0
B Oaparborat pH = 9,8

49

PROCEEDINCSIT8 Vot. 20, No. 1/2, 1987

Kondisielusi gradien

kec. aliran
(ml/min)

0,4
o,4
o,4

Volumesuntikan :
Detektor
:

awal

4A
71
72

A (%)

B {%)

100

0
100
100
0

o
0
100

kurua

10gl
Fluoresensi
l\tlodel420
E m i s i: 4 2 5 n m
Eksitasi: 338 nm
A t e n u a s:i4 x

yang relatif singkat dibandingkandenganrnetodelain. Di sampingitu terlihat

bahwaprolin yang menrpakan asam amino sekunderdapat terdeteksi.Dengan
demikian cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisis
asamamino, baik asamamino primer maupun sekunder.
Pada cara derivatisasiprakolom, derivatisasidilakukan sebelum asam amino
tenebut masuk ke dalam kolom, sehinggabentuk isoindolnya yang hidrofil
dapat drpisahkan.karena perbedaanderivat dari asan amino tersebut terletak
pada bagian nonpolamya. Karena itu cara yang cocok untuk memisahkannya
adalahkromatografi fase balik.
Dalamhal ini mekanismepemisahannyaadalahpartisi yang elusinyadidasarkan
pada kehidrofilan derivat asam amitronya serta pengaturan kepolaran fase geraknya. Derivat asam amino yang bersifat hidrofil akan tertahan lebih lama
pada kolom yang bersifat nonpolar, sehingga asam amino yang paling polar
akan terelusi paling dahulu. Dengan menggunakancara ini diperlukan waktu
beberapalarna (tergantungpada lamanyapemisahanoleh kolom) dari saatderivatisasisarnpaiderivat asanlanrino tersebut dideteksi.Dengandemikiiurdiperlukan zat peraksiyang dapat membentlrk derivatasamamino yang stabil dalani
selangwaktu tersebut.
Dari percobaandiperoJih data seperti terlihat padagambar3. Gambartersebut
menunjukkan bahwa derivat asam amino-OPA/ESTH lebih stabil daripada
derivat asam arninoOPA/2-ME. Karena itu pereakSiyang dipilih untrlk cara
prakolonradalahOPA/ESTH.
derivatisasi
Di samping itu temyata derivatisasiprakolom ini hanya djgunakan untuk
menganalisis
asamamino primer, karenaOPA/ESTH ataupunOPA/2-ME hanya
dapatbereaksidenganasantamino primer saja.Di sini tidak mungkin dilakukan

50

PROCEEDINGS
ITB VoL20,No. 1/2. 1987

Rispons

1I
'-.-, derivat glisin- OPA,/ETSH
d e r i v a tg l i s i n' O P A / 2 - M E

4 5 6 7 8 I

l0 11

1 4 1 51 61 7 l 8 1 9
_)
t {jam)

Gambar3 Kestabilan
derivatglisin-OPA/ETSHdan glisin- OPA/2 ME terhadapwaktu
dengankondisi kolom
; ResolveTM 5p Cr"
fasegerak : 5OmM Na3POa,pH 7,2/CH:CN{70/3O)
detektor
: Fluoresensi
eksitasi : 338 nm
emisi : 425 nm
vol, suntikan: 10 l.d
oksidasi asam andno sekunder menjadi asam amino primer sebelum melalui
kolom. Bila oksidasi ini dilakukan, dapat tedadi kerusakan pada kemasan
kolom, yaitu pecahnya ikatan antara fase diam (C18) dengan pendukung padat-

nya.
Dari data yang terlihat pada gamba.r4 temyata sekitar 17 asarnamino dapat
terpisahdalam waktu sekitar 30 menit, bahkansepertiterlihat padagambar5
hanya23menit,danyangterdeteksi
hanyaasamaminoprimersaja.
Dengankadar asamamino sekitar 50 pmol, responsyang diberikansudahcukup tinggi. Karena itu caraderivatisasiprakolom ini lebih peka dibandingkan
dengancaraderivatisasipascakolom.Dari hasil percobaanterlihat bahwasalah
pascasatu faktor penyebabnya
ialahpenggunaan
HCIOdalamcaraderivatisasi
kolom yang temyata dapat menurunkankepekaan,karenadapat terbentuk
derivatlain yangkekuatanfluoresensinya
kurang.
Untuk menganalisisasam amino dalam makananternak ternyata harus dilakukan hidrolisis terlebih dahulu dengan HCI 6 N untuk memisah-kan
asam
amino dari proteinnya,sedangkan
untuk cuplikanbir dan berem,asam-asam
aminonyadapatlangsungdianalisis.
Padamakananternakditemukanbeberapa
macamasamamino,antaralail: asamaspartat,treonin,serin,asanlglutamat,
prolir, glisin,alanin,valin, isoleusin,leusin,fenilalanin,histidin, triptofan, lisin,
dan arginin.Prolin dan triptofan dapatdideteksihanyadengancaraderivatisasi

51

PROCEEDINGSITB Vol.20,No. I/2, 1987

It

/1
il

:
It

Gambar 4 Kromatogram yang diperoleh denganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi

prakolomdari 5Opmol asamamino baku

Kondisi pemisahanuntuk gambar4

Kolom
Fasegerak

:
:

ResolveTM
5/-rCl8
Kondisigradien
P e l a r uA
t ; M e O H : T H F : H r O = 2 : 2 : 9 6 , y a n gm e n g a n d u n0g, 0 5 M
Na, HPO4dan 0.05 M Na-asetat;
pH diatur sampai7,5 denganasamasetat.
P e l a r uB
t : M e O H: H " O = 6 5 : 3 5

52

PROCEEDINCSnBVoL20, No. 112. 1987

Waktu
(m.nit)

Aliran
(ml/r|gnir)

%A

%B

Kurva

Awal
2,@
2,W
14,00
23.00
28,00
35,@

0
0,10
r.50
1,50
1,50
1,50
0

100
100
r00
50
0
100
100

0
0
0
50
100
0
0

01
06
07
07
ll
ll

Detektor tt4odel420 AC FluorecenceDerektor. g'

Catrtln:
Padakromatogram dalam gambar 4 tidak ditemukan prolin (asa.namino sekunder).
karena
derivatisasi
hanyamungkinterjadiuntuk asamaminoprimersaja,Di sampingitu oleh karena
di sini tidak digunakanhipokrorit,makakepekaannya
akanrebihtinggidibandingkan
dengan
caraderivatisasipascakolom.

pascakolom.Padamakanantemak ini tidak ditemukanasparagin.

Hal ini mungkin disebabkanadanyadeaminasipadasaathidrolisismenladiasamaspartat(Z)
atau memangproteinnyii tidak mengandungasparagin.Denganmenggunakan
caradi atas,tanpamelakukanhidrolisissebelumnya,
dalamcuplikanbir dike_
temukan juga beberapamacamasamamino seperti asamaspartat,asamgiu_
tamat, asparagin,serin,histidin, glisin,treonin,arginin,tirosin,metionin,valin,
isoleusin,leusin, dan prolin seperti terlihat padagambar6 dan 10. Demikian
pula pada cuplikan berem denganmenggunakan
caraderivatisasipascakolom,
tanpa hidrolisis sebelumnyadapat dideteksiadanyaasamamino sepertiasam
aspartat, treonin, serin, asam glutamat, prolin. glis.in,alanin, sistein, valin,
metionin, isoleusin, leusin,tirosin, fenil alanin, histidin, dan arginin, sperti
terlihat padagambar8.
Dalam bir ditemukan asparaginkarenatidak dilakukanhidrolisisdenganHCI
6 N sebelumanalisis,sehingga
asparaginnya
masihutuh, tidak mengalamideaminasi. Asparagin dan glutamin umumnya ditemukan pada cuplikan asam
protein secaraenzimatis(7).
aminoyang diperolehdenganmenghidrolisis
pH dan
KCKT ini, pengendalian
Dalam pemisahanasamamino menggunakan
kepolaranfasegerakmudahdilakukandenganmengubahperbandilganvolume
2 larutan dapar atau fasegerakyang dapat diatur dengarsistemgradienkontinu (bukan gradien bertahap),sehinggatidak mengganggu
bentuk kromatogram.Dengandemikian dalam analisiskuantitatif,perhitunganluas puncak
pereaksiOPA/2kromatogrammenjadilebih teliti. Demikianpula penggunaan

53

PROCEEDINGS
ITB VoI.20;No. 1/2, T987

ME dan OPA/ESTH menyebabkan metode ini mempunyai kepekaan yang lebih

tinggi dan oleh karena reaksinya denganasa:namino spesifik dan selektif, maka
metodeini tidak banyak dipengaruhioleh gargguanmatriks.

23 menit
q,

Gamblr 5 Kromatogramyangdiperolehdenganmenggunakan
alat KCKT secaraderiyatisasi
prakolomdari 50 omol asamamino baku

Konditi pmirahanuntuk gambar5

Kolom
: ResolveTM
5t c18
Fase
g e r a k : A : M e O H : T H F : H 2 O , 2 : 2 , 9 6 , y a n gm e n g a n d u 0n ,g0 5M N a 2 H P O 4
pH diaturdenganasamasetatsampai7.5.
dan 0,05 M Na-asetat;
B : MeOH : H"O. 65 : 35

54

PRoCEEDINGS
ITB VoL20, No. 1/2, 1987

K o n d i sei l u s g
i radien:
t (menit)

kec. aliran
(ml/min)

A (%)

awal

2,OO
2,OO
2,OO
2,@
2,OO
2,W
1,00
0.50
0,10

95
90
70
70
65
100
100
100
100

t5

20
25
30
35
40
45
Volumesuntikan :
Detektor
:

10 = l
Fluoresen'4x
E m i s i 4, 2 5 n m
Eksitasi338 nm

B (%)

kurna

10
30
30

o
o

6
o

o
0
0
0

6
6
6
o

rFF^''

iil

z
!

c
U)

Gambar6 Kromatogramdari cuplikanbir dengankondisiyangsamadengangambar2 secara

derivatisasi
kolom
Dasca

>1

o-,a

)
>:

i'i
2
ts;
85 menit

:
Gambar7 Kromatogramdari cuplikanmakananternakdengankondisiyangsamadengan
gambar2, secaraderivatisasi
pascakolom

PR0CEEDINGSrTB Vot. 20, No. I

/2, js8Z

a r_-_____

85 menit ___

Gambar8 Kromatogram
dari cuplikanberemdengan.unggunik"n
kondisiKCKT yang
samadengangambar2, secara
derivatisasi
pascakolom
J

TJJ
I
I
J

o
ILI
ii

re

rl
i

't,

i\..---.---._;
r [-__________...

vt-i

30 menit
c

Gambar9 Kromatogramdari cuplikanmakanan

ternakyangdiperoleh
- derrgan
'
menggunakan
KCKT secaraderivarisasiprakotom (kondisi ,urna
a"ng"n g";,U;, ai

z
a.l

32 menit
Gambar 10 Kromatogramdari cuplikan bir yang diperoleh denganmerEgunakanKCKT
secaraderivatisasiprakolom (kondisi samadengangambar4)

PROCEEDINGS
nB VoI 20, No. I /2, 1987

59

KESIMPULAN
Analisis asam anrino dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) dengan menggunakano-ftalaldehida/etantiolsebagaizat penderivatisasi, m:mpunyai beberapa keunggulan, yaitu: daya pisahnya tinggi karena
menggunakankolom yang sangatefisien,sertaditurdangoleh penggunaanperalatan yang baik; kepekaan tinggi, sehinggadapat digunakan untuk menganalisis
asm-asam amino dengan kadar yang rendah;waktu analisisnyasingkat, serta
tidak banyak dipengaruhi oleh matrils; pengendalianpH dan kepolaran fase
gerakmudah diatur denganmenggunakansistemgradienkontinu.
Derivatisasi asam amino dapat dilakukan dengan cara derivatisasi pascakolom
dan derivatisasiprakolom.
Cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisisasam amino
primer maupun asam amino sekunder, sedangkanderivatisasi prakolom hanya
dapat digunakan untuk menganalisis asam amino primer saja. Akan tetapi
saat ini cara derivatisasi pascakolom memerlukan waktu pemisahan yang lebih
lama dan kepekaannya relatif lebih rendah dibandingkan cara derivatiiasi
prakolom.

DAFTARPUSTAKA
Anderson,e/ d/., Remington's phanraceuticalssdence,lSth ed.1975.
Amino Acid Analysis System, Operator's Manual, Waters, The Liquid Chrom a t o g r a p h yp e o p l e .
Amino Acid Analysis, Liquid ChromatographyColumn, Care and Use Manual,
Waters,The Liquid ChromatographyPeople,Millipore.
Hill D., L. Burnworth, W. Shea and R. Preifer,Quantitative HPLC Analysisof
Plasma Amino Acids as o-Phtalaldehyde/ethanthiol Deivatives, J. Liq.
Chromatog.,5(12), ?369 - 93 (1982).
Hill D.. et al., Hieh PerformanceLiquid ChromatographyDetermination of
A m i n o A c i d s i n t h e P i c o m o l eR a n g eA
, n a l . C h e n . , 5 l , 1 3 3 8 ( 19 7 9 ) .
Pfeifer R. , ct a/., PracticalAppiication of HPLC to Amino Acid Analysis,lrrerican Laboratory',March, I 983.
S p a c k m a nD . H . , W . H . S t e i n ,a n d S . M o o r e , , 4 n a lA
. e m . , 3 O ,I 1 9 0 , 1 9 5 8 .
Wheler G. H. T. and J. T. Russel,Separationand Quantitation of oPhtalaldehyde DerivativesofTaurine and RelatedCompound in a High Performance Liq uid Chromatography (HPLC) System, J. Liq. Chromatog.. 4(7),

l 2 8 r - 1 2 9 1( l 9 8 1 ) .